CN101381766A

CN101381766A - 一种基因稀有突变的定量检测方法

Info

Publication number: CN101381766A
Application number: CNA200810071202XA
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 郭奇伟; 阮力; 胡思玉
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2008-06-11
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2028-06-11
Also published as: CN101381766B

Abstract

一种基因稀有突变的定量检测方法，涉及一种基因的检测方法，尤其是涉及一种基因稀有突变的定量检测方法。提供一种基因稀有突变的定量检测方法。1)根据需要定量检测的基因稀有突变，设计并制备相应的引物序列，引物的3’末端为突变位点特异核苷酸，除了最后一位核苷酸，其余序列均可通过商业合成，最后一位核苷酸为修饰核苷酸，使引物在常规PCR反应中无法延伸，修饰核苷酸添加至引物末端；2)在含有特定DNA聚合酶和焦磷酸的反应体系中，采用步骤1)设计并制备的引物对待定量检测的基因稀有突变进行扩增，并利用实时荧光PCR仪进行定量检测；2)通过分析实时荧光PCR仪所记录的扩增曲线，即可获得基因稀有突变的定量检测信息。

Description

一种基因稀有突变的定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种基因的检测方法，尤其是涉及一种基因稀有突变的定量检测方法。

背景技术

稀有突变指的是存在于大量野生型DNA序列背景下的相对稀少的突变型DNA序列，例如肿瘤病人血液中含有的少量肿瘤突变基因DNA，治疗后癌症病人血液中残余的少量肿瘤突变DNA，孕妇血液中含有的少量胎儿DNA，初期出现的细菌或者病毒的耐药突变等等，都属于稀有突变的范畴，狭义的稀有突变一般指点突变。上述突变常常与疾病相关，或者是某个疾病发病的直接原因，或者是某种疾病发病的早期征兆或重要的生物标志物。因此，稀有突变与人类健康关系十分密切，对稀有突变的检测在无创产前诊断、疾病早期筛查以及疾病预后及治疗评价等方面具有十分积极的意义。

检测突变的方法已经很多，但是多数已报道的方法只限于定性检测突变，而无法进行精确的定量检测，尤其定量检测稀有突变的方法更为罕见。

判断一个突变检测方法的优劣主要包括：灵敏度、特异性、简便程度和定量检测能力。灵敏度指的是在大量野生DNA背景下能够检测的最少突变DNA的量(即可检出的稀有突变基因与野生型基因比率的最小值)，特异性指的是准确地检测出稀有突变(不造成假阳性)。

按照上述参数，就不难看出目前突变检测方法存在的问题。

测序技术被公认是检测基因突变的“金标准”，虽能提供大量序列信息，但灵敏度低，只能检测突变序列含量在20％以上的样品，无法用于临床样品中突变含量低于1/100的稀有突变的检测。

相对测序而言，建立在DNA构象改变基础上突变检测技术灵敏度获得进一步提高，如各类电泳技术、变性高效液相色谱(LiuW，Smith DI，et al，Nucleic Acids Res，1998，26：1396-1400)乃至最新出现的高分辨熔解分析(Wittwer CT，Reed GH，et al，Clin Chem，2003，49：853-860)等，但是其灵敏度很难超过1％或者0.5％，另外其特异性很难达到100％。而像限制酶切片段长度多态性结合PCR的方法，虽然灵敏度和特异性都可以大幅度提高，但是操作步骤多，周期长，也不具备定量检测能力。

近年来发展的数字PCR(Vogelstein B，Kinzler KW，PNAS。1999，96：9236-9241)以及BEAMing技术(Li M，Diehl F，et al，Nat Methods，2006，3：95-97)，灵敏度和特异性都得以大幅度提高，并且具备定量检测能力，但是两种方法均操作烦琐，步骤多，很难满足临床要求。

焦磷酸水解催化的聚合反应(简称PAP)技术(Liu Q，Sommer SS，Biotechniques 2000，29：1072-1076，1078，1080)是一种新的稀有突变检测技术(美国专利，US11/772,622)。与普通PCR相比，PAP技术使用3末端封闭的引物，利用Taq聚合酶的焦磷酸水解活性和聚合活性进行扩增，焦磷酸水解活性的特异性和聚合酶活性本身的特异性相互叠加形成了PAP反应无可比拟的高特异性。虽然PAP可以用于稀有突变的检测，但是采用电泳的检测模式，注定了该技术无法用于突变的精确定量。

突变定性检测存在以下一些缺点：(1)因其无法对样品进行定量分析和比较，并且稀有突变序列所占比例极低，当检测样品的浓度太低时，可能因不包含突变基因而造成假阴性的检测结果。(2)因其无法对样品进行定量分析和比较，可能由于基因组存在自发随机突变的情况而产生假阳性的检测结果。而定量分析则解决了这些问题。

相反，定量分析可以：(1)通过标准品对检测样品的数量进行测定，以确保样品在一定数量级上，避免因样品数量太少造成的假阴性结果。(2)通过标准品确定一个阈值，用以区分自发随机突变和稀有突变，避免了假阳性结果的产生。

不仅如此，PAP的定性检测采用电泳分析结果的方法不仅需要较长的时间和较大的劳动强度，而且PCR产物的后处理很容易导致样品间的交叉污染，这对于稀有突变检测来说是致命的。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因稀有突变的定量检测方法，其技术方案是采用在反应过程中掺入核酸染料，采用荧光标记的双链引物，采用单链荧光自淬灭引物或采用荧光探针，实现实时PAP。

本发明的另一目的是提供实现多重实时PAP检测的方法，并用于突变的多重定量检测，其技术方案是使用多重荧光标记的双链引物，使用多重荧光标记的单链荧光自淬灭引物或使用多重荧光标记的探针，实现多重实时PAP。

本发明包括以下步骤：

1)根据需要定量检测的基因稀有突变，设计并制备相应的引物序列，引物的3’末端为突变位点特异核苷酸，除了最后一位核苷酸，其余序列均可通过商业合成，最后一位核苷酸为修饰核苷酸，使引物在常规PCR反应中无法延伸，修饰核苷酸添加至引物末端；

2)在含有特定DNA聚合酶和焦磷酸的反应体系中，采用步骤1)设计并制备的引物对待定量检测的基因稀有突变进行扩增，并利用实时荧光PCR仪进行定量检测；

3)通过分析实时荧光PCR仪所记录的扩增曲线，即可获得基因稀有突变的定量检测信息。

修饰核苷酸可选用ddNTP或其它核苷酸类似物，修饰核苷酸可由末端转移酶添加等方式添加至引物末端。

利用实时荧光PCR仪进行定量检测的方法可采用染料嵌入法、双链引物法、单链荧光自淬灭引物法或荧光探针法等，并且包括单重荧光定量与多重荧光定量。所述采用染料嵌入法是指利用核酸染料指示扩增。所述采用双链引物法是指采用荧光标记的双链引物指示扩增。所述末端自淬灭引物法是指采用单链荧光自淬灭引物的荧光标记指示扩增。所述的荧光探针法是指利用荧光标记的核酸探针与模板杂交指示扩增。所述的上述方法应用于多重检测是指采用不同荧光标记在同一反应管内指示不同模板的扩增。

本发明在PAP的实验条件下，可以通过特定的方式实现PAP的实时检测，从而建立了实时PAP技术，实现了极为简便的突变定量检测，。进一步地又建立了多重实时PAP技术，实现了突变的多重定量检测。实时PAP技术由于将扩增和检测合二为一，不需要任何后操作，有效杜绝了产物污染，尤其是卓越的定量能力，因此实时PAP技术十分适用于基因稀有突变的定量检测。

本发明的基本原理如下：

聚合酶链式反应(PCR)以一条与模板互补的引物介导，由Taq DNA聚合酶将dNMP不断地添加到引物的3’末端，从而使引物延伸，形成产物。引物的3’末端核苷酸序列与模板序列一般是匹配的，否则Taq酶将无法继续添加核苷酸，就无法产生扩增产物。因此，可以设计与突变型序列相同的引物，进行突变的PCR检测。理论上，当遇到突变型模板时，由于引物3’末端序列与模板是匹配的，因此可以产生扩增产物；而遇到野生型模板时，引物3’末端序列与模板是不匹配的，因此不会产生扩增产物。但是由于普通Taq酶的错配率大概为1/10⁵，又由于其他实验因素的影响，在实际PCR扩增中往往错配率高达1/10³，即针对突变型的引物在野生型模板数量高于1000个拷贝的情况下就会产生非特异扩增，从而无法区分扩增产物是源自何种基因型。这也是一些采用普通引物方法检测稀有突变能力有限的原因。

PAP技术利用的是此类聚合酶具有的另一个催化活性——焦磷酸水解活性。如图1所示，PAP技术所用引物不是普通引物，而是3’末端最后一个核苷酸被封闭的引物，如采用ddNMP等方法进行封闭。这样，在普通PCR反应体系中，这样的引物由于没有了3’末端的一个羟基，后续dNMP没有结合基团，因此是无法继续延伸的。而当体系中存在焦磷酸并且引物3’末端序列与模板是匹配的时候，聚合酶会催化焦磷酸与引物3’末端的ddNMP反应生成ddNTP脱落下来，从而使引物解除封闭，这个反应就叫焦磷酸水解反应。解除了封闭的引物就像普通引物一样仍可以发生聚合反应，又能够继续往下延伸，从而形成产物。而如果引物3’末端序列与模板是不匹配的，就不会发生焦磷酸水解反应，引物的封闭就无法解除，引物也就无法延伸，也就没有扩增产物，同理，引物二聚体也不会产生。PAP反应很好地偶联了聚合酶焦磷酸水解的特异性和聚合反应的特异性，理论上可以达到1/10¹¹的特异性，实验证明了其实际特异性可达到1/10⁹，即可从10⁹个拷贝的野生型模板中检测出1个拷贝突变型模板的存在。但是该项技术必须在PCR扩增之后，进行电泳分析。

本发明涉及稀有突变PAP实时定量检测，也涉及含有所述的PAP引物的实时检测试剂盒及所述的PAP引物和其试剂盒在实时检测靶核酸分子中的应用。

本发明所述的PAP实时定量检测方法，首先是使用核酸嵌入染料的实时定量PCR方法。核酸嵌入染料可以嵌入DNA双链中，但不与单链DNA结合。染料在游离存在时没有荧光信号产生，而当染料嵌入DNA双链后在激发光作用下即发射出可被检测的荧光。在PAP引物遇到匹配模板，并且存在焦磷酸的情况下，特殊的Taq酶促使PAP引物发生焦磷酸水解反应，PCR反应得以启动，PAP引物开始延伸和扩增，随着DNA扩增产物的积累，双链DNA越来越多，嵌入到染料也随之增多，发射出的荧光信号也越来越强，通过荧光PCR仪即可收集处理这些信号，以需要的方式输出即可获得样品的实时扩增曲线。由于扩增曲线的Ct值(荧光信号达到某个阈值时的循环数)与原始模板浓度成比例，因此可通过已知浓度的标准品做出标准曲线，从而对未知浓度的样品进行定量。此类核酸嵌入染料有SYBR Green I，Eva Green等。

本发明所述的PAP实时定量检测方法，也是使用荧光双链PAP引物的实时定量PCR方法。在扩增引物(又叫正引物)的5’末端标记荧光基团，3’末端采用ddNMP等方法进行核苷酸封闭；另外设计一条与正引物部分序列互补，3’末端标记淬灭基团的淬灭链。当正引物没有扩增的时候和淬灭链结合，荧光基团与淬灭基团的距离很短，荧光基团被淬灭，不产生荧光信号。而在正引物(PAP引物)遇到匹配模板，并且存在焦磷酸的情况下，特殊的Taq酶促使该引物发生焦磷酸水解反应，PCR反应得以启动，引物开始延伸和扩增，引物延伸成形成产物后，淬灭链被产物链取代，从而使荧光基团远离淬灭基团，产生荧光信号，通过荧光PCR仪即可收集处理这些信号，以需要的方式输出即可获得样品的实时扩增曲线。由于扩增曲线的Ct值(荧光信号达到某个阈值时的循环数)与原始模板浓度成比例，因此可通过已知浓度的标准品做出标准曲线，从而对未知浓度的样品进行定量。

本发明所述的PAP实时定量检测方法，也是使用单链荧光自淬灭PAP引物的实时定量PCR方法。在扩增引物的5’末端标记淬灭基团，3’末端采用带荧光基团的ddNMP进行核苷酸封闭；如果荧光本底过高，引物的3’端和5’端可以选择设计成含有4-8个互补碱基，引物自身可以形成茎环结构，使淬灭基团和荧光基团靠的更近，荧光本底更低。在引物遇到匹配模板，并且存在焦磷酸的情况下，特殊的Taq酶促使该引物发生焦磷酸水解反应，带有荧光基团的ddNTP随之被水解下来，从而使荧光基团远离淬灭基团，产生荧光信号，通过荧光PCR仪即可收集处理这些信号，以需要的方式输出即可获得样品的实时扩增曲线。由于扩增曲线的Ct值(荧光信号达到某个阈值时的循环数)与原始模板浓度成比例，因此可通过已知浓度的标准品做出标准曲线，从而对未知浓度的样品进行定量。

常用的荧光标记基团包括目前各种荧光标记物，如ALEX-350，FAM.，HEX，VIC，TET，JOE，TAMRA，ROX，TEXAS RED，CY3，CY5，CY5.5等。常用的淬灭基团包括目前各种淬灭剂如DABCYL、BHQ、ECLIPE等。

本发明所述的PAP实时定量检测方法，也是使用PAP引物-探针联合的实时定量PCR方法。PAP引物起到特异性扩增的作用，探针起到扩增产物指示作用。在PAP引物遇到匹配模板，并且存在焦磷酸的情况下，特殊的Taq酶促使PAP引物发生焦磷酸水解反应，PCR反应得以启动，PAP引物开始延伸和扩增，探针与之PCR产物杂交能产生荧光信号，随着DNA扩增产物的积累，探针与之杂交的愈来愈多，产生的荧光信号也越来越强，通过荧光PCR仪即可收集处理这些信号，以需要的方式输出即可获得样品的实时扩增曲线。由于扩增曲线的Ct值(荧光信号达到某个阈值时的循环数)与原始模板浓度成比例，因此可通过已知浓度的标准品做出标准曲线，从而对未知浓度的样品进行定量。

所述的核酸探针可以是目前用于实时PCR检测各类探针，如TaqMan探针，分子信标，改良分子信标，双链荧光置换探针，LightCycler探针等。

本发明所述的PAP实时定量检测方法，也是具有稀有突变多重定量检测能力的方法，是使用核酸嵌入染料的多重实时定量PCR方法。荧光核酸嵌入染料法。将对应不同基因型的PAP引物置于一个反应体系中。当模板中存在其中一种或几种基因型时即会发生焦磷酸水解反应并产生扩增，扩增过程用荧光嵌入染料指示。此方法只能指示模板中是否有需要检测的基因型，但并不能明确指示是何种基因型。

本发明所述的PAP实时定量检测方法，也是具有稀有突变多重定量检测能力的方法，是使用荧光双链PAP引物法的多重实时定量PCR方法。将针对不同基因型的双链PAP引物标记不同荧光基团，然后置于一个反应体系中。当模板中存在其中一种或几种基因型时相应的双链引物即会发生焦磷酸水解反应并产生扩增，就会产生相应的荧光信号。此方法不仅能指示模板中是否有需要检测的基因型，而且能明确指示是何种基因型。

本发明所述的PAP实时定量检测方法，也是具有稀有突变多重定量检测能力的方法，是使用单链荧光自淬灭PAP引物法的多重实时定量PCR方法。将针对不同基因型的单链荧光自淬灭PAP引物分别用带不同荧光基团的ddNMP进行3’末端封闭，然后置于同一个反应体系中。当模板中存在其中一种或几种基因型时相应的引物即会发生焦磷酸水解反应并产生扩增，就会产生相应的荧光信号。此方法不仅能指示模板中是否有需要检测的基因型，而且能明确指示是何种基因型。

本发明所述的PAP实时定量检测方法，也是具有稀有突变多重定量检测能力的方法，是使用联合探针的多重实时定量PCR方法。将针对不同基因型设计PAP引物和相应带不同荧光基团的指示探针，然后置于同一个反应体系中。当模板中存在其中一种或几种基因型时相应的引物即会发生焦磷酸水解反应并产生扩增，就会产生相应的荧光信号。此方法不仅能指示模板中是否有需要检测的基因型，而且能明确指示是何种基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1)将PAP技术与实时定量PCR技术相结合，即继承了PAP技术高灵敏度，高特异性的特点，又具备了核酸定量的功能，建立了稀有突变定量检测体系。

2)通过标准品的设定，可以很好地避免假阴性和假阳性结果的产生。

3)提供了多种PAP引物与实时PCR技术相结合方案，不仅可以进行单管单位点稀有突变的定量检测，而且单管多重多位点稀有突变同时定量检测，简便了操作，减少了试剂消耗。

4)该技术操作简便，可以实时观察结果，省时省力，无需PCR后处理，几乎不会造成PCR产物污染。

5)该技术灵敏度和特异性高。以检测K-ras突变为例，此稀有突变检测的选择性可以达到1:10,000。并且可以在相当宽的浓度范围之内对稀有突变进行精确的定量。

6)既适合于单个样品的检测，又适合于大量样品的筛查。

附图说明

图1为显示PAP引物在实时PCR中的工作原理。其中空心小圆圈代表荧光基团；实心小圆圈代表淬灭基团。星号代表ddNTP。A：变性；B：退火；C：焦磷酸水解；D：延伸；a：荧光基团；b：淬灭基团；c：野生型模板；d：突变型模板。

图2为模板总量为1ng/反应体系的定量扩增曲线。在图2中，横坐标为循环数(Cydenuber)，纵坐标为荧光值(Fluoresoence)。模板总量为1ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/5，1/10，1/20，1/50，1/100。

图3为模板总量为1ng/反应体系的线性定量曲线。在图3中，横坐标为突变模板百分比(Proportion ofmutant-type DNA)，纵坐标为Ct值(Ct value)。模板总量为1ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/5，1/10，1/20，1/50，1/100。

图4为模板总量为10ng/反应体系的定量扩增曲线。在图4中，横坐标为循环数(Cydenuber)，纵坐标为荧光值(Fluoresoence)。模板总量为10ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/10，1/20，1/100，1/200，1/1000。

图5为模板总量为10ng/反应体系的线性定量曲线。在图5中，横坐标为突变模板百分比(Proportion of mutant-type DNA)，纵坐标为Ct值(Ct value)。模板总量为10ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/10，1/20，1/100，1/200，1/1000。

图6为模板总量为100ng/反应体系和定量扩增曲线。在图6中，横坐标为循环数(Cydenuber)，纵坐标为荧光值(Fluoresoence)。模板总量为100ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/10，1/100，1/1000，1/2000，1/10000。

图7为模板总量为100ng/反应体系的线性定量曲线。在图7中，横坐标为突变模板百分比(Proportion of mutant-type DNA)，纵坐标为Ct值(Ct value)。模板总量为100ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/10，1/100，1/1000，1/2000，1/10000。

图2～图7显示在不同模板浓度中，以不同比例存在的突变型模板的扩增具有很好的线性关系，可以对实际标本中突变模板的含量进行精确的绝对定量。

图8为ARMS方法分别扩增用水和野生型模板稀释的突变型模板。当没有野生型模板存在时，此方法可以对突变型模板进行宽范围的定量，但当野生型模板存在时，定量曲线的线性关系即被破坏，使得定量范围大大缩小。在图8中，横坐标为稀释梯度(Dilution)，纵坐标为Ct值(Ct value)。

图9为实时定量PAP技术方法分别扩增用水和野生型模板稀释的突变型模板。野生型模板的存在并没有破坏本技术对突变型模板定量的线性范围，因此，本技术能够在大量野生型背景下对突变型模板进行宽范围的定量检测。在图9中，横坐标为稀释梯度(Dilution)，纵坐标为Ct值(Ct value)。

图8和图9显示了实时定量PAP技术与ARMS方法对稀有突变定量能力的比较。

图10为显示在对42例临床肿瘤标本的实时荧光定量PAP检测中，4例肿瘤组织标本呈现K-ras12-2-T突变阳性，突变DNA含量也被精确定量。ARMS体系中，仅检测并定量出其中突变DNA含量最高的一例标本。在图10中，横坐标指示不同标本(Sample number)，纵坐标指示突变含量(Proportion of mutant DNA)(％)。

图11为显示测序技术仅检测出4例呈现K-ras12-2-T突变阳性的肿瘤组织标本中突变DNA含量最高的一例标本。在图11中，横坐标为标本(Sample)。

图12为12-1-T和12-1-A两对突变型PAP引物同置于一个反应体系内，利用染料指示扩增过程。当存在12-1-T或12-1-A突变型模板时都有信号产生，而存在野生型模板或无模板存在时都没有扩增信号。在图12中，横坐标为循环数(Cycle number)，纵坐标为荧光值(Fluorescence)。

图13为12-1-A突变型PAP引物5’末端采用ROX荧光标记，12-2-A突变型PAP引物5’末端采用FAM荧光标记，两对突变型PAP引物同置于一个反应体系内。当存在12-1-A突变型模板时则有ROX信号，当存在12-2-A突变型模板时则有FAM信号，而存在野生型模板或无模板存在时都没有扩增信号。在图13中，横坐标为循环数(Cycle number)，纵坐标为荧光值(Fluorescence)。

图12和图13显示双重PAP检测结果。

图14为野生型引物扩增体系。其灵敏度范围为10⁶～10¹⁰个拷贝每个体系，黑色实线代表梯度稀释的质粒模板，灰线代表空白对照。在图14中，横坐标为循环数(Cycle number)，纵坐标为荧光值(Fluorescence)。

图15为野生型体系熔解曲线分析。在图15中，横坐标为温度(Temperature)/℃，纵坐标为求导后的荧光值(—dF/dT)。

图16为突变型引物扩增体系。其灵敏度范围为10⁶～10¹⁰个拷贝每个体系，黑色实线代表梯度稀释的质粒模板，灰线代表空白对照。在图16中，横坐标为循环数(Cycle number)，纵坐标为荧光值(Fluorescence)。

图17为突变型体系熔解曲线分析。在图17中，横坐标为温度(Temperature)/℃，纵坐标为求导后的荧光值(—dF/dT)。

具体实施方式

以下实施例结合附图对本发明作进一步的说明，所给出的是本发明的一些具体实施例，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的稀有突变实时定量检测试剂盒。这些并不脱离本发明描述的基本概念。

实施例1 人K-ras基因突变的实时荧光PAP定量检测

K-ras基因突变是一种广谱的肿瘤标志物，目前K-ras基因突变检测方法繁琐，选择性较差。本例采用PAP引物实时定量PCR检测人K-ras基因第一外显子第十二位密码子第二位核苷酸突变，利用核酸嵌入染料指示扩增情况，来说明本明对稀有突变的定量能力。

突变型基因组模板提取自SW480培养细胞(含有K-ras基因第一外显子12位密码子GGT->GTT突变)，野生型基因组模板提取自293T培养细胞。制备三个系列野生型基因组和突变型基因组的混合模板：

1.模板总量为1ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/5，1/10，1/20，1/50，1/100。

2.模板总量为10ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/10，1/20，1/100，1/200，1/1000。

3.模板总量为100ng/反应体系，其中突变型所占的比例分别是1/10，1/100，1/1000，1/2000，1/10000。

引物为：

12-2-T*forward:TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG-ddT；

12-2-T*reverse:GGCACTCTTGCCTACGCCACA-ddA。原始引物由上海生工生物工程有限公司合成。实验室自行对引物进行3’末端封闭。

PAP反应总体积为25μL，内含20mmol/L HEPES/NaOH(pH6.9)，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，25μmol/LdNTP，0.1μmol/L上下游引物，90μmol/L Na₄PP_i，2％DMSO，1X Evagreen核酸嵌入染料.1U TaqFS酶，各梯度模板5μL。经95℃ 3min预变性，再95℃ 15s，60℃ 20s，64℃ 20s，68℃ 30s，72℃ 30s，80个循环。荧光数据采集在60℃时采集。

结果见图2～7，可以观察到，在不同模板浓度中，以不同比例存在的突变型模板的扩增具有很好的线性关系，因此可以对实际标本中突变模板的含量进行精确的绝对定量。

实施例2 人K-ras基因突变的实时荧光PAP定量检测和ARMS定量检测方法比较。

本例采用PAP引物实时定量PCR和经典ARMS方法定量检测人K-ras基因第一外显子第十二位密码子第二位核苷酸突变，利用核酸嵌入染料指示扩增情况，通过对二者的比较来说明本明对稀有突变的定量能力。

突变型基因组模板提取自SW480培养细胞(含有K-ras基因第一外显子12位密码子GGT->GTT突变)，野生型基因组模板提取自293T培养细胞。制备两个系列野生型基因组和突变型基因组的混合模板：第一个系列的突变型摸板用水十倍梯度稀释，如表1所示。第二个系列采用野生型模板对突变型模板进行稀释，并使模板总浓度保持在100ng/反应体系。这两个系列的模板分别用实时荧光定量PAP技术和经典的ARMS技术扩增定量。

表1

引物为：

12-2-T*forward:TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG-ddT；

ARMS forward:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT

ARMS reverse:GTTGGATCATATTCGTCCAC

PAP反应总体积为25μL，内含20mmol/L HEPES/NaOH(pH6.9)，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，25μmol/L dNTP，0.1μmol/L上下游引物，90μmol/L Na₄PP_i，2％ DMSO，1X Evagreen核酸嵌入染料.1U TaqFS酶，各梯度模板5μL。经95℃ 3min预变性，再95℃ 15s，60℃ 20s，64℃ 20s，68℃ 30s，72℃ 30s，80个循环。荧光数据采集在60℃时采集。

结果见图8和图9，可以观察到，在实时荧光定量PAP检测体系中，无论突变型模板是用水稀释还是用野生型模板稀释，其定量曲线都能保持很好的线性关系，亦即大量野生型背景的存在并不影响本技术的定量能力。而相比之下，在采用经典的ARMS方法进行定量时，当存在野生型背景时，定量曲线的线性范围受到了很大的影响，大大降低了其定量范围。因此本技术在对稀有突变的定量检测上具有重大的突破和意义。

实施例3 临床样品中稀有突变的实时荧光PAP定量检测和其它定量检测方法比较。

本例采用PAP引物实时定量PCR和经典ARMS方法及测序方法定量检测42例大肠癌患者肿瘤组织中K-ras基因第一外显子第十二位密码子第二位核苷酸突变，利用核酸嵌入染料指示扩增情况，通过对三者的比较来说明本明对临床样品中稀有突变的定量能力。

引物为：

12-2-T*forward:TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG-ddT；

ARMS forward:ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT

ARMS reverse:GTTGGATCATATTCGTCCAC

PAP反应总体积为25μL，内含20mmol/L HEPES/NaOH(pH6.9)，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，25μmol/L dNTP，0.1μmol/L上下游引物，90μmol/L Na₄PP_i，2％DMSO，1X Evagreen核酸嵌入染料.1U TaqFS酶，各梯度模板5μL。经95℃ 3min预变性，再95℃ 15s，60℃ 20s，64℃ 20s，68℃ 30s，72℃ 30s，80个循环。荧光数据采集在60℃时采集。

结果见图10和图11，可以观察到，在实时荧光定量PAP检测体系中，4例肿瘤组织标本呈现突变阳性，突变DNA含量也被精确定量。ARMS体系中，仅检测并定量出其中突变DNA含量最高的一例标本。测序技术同样仅检测出突变DNA含量最高的一例标本。因此本技术在对临床样品中稀有突变的定量检测上具有极高的灵敏度和准确性。

实施例4 人K-ras基因突变的实时荧光PAP双重检测

本例采用PAP引物实时定量PCR单管同时检测人K-ras基因第一外显子第十二位密码子第一位核苷酸的两种突变(GGT->AGT和GGT->CGT)，利用核酸嵌入染料指示扩增情况，来说明本发明用于多突变位点单管同时检测的能力。

引物为：

12-1-A*forward:ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT-ddA；

12-1-A*reverse:AGGCACTCTTGCCTACGCCAC-ddT；

12-1-C*forward:ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT-ddC；

12-1-C*reverse:AGGCACTCTTGCCTACGCCAC-ddG；原始引物由上海生工生物工程有限公司合成。实验室自行对引物进行3’末端封闭。

12-1-A和12-1-C突变型模板为人工构建的质粒，野生型基因组模板提取自293T培养细胞。

PAP反应总体积为25μL，内含20mmol/L HEPES/NaOH(pH6.9)，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，25μmol/L dNTP，两对上下游引物各0.1μmol/L，90μmol/LNa₄PP_i，2％ DMSO，1*Evagreen核酸嵌入染料.1U TaqFS酶，突变型质粒模板为10⁵拷贝/反应体系，野生型基因组模板为10ng/反应体系。经95℃ 3min预变性，再95℃ 15s，60℃ 20s，64℃20s，68℃ 30s，72℃ 30s，80个循环。荧光数据采集在60℃时采集。结果见图12。

实施例5荧光双链PAP引物用于人突变K-ras基因的双重检测

本例利用荧光双链PAP引物单管同时检测人K-ras基因第一外显子第十二位密码子第一位核苷酸和第二位核苷酸的两种突变(GGT->AGT和GGT->GAT)，来说明荧光双链PAP引物用于多突变位点单管同时检测的能力。

引物为：

12-1-A*forward:ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT-ddA；

12-1-A*reverse:ROX-AGGCACTCTTGCCTACGCCAC-ddT；

12-2-A*forward:TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG-ddA；

12-2-A*reverse:FAM-AAGGCACTCTTGCCTACGCCA-ddT；

淬灭引物：GCGTAGGCAAGAGTGCCT-Dabcyl。原始引物由上海生工生物工程有限公司合成。实验室自行对引物进行3’末端封闭。

12-1-A和12-2-A突变型模板为人工构建的质粒，野生型基因组模板提取自293T培养细胞。

PAP反应总体积为25μL，内含20mmol/L HEPES/NaOH(pH6.9)，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，25μmol/L dNTP，两对上下游引物各0.1μmol/L，淬灭引物0.2μmol/L，90μmol/L Na₄PP_i，2％DMSO，1U TaqFS酶，突变型质粒模板为10⁵拷贝/反应体系，野生型基因组模板为10ng/反应体系。经95℃ 3min预变性，再95℃ 15s，60℃ 20s，64℃ 20s，68℃ 30s，72℃ 30s，80个循环。荧光数据采集在60℃时采集。结果见图13。

实施例6 PAP引物-探针联合实时定量PCR用于人EGFR突变检测

本例利用PAP引物-探针联合实时定量PCR检测人EGFR基因第19外显子的P746_750del突变，来说明PAP引物-探针联合实时定量PCR用于突变检测的能力。

引物分别为：

5’GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAAddC3’

5’CAGCTGCCAGACATGAGAAAAG3’。

原始引物由上海生工生物工程有限公司合成。实验室自行对引物进行3’末端封闭。探针为双链探针，正链为：

FAM-5’CCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCT3’-PO4，

负链为：

5’AAGCAGAAACTCACATCGAGG3’-DABCYL。

PAP反应总体积为25μL，内含20mmol/L HEPES/NaOH(pH6.9)，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，25μmol/L dNTP，0.1μmol/L上下游引物，90μmol/L Na₄PP_i，2％DMSO，1U TaqFS酶，各梯度模板5μL。经95℃ 3min预变性，再95℃ 15s，60℃ 20s，64℃10s，68℃ 10s，72℃ 30s，70个循环。荧光数据采集在60℃时采集。

实施例7 实时PAP用于结核分枝杆菌异烟肼耐药KatG315突变检测

本例通过在混合型临床痰标本中检测结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因KatG315的突变，解决结核分枝杆菌耐药菌株比例无法得到正确反映的问题，来说明实时PAP对杂合模板的定量检测能力。

野生型上游引物为：

5’-GGTAAGGACGCGATCACCAddG-3’；

突变型上游引物为：

5’-GGTAAGGACGCGATCACCAddC-3’；

下游引物为：

5’-ACAGGATCTCGAGGAAACTGTTGT-3’。

原始引物由上海生工生物工程有限公司合成，实验室自行对引物进行3’末端封闭。

PAP反应总体积为25μL，内含20mmol/L HEPES/NaOH(pH6.9)，10mmol/L(NH4)2SO4，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，25μmol/L dNTP，0.1μmol/L各上下游引物，90μmol/L Na4PPi，2％DMSO，2U TaqFS，0.8 X EvaGreen，各梯度模板5μL。反应程序为：94℃ 5min，进入周期循环，94℃ 10s，57℃ 20s，64℃ 20s，67℃ 30s，72℃ 30s共60个循环，在67℃采集FAM通道荧光数据。熔解曲线荧光数据采集在65～94℃，每上升0.5℃采集一次。利用Rotor-Gene 3000和MX3000P实时PCR仪进行检测。

结果见图14～17，结果显示不论野生型体系还是突变型体系，从5×10⁷经10倍梯度稀释至50(copies/reaction)的质粒模板都能够得到很好的扩增。熔解曲线证实均为产物峰。这些结果表明，不管是野生型体系还是突变型体系都具有很宽的线型范围而且灵敏度至少可以达到50(copies/reaction)。

序列表

实施例1 人K-ras基因突变的实时荧光PAP定量检测

引物为：

引物为：

引物为：

实施例4 人K-ras基因突变的实时荧光PAP双重检测

引物为：

实施例5 荧光双链PAP引物用于人突变K-ras基因的双重检测

引物为：

实施例6 PAP引物-探针联合实时定量PCR用于人EGFR突变检测

引物分别为：

原始引物由上海生工生物工程有限公司合成。实验室自行对引物进行3’末端封闭。探针为双链探针，

正链为：

负链为：

实施例7 实时PAP用于结核分枝杆菌异烟肼耐药KatG315突变检测

野生型上游引物为：

突变型上游引物为：

下游引物为：