CN107267650A - 一种aldh2*2基因型检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种ALDH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法，其特征在于：包括KOD DNA 聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；GG纯合型DNA序列是以人ALDH2*2基因1510位点GG型为模板而设计的一段线性重组DNA序列；AA纯合型DNA序列是以人ALDH2*2基因1510位点AA型为模板而设计的一段线性重组DNA序列；AG型阳性参考品是通过GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成。本发明的检测方法能够快速、简便地检测ALDH2*2 基因第1510位点的变异。

Description

一种ALDH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种ALDH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒采用PCR体外扩增法，用于定性检测人全血样本中乙醛脱氢酶ALDH2*2第1510位点的基因多态性。

背景技术

线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）同时具有乙醛脱氢酶和酯酶活性，参与乙醇、硝酸甘油等药物的代谢。ALDH2代谢活化硝酸甘油成其活性代谢产物一氧化氮。ALDH2*2（Glu504Lys，rs671）多态导致所编码蛋白质504位谷氨酸被赖氨酸所取代，携带突变等位基因（ALDH2*2）的个体ALDH2酶活性下降，杂合子个体酶活性仅为野生型个体的10％，突变纯合子个体酶活性缺失。因此，携带ALDH2*2等位基因的个体酒精代谢能力下降，少量饮酒即出现脸红、心跳加速等不适；代谢硝酸甘油的能力下降，硝酸甘油抗心肌缺血的效应减弱。亚洲人群中ALDH2*2等位基因的携带率为30~50％。携带ALDH2*2等位基因的心绞痛患者应尽可能改用其他急救药物，避免硝酸甘油含服无效。因此，定性检测ALDH2的基因多态性，可以用于筛选酒精代谢能力人群和指导硝酸甘油用药。

目前临床或实验室检测ALDH2基因多态性的方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、原位杂交（ISH）等多种方法。

PCR-直接测序法也称PCR-Sanger测序。PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤。该方法属于定性检测。主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。

PCR-焦磷酸测序法需设计一条生物素标记的测序引物，当引物与单链模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。主要缺点：对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；检测灵敏度有限，对肿瘤组织中的低丰度体细胞突变（<3％）容易出现假阴性；测序长度仅10多个碱基，不能对长片段进行分析。

实时荧光PCR法可分为探针法和非探针法两种，前者利用与靶序列特异杂交的探针（Taqman和分子信标）来指示扩增产物的增加，后者利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高。本方法主要适于对少量位点、大样本进行分型。

PCR-基因芯片法以特定的寡核苷酸片段作为探针，将其有规律地排列固定于支持物上，然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等程序，按碱基配对原理与芯片杂交，再通过荧光检测系统对芯片上的荧光信号进行检测和分析，从而迅速获得个体的基因型信息。该方法用于DNA基因分型时属于定性检测，灵敏度为50 ng/μL。

PCR-电泳分析是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物的大小对基因多态性位点进行基因分型。PCR过程中需建立阳性质控品和阴性质控品，电泳分析时需同时用分子量标记物进行片段大小的判断。当分子量标记物反应管无条带或出现较弱的条带时，可能的原因包括点样孔漏、荧光染料不够或失效、电泳时间过长或电压过大。该方法的优点是成本低，在普通实验室即可开展；缺点是只适合对DNA插入/缺失多态性或融合基因进行定性测定，不能用于SNP的检测。

发明内容

本发明旨在提供一种ALDH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法，利用该试剂盒能够快速、简便地检测ALDH2*2 基因第1510位点的类型。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种ALDH2*2基因型检测试剂盒，包括KOD DNA 聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；

所述上游引物为针对人ALDH2*2基因设计的上游引物，上游引物的序列为5’-CCCAGTCACCCTTTGGTGGCTAC-3’ （如SEQ NO:1所示）；

所述下游引物为针对人ALDH2*2基因设计的下游引物，下游引物的序列为5’-CGAGCCACCAGCAGACCCTCA -3’ （如SEQ NO:2所示）；

所述特异性靶向荧光探针是带有人ALDH2*2基因的特异性配对序列的探针，其碱基序列为5’-CTCACAGTTTTCACTTCAGTGTATGC-3’ （如SEQ NO:3所示）， 荧光染料为氟硼二吡咯；

所述GG型阳性参考品是一种以GG纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述GG纯合型DNA序列是以人ALDH2*2基因1510位点GG型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，GG纯合型DNA序列为5’- GAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGCTGCTGGTGGCTCGGAGCCT-3’ （如SEQ NO:4所示），其中，带有下划线的碱基位点是人ALDH2*2基因的1510位点，所述1510位点用于表征人ALDH2*2基因的GG型可突变为人ALDH2*2基因的AA型的位置；

所述AA型阳性参考品是一种以AA纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述AA纯合型DNA序列是以人ALDH2*2基因1510位点AA型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，AA纯合型DNA序列为5’- GAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGCTGCTGGTGGCTCGGAGCCT-3’ （如SEQ NO:5所示），其中，带有下划线的碱基位点是人ALDH2*2基因的1510位点，所述1510位点用于表征人ALDH2*2基因的AA型可突变为人ALDH2*2基因的GG型的位置；

所述AG型阳性参考品是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述GG型阳性参考品含有的GG纯合型DNA序列的浓度等于所述AA型阳性参考品含有的AA纯合型DNA序列的浓度。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，KOD DNA聚合酶是从鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌Thermococcus kodakaraensis KOD1提取纯化出来的，具有很强的3'→5'核酸外切酶活性(校正活性)，保真性约为Taq DNA Polymerase的50倍。具有1Kb/30s以上的DNA合成速度，该速度是最为普通的Taq聚合酶的两倍。另外，持续合成能力等较为优秀也是其伸长速度很快的主要原因之一。采用KOD DNA聚合酶，可以使一次循环的时间从原来的几分钟缩短为几十秒。生产公司为TOYOBO公司，其结构参见日本专利JP2008306935A。

2、上述方案中，所述特异性靶向荧光探针为QProbe，通过混合特定的排列，将具有荧光淬灭这一特征的荧光色素作为标识的探针。QProbe的结构参见日本专利JP2011097956A，利用这一特征，就无需使用插入DNA嵌入剂等其它双链核酸结构的色素，也无需使用会引起FRET现象的两种探针，而是使用在一种荧光物质中作出标识的探针，在不会阻碍高速扩增的同时，能够特异性地检测出目标核酸序列。

3、上述方案中，较佳的方案是所述GG型阳性参考品中含有GG纯合型DNA序列的浓度为500~5000拷贝/微升，所述AA型阳性参考品中含有AA纯合型DNA序列的浓度为500~5000拷贝/微升，所述AG型阳性参考品中含有GG纯合型DNA序列和AA纯合型DNA序列的浓度均为500~5000拷贝/微升。GG型阳性参考品和AA型阳性参考品的配制过程大致是先将DNA序列构建到载体质粒上保存，再加入缓冲试剂稀释，从而配制成GG型阳性参考品和AA型阳性参考品。缓冲试剂可以为pH 为7.6的Tris-HCl缓冲液、纯化水以及pH 为7.6的TE缓冲液等的任意一种。

所述ALDH2*2基因型检测试剂盒还包括阳性质控品，阳性质控品是一种以碱基序列为主要成分的试剂，所述碱基序列是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述阳性质控品含有GG纯合型DNA序列和AA纯合型DNA序列的浓度均为500~5000拷贝/微升。

所述阳性质控品是事先设计好的、当做已知浓度及碱基序列的样本，和其他被检样本一起进行检测，它作为试剂盒的一部分，与其他试剂配套使用，用于用户验证检测结果的准确性。

4、上述方案中，所述GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品均含有事先设计好的、已知浓度的碱基序列，和其他被检样本一起进行检测，主要用于生厂商内的技术人员对试剂盒进行质量检测。使用试剂盒中的试剂分别检测3种基因型的阳性参考品（即GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品），检测结果应该为相应基因型。

为达到上述目的，本发明的一种ALDH2*2基因型检测方法，包括以下步骤：

第一步，准备被检样本，以被检样本作为检测的对象，被检样本为人全血；

第二步，以所述被检样本为模板基因链，利用所述ALDH2*2基因型检测试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：

上游引物 0.1μmol/L，1.4至2.8μL；

下游引物 0.1μmol/L，1.4至2.8μL；

特异性靶向荧光探针 0.1μmol/L，1.0至2.0μL；

MgCl₂*6H₂O 0.35g/L，1.4至2.8μL；

dNTPs 0.02mM，0.4至0.8μL；

KOD DNA 聚合酶 0.02U/μL，0.4至0.8μL；

KOD buffer 3.2至6.4μL；

模板 4至8μL；

第三步，用高分辨率熔解曲线法进行检出，检出条件依次为：

（1）94.0 ℃，30.0秒，

（2）39.0 ℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

第四步，检出结果通过阳性判断值来判断，阳性判断值的三种结果的判断依据为：

（1）ALDH2*2基因的1510位点为GG纯合子：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在60.5℃~65.5℃之间；

（2）ALDH2*2基因的1510位点为AA纯合子：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在54℃~59℃之间；

（3）ALDH2*2基因的1510位点为AG杂合子：有2个熔解曲线峰，其中一个熔解曲线峰的荧光微分值≥10且熔解曲线峰值所在的熔解温度在54℃~59℃之间，另一个熔解曲线峰的荧光微分值≥10且熔解曲线峰值所在的熔解温度在60.5℃～65.5℃之间。

1、上述方案中，所述dNTPs是脱氧腺苷三磷酸（dATP）、脱氧胞苷三磷（dCTP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胸腺三磷酸（dTTP）的混合物。

2、上述方案中，所述第二步的荧光定量PCR扩增反应的反应过程如下：

（1）94.0℃预变性30.0秒，

（2）97.0℃变性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸 5.0秒，其中，步骤（2）~（4）循环50次。

3、上述方案中，在所述第一步中，用样本溶解液把采集的人全血稀释10~50倍后，作为所述被检样本；其中，所述样本溶解液是由缓冲液和纯化水组成，缓冲液与纯化水的体积比为1：99，缓冲液为pH7.6的Tris-HCl缓冲液。

4、上述方案中，高分辨熔解曲线（high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法，是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。

本发明的设计原理是：本发明的试剂盒采用PCR体外扩增法对目标核酸进行扩增，并采用特异性靶向荧光探针（QProbe）检测目标核酸的方法，定性检测人全血样本中乙醛脱氢酶ALDH2*2 （G1510A）的基因多态性。以人ALDH2*2的基因编码区为模板，加入相应的上游引物和下游引物，KOD DNA聚合酶催化各引物延长基因链。通过反复的引物的退火，延伸来扩增目的核酸片段。之后，扩增核酸和带有ALDH2*2基因的特异性配对序列的特异性靶向荧光探针杂交结合，通过解析荧光的变化来检测ALDH2*2基因型。

本发明的试剂盒和检测方法采用具有高速扩增能力的KOD DNA聚合酶进行扩增，设计简单的特异性靶向荧光探针（Q-探针）能够快速、简便的对ALDH2*2基因进行检测。同时，全封密的扩增可防止携带污染等造成的假阳性结果的发生。另外，反应体系中加入阳性质控品，可以了解临床样本的妨碍物质对PCR反应的影响，进一步防止ALDH2*2基因检测的假阴性。

本发明有益效果：

（1）现有PCR反应体系的量一般需要40μＬ，而本发明的荧光定量PCR扩增反应体系的量最低仅为13.2μＬ。

（2）本发明的荧光定量PCR扩增反应时间大大缩短，变性、退火、延伸的50次循环最低仅需0.5个小时即可完成。

（3）现有的ALDH2*2基因型检测试剂盒需要在-20℃条件下保存，而本发明的试剂盒在2~8℃条件下即可保存。

（4）本发明采用全封密的PCR扩增，可防止携带污染等造成假阳性结果的发生。

总之，本发明的检测方法能够快速、简便地检测ALDH2*2 基因第1510位点的类型。本发明的试剂盒对于ALDH2*2 (G1510A)基因型的检测结果可以为具有低活性乙醛脱氢酶2的高危人群提供辅助诊断，为临床个体化诊断用药提供参考。

附图说明

附图1为人ALDH2*2基因的1510位点为GG型时的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图2为人ALDH2*2基因的1510位点为AA型时的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图3为人ALDH2*2基因的1510位点为AG型时的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值；

附图4为空白对照时的荧光定量PCR扩增熔解曲线图，横坐标是温度，纵坐标是荧光微分值。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例：一种ALDH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法

所述ALDH2*2基因型检测试剂盒包括KOD DNA 聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；

所述上游引物为针对人ALDH2*2基因设计的上游引物，上游引物的序列为5’-CCCAGTCACCCTTTGGTGGCTAC-3’；

所述下游引物为针对人ALDH2*2基因设计的下游引物，下游引物的序列为5’-CGAGCCACCAGCAGACCCTCA -3’；

所述特异性靶向荧光探针是带有人ALDH2*2基因的特异性配对序列的探针，其碱基序列为5’-CTCACAGTTTTCACTTCAGTGTATGC-3’， 荧光染料为氟硼二吡咯；

所述GG型阳性参考品是一种以GG纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述GG纯合型DNA序列是以人ALDH2*2基因1510位点GG型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，GG纯合型DNA序列为5’- GAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGCTGCTGGTGGCTCGGAGCCT-3’，其中，带有下划线的碱基位点是人ALDH2*2基因的1510位点，所述1510位点用于表征人ALDH2*2基因的GG型可突变为人ALDH2*2基因的AA型的位置；所述GG型阳性参考品中含有GG纯合型DNA序列的浓度为500拷贝/微升；

所述AA型阳性参考品是一种以AA纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述AA纯合型DNA序列是以人ALDH2*2基因1510位点AA型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，AA纯合型DNA序列为5’- GAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGCTGCTGGTGGCTCGGAGCCT-3’，其中，带有下划线的碱基位点是人ALDH2*2基因的1510位点，所述1510位点用于表征人ALDH2*2基因的AA型可突变为人ALDH2*2基因的GG型的位置；所述AA型阳性参考品中含有AA纯合型DNA序列的浓度为500拷贝/微升；

所述AG型阳性参考品是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述GG型阳性参考品含有的GG纯合型DNA序列的浓度等于所述AA型阳性参考品含有的AA纯合型DNA序列的浓度，所述AG型阳性参考品中含有GG纯合型DNA序列和AA纯合型DNA序列的浓度均为500拷贝/微升。

所述ALDH2*2基因型检测试剂盒还包括阳性质控品，阳性质控品是一种以碱基序列为主要成分的试剂，所述碱基序列是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述阳性质控品含有GG纯合型DNA序列和AA纯合型DNA序列的浓度均为1000拷贝/微升。

在实际生产中，所述ALDH2*2基因型检测试剂盒可以做成包含下列组分的试剂盒：

（1）聚合酶试剂[KOD Mix]：由KOD DNA聚合酶、dNTP等组成，规格为140μL×2支、140μL×4支或140μL×6支；

（2）引物・探针试剂 [ALDH2*2 Mix]：即由上游引物、下游引物以及特异性靶向荧光探针组成的混合试剂，规格为140μL×1支、140μL×2支或140μL×3支；

（3）GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品，规格均为100μL×1支；

（4）阳性质控品，规格为150μL×1支。

其中，GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品中的DNA序列均是构建到载体质粒上保存，原始质粒购置于生工生物工程（上海）股份有限公司，载体质粒构建过程属于现有技术，具体过程如下：

引物设计——PCR扩增——割胶回收DNA片段——构建载体——转化培养——阳性克隆鉴定——37℃摇床培养——质粒抽提——测序确认碱基序列。

抽提后的质粒再配制成所述GG型阳性参考品，配制方法如下：

（1）配制稀释液：加入50%配方量的纯化水→加入Tris-HCl缓冲液（pH7.6）→加入剩余的纯化水（涡旋震荡3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀释液；

（2）人ALDH2*2基因1510位点GG纯合载体质粒预稀释：加入50%配方量的所述稀释液→加入人ALDH2*2基因1510位点GG纯合载体质粒溶液→加入剩余的所述稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到X拷贝/微升人ALDH2*2基因1510位点GG纯合质粒溶液（X代表质粒浓度的具体数值）；

（3）得到GG型阳性参考品：加入50%配方量的稀释液→加入X拷贝/微升人ALDH2*2基因1510位点GG纯合质粒溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到GG型阳性参考品。

抽提后的质粒再配制成所述AA型阳性参考品，配制方法如下：

（1）配制稀释液：加入50%配方量的纯化水→加入Tris-HCl缓冲液（pH7.6）→加入剩余的纯化水（涡旋震荡3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀释液；

（2）人ALDH2*2基因1510位点AA纯合载体质粒预稀释：加入50%配方量的所述稀释液→加入人ALDH2*2基因1510位点AA纯合载体质粒溶液→加入剩余的所述稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到X拷贝/微升人ALDH2*2基因1510位点AA纯合质粒溶液（X代表质粒浓度的具体数值）；

（3）得到AA型阳性参考品：加入50%配方量的稀释液→加入X拷贝/微升人ALDH2*2基因1510位点AA纯合质粒溶液→加入剩余的稀释液（涡旋震荡3次，每次5秒）→得到AA型阳性参考品。

ALDH2*2基因型检测方法包括以下步骤：

第一步，准备被检样本，以被检样本作为检测的对象，被检样本为人全血；用样本溶解液把采集的人全血稀释25倍后，作为所述被检样本；其中，所述样本溶解液是由缓冲液和纯化水组成，缓冲液与纯化水的体积比为1：99，缓冲液为pH 为7.6的Tris-HCl缓冲液；

第二步，以所述被检样本为模板基因链，利用所述试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：

上游引物 0.1μmol/L，1.4μL；

下游引物 0.1μmol/L，1.4μL；

特异性靶向荧光探针 0.1μmol/L，1.0μL；

MgCl₂*6H₂O 0.35g/L，1.4μL；

dNTPs 0.02mM，0.4μL；

KOD DNA 聚合酶 0.02U/μL，0.4μL；

KOD buffer 3.2μL；

模板 4μL；

在上述荧光定量PCR扩增反应的反应体系中，在各组分的使用浓度不变的前提下，各组分的体积用量最多可为上述数值的2倍，即上游引物的所用体积为2.8μL，下游引物的所用体积为2.8μL，特异性靶向荧光探针的所用体积为2.0μL，MgCl₂*6H₂O的所用体积为2.8μL，dNTPs的所用体积为0.8μL，KOD DNA 聚合酶的所用体积为0.8μL，KOD buffer的所用体积为6.4μL，模板的所用体积为8μL；

所述荧光定量PCR扩增反应的反应过程如下：

（1）94.0℃预变性30.0秒，

（2）97.0℃变性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸 5.0秒，其中，步骤（2）~（4）循环50次；

第三步，用高分辨率熔解曲线法进行检出，检出条件依次为：

（1）94.0 ℃，30.0秒，

（2）39.0 ℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

直接在全自动基因分析仪GENECUBE（生产商为TOYOBO）上进行荧光定量PCR扩增反应和检测。具体步骤为：将被检样本4μL、聚合酶试剂[KOD Mix]4μL、引物・探针试剂[ALDH2*2Mix]5.2μL混合后，调制成反应液。专用吸管吸取反应液到专用塑料毛细管中。进行扩增反应。进行检出，测定波长为510nm~550nm的荧光值。测定的荧光值由专用分析软件解析，转换成表示荧光变化量的荧光微分值。解析荧光微分值，在显示屏上显示测定结果。

第四步，检出结果通过阳性判断值来判断，阳性判断值的三种结果的判断依据为：

（1）ALDH2*2基因的1510位点为GG纯合子：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在60.5℃~65.5℃之间，参见附图1所示；

（2）ALDH2*2基因的1510位点为AA纯合子：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在54℃~59℃之间，参见附图2所示；

（3）ALDH2*2基因的1510位点为AG杂合子：有2个熔解曲线峰，其中一个熔解曲线峰的荧光微分值≥10且熔解曲线峰值所在的熔解温度在54℃~59℃之间，另一个熔解曲线峰的荧光微分值≥10且熔解曲线峰值所在的熔解温度在60.5℃～65.5℃之间，参见附图3所示。

所述荧光微分值是指对检测到的目标物的荧光强度随温度变化的值做微分求导，得到荧光微分值。

在上述实施例中，所述GG型阳性参考品中含有GG纯合型DNA序列的浓度、AA型阳性参考品中含有AA纯合型DNA序列的浓度以及AG型阳性参考品中含有GG纯合型DNA序列和AA纯合型DNA序列的浓度均为500拷贝/微升，在该浓度下实施效果最好，但在本领域内上述阳性参考品中DNA序列的浓度在500~5000拷贝/微升范围内都可以实施。同理，阳性质控品含有GG纯合型DNA序列和AA纯合型DNA序列的浓度在500~5000拷贝/微升范围内都可以实施。另外，在对人全血进行稀释时，上述实施例是以稀释25倍为例，在本领域实际操作中，用样本溶解液把采集的人全血稀释10~50倍作为被检样本都可以实施。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccagtcaccctttggtggctac 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgagccaccagcagaccctca 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcacagttttcacttcagtgtatgc 26

<210> 4

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcaggcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctgttggggcttgagggctgctggtggctcggagcct 160

<210> 5

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcaggcatacactaaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctgttggggcttgagggctgctggtggctcggagcct 160

Claims (6)

1.一种ALDH2*2基因型检测试剂盒，其特征在于：包括KOD DNA 聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；

所述上游引物为针对人ALDH2*2基因设计的上游引物，上游引物的序列为5’-CCCAGTCACCCTTTGGTGGCTAC-3’；

所述下游引物为针对人ALDH2*2基因设计的下游引物，下游引物的序列为5’-CGAGCCACCAGCAGACCCTCA -3’；

所述特异性靶向荧光探针是带有人ALDH2*2基因的特异性配对序列的探针，其碱基序列为5’-CTCACAGTTTTCACTTCAGTGTATGC-3’，荧光染料为氟硼二吡咯；

所述GG型阳性参考品是一种以GG纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述GG纯合型DNA序列是以人ALDH2*2基因1510位点GG型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，GG纯合型DNA序列为5’- GAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGCTGCTGGTGGCTCGGAGCCT-3’，其中，带有下划线的碱基位点是人ALDH2*2基因的1510位点，所述1510位点用于表征人ALDH2*2基因的GG型可突变为人ALDH2*2基因的AA型的位置；

所述AA型阳性参考品是一种以AA纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述AA纯合型DNA序列是以人ALDH2*2基因1510位点AA型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，AA纯合型DNA序列为5’- GAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGCTGCTGGTGGCTCGGAGCCT-3’，其中，带有下划线的碱基位点是人ALDH2*2基因的1510位点，所述1510位点用于表征人ALDH2*2基因的AA型可突变为人ALDH2*2基因的GG型的位置；

所述AG型阳性参考品是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述GG型阳性参考品含有的GG纯合型DNA序列的浓度等于所述AA型阳性参考品含有的AA纯合型DNA序列的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种ALDH2*2基因型检测试剂盒，其特征在于：该ALDH2*2基因型检测试剂盒还包括阳性质控品，阳性质控品是一种以碱基序列为主要成分的试剂，所述碱基序列是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述阳性质控品含有GG纯合型DNA序列和AA纯合型DNA序列的浓度均为500~5000拷贝/微升。

3.根据权利要求1所述的一种ALDH2*2基因型检测试剂盒，其特征在于：所述GG型阳性参考品中含有GG纯合型DNA序列的浓度为500~5000拷贝/微升，所述AA型阳性参考品中含有AA纯合型DNA序列的浓度为500~5000拷贝/微升，所述AG型阳性参考品中含有GG纯合型DNA序列和AA纯合型DNA序列的浓度均为500~5000拷贝/微升。

4.一种ALDH2*2基因型检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步，准备被检样本，以被检样本作为检测的对象，被检样本为人全血；

第二步，以所述被检样本为模板基因链，利用权利要求1~3任意一项所述试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：

上游引物 0.1μmol/L，1.4至2.8μL；

下游引物 0.1μmol/L，1.4至2.8μL；

特异性靶向荧光探针 0.1μmol/L，1.0至2.0μL；

MgCl₂*6H₂O 0.35g/L，1.4至2.8μL；

dNTPs 0.02mM，0.4至0.8μL；

KOD DNA 聚合酶 0.02U/μL，0.4至0.8μL；

KOD buffer 3.2至6.4μL；

模板 4至8μL；

第三步，用高分辨率熔解曲线法进行检出，检出条件依次为：

（1）94.0 ℃，30.0秒，

（2）39.0 ℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

第四步，检出结果通过阳性判断值来判断，阳性判断值的三种结果的判断依据为：

（1）ALDH2*2基因的1510位点为GG纯合子：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在60.5℃~65.5℃之间；

（2）ALDH2*2基因的1510位点为AA纯合子：荧光微分值≥10，并且熔解曲线峰值所在的熔解温度在54℃~59℃之间；

（3）ALDH2*2基因的1510位点为AG杂合子：有2个熔解曲线峰，其中一个熔解曲线峰的荧光微分值≥10且熔解曲线峰值所在的熔解温度在54℃~59℃之间，另一个熔解曲线峰的荧光微分值≥10且熔解曲线峰值所在的熔解温度在60.5℃～65.5℃之间。

5.根据权利要求4所述的一种ALDH2*2基因型检测方法，其特征在于：所述第二步的荧光定量PCR扩增反应的反应过程如下：

（1）94.0℃预变性30.0秒，

（2）97.0℃变性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸 5.0秒，其中，步骤（2）~（4）循环50次。

6. 根据权利要求4所述的一种ALDH2*2基因型检测方法，其特征在于：在所述第一步中，用样本溶解液把采集的人全血稀释10~50倍后，作为所述被检样本；其中，所述样本溶解液是由缓冲液和纯化水组成，缓冲液与纯化水的体积比为1：99，缓冲液为pH 7.6的Tris-HCl缓冲液。