CN107034280A - 检测dna聚合酶活性的方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒。该方法将待测DNA聚合酶与足量的待补平模板混合，在dNTP存在的条件下，通过待测DNA聚合酶诱导待补平模板中的第一DNA片段延伸形成与凸出片段的碱基互补的补平片段得到补平模板。补平模板中的U碱基被足量的UDG酶消化去除，得到适于PCR扩增的模板，正向引物针对凸出片段设计，反向引物针对第一DNA片段的5’端设计，诱导第一模板链扩增。而未经补平的模板经消化酶去除U碱基后则无法与正向引物配对，即不能进行PCR扩增反应。将待测DNA聚合酶的CT值带入由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，运算即可获得待测DNA聚合酶的酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒。
背景技术
DNA聚合酶(DNA polymerase)是细胞复制DNA中的重要作用酶，在特定的条件下能够诱导DNA链的复制延长。生物体内较为重要的DNA聚合酶例如有T4 DNA聚合酶、Klenow酶(又称Klenow片段，Klenow Fragment)和DNA聚合酶I(DNA-pol I)等。其中T4 DNA聚合酶是由T4噬菌体聚合酶I基因编码，具有5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性。T4 DNA聚合酶是基因工程技术中一种重要的工具酶，在高通量测序(next generation sequencing)文库构建的过程具有重要的作用。
传统的检测DNA聚合酶活性的方法一般采用放射性同位素法，将DNA聚合酶催化的32P标记的dNTP掺入到小牛胸腺DNA中。经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不溶性物质中放射性的含量，从而计算聚合酶活性。这种方法易产生放射性污染、操作繁琐，难以实现高通量的检测。
发明内容
基于此，有必要提供一种非放射性、操作简便的检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒。
一种检测DNA聚合酶活性的方法，包括以下步骤：
提供待补平模板，所述待补平模板包括第一模板链和第二模板链，所述第一模板链包括第一DNA片段，所述第二模板链包括第二DNA片段以及与所述第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，所述第二DNA片段与所述第一DNA片段碱基互补，所述凸出片段中含有U碱基；
在dNTP存在的条件下，将待测DNA聚合酶与足量的所述待补平模板混合，使得所述第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段，得到补平模板，所述补平片段与所述凸出片段碱基互补；
将所述补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，其中所述正向引物针对所述凸出片段设计，所述反向引物针对所述第一DNA片段的5’端设计，所述探针用于检测所述第一DNA片段；以及
获取所述实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，将所述CT值带入由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，得到所述待测DNA聚合酶的酶活性。
在一个实施方式中，所述由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：
将DNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的所述DNA聚合酶标准品；
在dNTP存在的条件下，分别将每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品与足量的所述待补平模板混合，得到多个补平模板，所述多个补平模板分别为每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品对应的补平模板；
分别将所述多个补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应；以及
获取每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品对应的实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，根据所述CT值与酶活性的对应关系建立所述标准曲线。
在一个实施方式中，所述第一模板链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述第二模板链的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
在一个实施方式中，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
在一个实施方式中，所述探针的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
在一个实施方式中，所述将待测DNA聚合酶与足量的所述待补平模板混合的操作中，混合的温度为25℃～40℃，混合的时间为0.5h～1.5h。
在一个实施方式中，所述将所述补平模板、正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应的操作中，所述荧光定量PCR扩增反应的热循环条件为：
45℃～55℃、20min～40min，1～3个循环；
93℃～97℃、5min～15min，1～3个循环；以及
90℃～100℃、15s～25s，50℃～60℃、15s～25s，70℃～75℃、25s～35s，35～45个循环。
在一个实施方式中，所述DNA聚合酶选自T4 DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种。
一种检测DNA聚合酶活性的检测试剂盒，包括待补平模板、正向引物、反向引物和探针；
所述待补平模板包括第一模板链和第二模板链，所述第一模板链包括第一DNA片段，所述第二模板链包括第二DNA片段以及与所述第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，所述第二DNA片段与所述第一DNA片段碱基互补，所述凸出片段中含有U碱基；
所述正向引物针对所述凸出片段设计；
所述反向引物针对所述第一DNA片段的5’端设计；
所述探针针对所述第一DNA片段中的部分碱基设计。
在一个实施方式中，第一模板链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述第二模板链的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示，所述探针的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
上述检测DNA聚合酶活性的方法，在dNTP存在的条件下，将待测DNA聚合酶与足量的待补平模板混合后，通过待测DNA聚合酶诱导待补平模板中的第一DNA片段的3’端延伸形成与凸出片段的碱基互补的补平片段，从而得到补平模板。将补平模板、正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应。补平模板中的U碱基被足量的UDG酶消化去除，得到适于PCR扩增的模板，正向引物针对凸出片段设计，反向引物针对第一DNA片段的5’端设计，即正向引物能够结合补平片段，诱导第一模板链扩增。而未经补平的模板由于没有形成补平片段，经消化酶去除U碱基后则无法与正向引物配对，即不能进行PCR扩增反应。经研究发现，不同酶活性的DNA聚合酶和实时荧光定量PCR扩增反应的CT值(荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)存在稳定的相关性，在足量的待补平模板的条件下，DNA聚合酶的酶活性越高，诱导补平后获得的补平模板的量越多，经消化酶酶切后的获得的适于PCR扩增的模板的量也越多，PCR扩增反应的CT值越小。将待测DNA聚合酶的CT值带入由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，运算即可获得待测DNA聚合酶的酶活性。上述检测DNA聚合酶活性的方法不需要放射性检测，操作简便，实验结果表明该方法重现性好、灵敏度高，能够实现高通量的检测。
附图说明
图1为一实施方式的检测DNA聚合酶活性的方法的流程图；
图2为一实施方式的检测DNA聚合酶活性的方法的原理示意图；
图3为不同稀释倍数的T4 DNA聚合酶标准品PCR扩增后的扩增曲线；
图4为以T4 DNA聚合酶标准品的酶活性作为横坐标，PCR扩增反应对应的CT值作为纵坐标绘制的标准曲线；
图5为以另一种T4 DNA聚合酶标准品的酶活性作为横坐标，PCR扩增反应对应的CT值作为纵坐标绘制的标准曲线；
图6为以自制的DNA聚合酶的酶活性作为横坐标，PCR扩增反应对应的CT值作为纵坐标绘制的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。未特别说明，序列表中的碱基序列均为从5’端到3’端的顺序。
请参阅图1，一实施方式的检测DNA聚合酶活性的方法包括以下步骤S110～S140。
S110、提供待补平模板，该待补平模板包括第一模板链和第二模板链，第一模板链包括第一DNA片段，第二模板链包括第二DNA片段以及与第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，第二DNA片段与第一DNA片段碱基互补，凸出片段中含有U碱基。
当第一模板链和第二模板链形成双链后，由于第二DNA片段与第一DNA片段碱基互补，第二模板链中的凸出片段形成凸出末端，而第一模板链中的3’端凹陷。
S120、在dNTP存在的条件下，将待测DNA聚合酶与足量的S110中的待补平模板混合，使得第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段，得到补平模板，补平片段与凸出片段碱基互补。
DNA聚合酶是细胞复制DNA中的重要作用酶，在特定的条件下能够诱导DNA链的复制延长，DNA聚合酶一般以DNA为复制模板，将DNA由5'端向3'端延伸。
一实施方式检测的DNA聚合酶选自T4 DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种。具体在本实施方式中，检测的DNA聚合酶为T4 DNA聚合酶。
具体地，待补平模板的量以及加入的dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP)为足量的，即不会因为待补平模板或dNTP被消耗掉而导致反应的终止，待补平模板或dNTP可能是过量的也有可能是刚刚好。
请参阅图2，检测DNA聚合酶活性的方法的原理示意图，待补平模板包括第一模板链10和第二模板链20，第一模板链10包括第一DNA片段，第二模板链20包括第二DNA片段以及与第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，凸出片段中含有U碱基。第一模板链10和第二模板链20形成双链后，第一DNA片段从5’端到3’端的碱基与第二DNA片段从3’端到5’端的碱基互补。由于第二模板链20含有凸出片段，形成双链后第二模板链20的5’端凸出而第一模板链10的3’端凹陷。在dNTP存在的条件下，待测DNA聚合酶与足量的待补平模板混合，通过待测DNA聚合酶诱导待补平模板中的第一DNA片段延伸形成与凸出片段碱基互补的补平片段。从而得到补平模板30，补平模板30为末端平滑的双链模板。由于待补平模板的量为足量的，待测DNA聚合酶量相对不足，反应后体系中还存在未补平的双链40。
在一个实施方式中，第一模板链从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.1所示，而从3’端到5’端的碱基序列为：
TAGCACCGTTCGACATGAGATAGGCAAGTCGCCGTCGGAAACCGATGCCATCGAGTCGACGAGATAGATAATAAGCTAGAATAATAATATAAA。
第二模板链的序列如SEQ ID No.2所示，在第二模板链中第二DNA片段的从5’端到3’端的碱基序列为：
ATCGTGGCAAGCTGTACTCTATCCGTTCAGCGGCAGCCTTTGGCTACGGTAGCTCAGCTGCTCTATCTATTATTCGATCTTATTATTATATTT。
与第二DNA片段5’端相连接的凸出片段的序列为：
CAUAUAGCAUAUCGAUCGUAGCTG。
如SEQ ID No.1所示的第一模板链以及如SEQ ID No.2所示的第二模板链，第一DNA片段从5’端到3’端的碱基与第二DNA片段从3’端到5’端的的碱基互补。通过待测DNA聚合酶诱导待补平模板中的第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段，该补平片段从3’端到5’端的序列为GTATATCGTATAGCTAGCATCGAC。补平片段从3’端到5’端与凸出片段从5’端到3’端碱基互补。设计的第二模板链和第二模板链长度适宜，凸出片段的碱基数量合适，便于根据该模板链设计适宜的扩增引物和探针。实验结果表明，序列如SEQ ID No.1所示的第二模板链和序列如SEQ ID No.2所示的第二模板链组成的待补平模板能够特异性的结合DNA聚合酶，从而在待测DNA聚合酶的诱导下得到补平模板。
在一个实施方式中，在将待测DNA聚合酶与足量的待补平模板混合的操作之前，还包括将待测DNA聚合酶的样品经过SDS-PAGE跑胶，根据SDS-PAGE测定的蛋白浓度，初步确定样品中DNA聚合酶的酶活性，从而确定待补平模板的量，提高检测的准确性。
在一个实施方式中，检测的DNA聚合酶为T4 DNA聚合酶，T4 DNA聚合酶是由T4噬菌体聚合酶I基因编码，具有5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性。T4 DNA聚合酶是基因工程技术中一种重要的工具酶，在高通量测序(next generation sequencing)文库构建的过程具有重要的作用。本实施方式利用T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性诱导待补平模板中的第一DNA片段的3’端延伸形成与凸出片段的碱基互补的补平片段，从而得到补平模板。补平模板经消化酶酶切去除U碱基后与引物配对，从而进行PCR扩增反应，根据PCR扩增反应的CT值检测DNA聚合酶的活性，检测重现性好，即使0.3×10-6U/μL较低的酶活性依然能够检测出来，灵敏度高。
在一个实施方式中，将待测DNA聚合酶与足量的待补平模板混合的操作中，混合温度为25℃～40℃，反应时间为0.5h～1.5h，例如37℃下反应1h。
S130、将S120中得到的补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，其中正向引物针对凸出片段设计，反向引物针对第一DNA片段的5’端设计，探针用于检测第一DNA片段。
具体地，UDG酶(尿嘧啶-DNA糖基化酶)能够消化双链模板中的U碱基，切去部分凸出片段。请继续参阅图2，补平模板30经UDG酶去除U碱基后，得到扩增模板50。加入正向引物和反向引物后，扩增模板50中由第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段特异性的与正向引物51互补配对，从而进行PCR扩增反应。由于正向引物针对凸出片段设计，反向引物针对第一DNA片段的5’端设计。正向引物能够与第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段互补，反向引物针对第一DNA片段的5’端设计，反向引物能够与第一DNA片段复制后形成的互补链的3’端互补，使得含有第一DNA片段的模板链实现指数扩增。而未补平的双链40经消化酶酶切去除双链模板中的U碱基后，得到一般的DNA双链60，该DNA双链60中不含有补平片段，从而无法与正向引物51配对，即不能进行PCR扩增反应。在足量的待补平模板的条件下，DNA聚合酶的酶活性越高，诱导补平后获得的补平模板30的量越多，酶切后的获得的扩增模板50的量也越多，PCR扩增反应的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数相应的越少，即CT值越小。相反，DNA聚合酶的酶活性越低，诱导补平后获得的补平模板30的量越少，酶切后的获得的扩增模板50的量也越少，PCR扩增反应的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数相应的越多，即CT值越大。将待测DNA聚合酶与相应的DNA聚合酶标准品所经历的循环数比较运算即可获得待测DNA聚合酶的酶活性。
具体地，第一模板链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，第二模板链的碱基序列如SEQ ID No.2所示。经足量的消化酶酶切去除双链模板中的U碱基后，SEQ ID No.2中的CAUAUAGCAUAUCGAUCGU片段被去除。
在一个实施方式中，正向引物的碱基序列与凸出片段中的部分或全部的碱基序列相同，反向引物的碱基序列与第一DNA片段5’端的部分碱基序列相同。正向引物针对凸出片段设计，从而与第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段互补，特异性诱导扩增模板中含有第一DNA片段的这一条DNA单链复制扩增。
反向引物针对第一DNA片段的5’端设计，与第一DNA片段中的部分碱基序列相同。在前期的扩增反应中，能够与少量的第二DNA片段中部分碱基序列互补，诱导扩增模板中含有第二DNA片段的这一条DNA单链复制扩增。之后，反向引物与第一DNA片段复制后形成的互补链的3’端互补，即诱导第一DNA片段的复制后形成的互补链的扩增。正向引物与反向引物配合，使得含有第一DNA片段的模板链实现指数扩增。
具体地，正向引物和反向引物的摩尔比为0.5～2:1，例如1:1。
具体地，正向引物从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.3所示，反向引物从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.4所示。正向引物和反向引物碱基数合理，快速诱导扩增模板进行扩增。
具体地，探针用于检测第一DNA片段，探针的两端分别结合有荧光报告基团和荧光淬灭基团。探针的碱基序列与第一DNA片段中的部分碱基序列相同，探针能够捕获扩增后形成的扩增产物，根据荧光强度实时监控PCR反应的进程。
在一个实施方式中，探针从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.5所示。探针碱基数合理，能够特异性的捕获扩增后形成的扩增产物。
具体地，荧光报告基团结合在探针的5’端，荧光淬灭基团结合在探针的3’端。荧光报告基团例如为FAM(6-羧基荧光素)，荧光淬灭基团例如为BHQ1。
具体地，正向引物、反向引物以及探针的摩尔比为0.5～2:0.5～2：1，例如1：1：1。
在一个实施方式中，将补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应的操作中，除加入正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶外，还包括加入耐高温DNA聚合酶。耐高温DNA聚合酶例如为Hotsart Taq酶，使得DNA扩增过程中保持高保真度。
在一个实施方式中，将补平模板、正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应的操作中，荧光定量PCR扩增反应的热循环条件为：45℃～55℃、20min～40min，1～3个循环，93℃～97℃、5min～15min，1～3个循环；以及90℃～100℃、15s～25s，50℃～60℃、15s～25s，70℃～75℃、25s～35s，35～45个循环。
进一步地，荧光定量PCR扩增反应的热循环条件为：50℃、30min，1个循环；95℃、10min，1个循环；94℃、20s，55℃、20s，72℃、30s，40个循环。具体地，50℃、30min，1个循环使得UDG酶在适宜的条件下去除补平模板中U碱基，得到扩增模板。95℃、10min，1个循环，使得扩增模板中地双链打开。94℃、20s，55℃、20s，72℃、30s，40个循环，PCR循环扩增条件，在PCR循环扩增中能够收集到荧光。
S140、获取实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，将CT值带入由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，得到待测DNA聚合酶的酶活性。
在足量的待补平模板的条件下，DNA聚合酶的酶活性越高，诱导补平后获得的补平模板的量越多，UDG酶切后的获得的扩增模板的量也越多，在PCR扩增反应中，PCR扩增反应的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数相应的越少，即PCR扩增反应的CT值越小。因此通过将待测DNA聚合酶与相应的DNA聚合酶标准品所经历的循环数比较运算即可获得待测DNA聚合酶的酶活性。
具体地，PCR扩增反应的CT值(Cycle)为PCR扩增反应中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段所对应的循环数。研究结果表明，不同酶活性的DNA聚合酶和CT值的对数具有良好的线性关系，因此通过将待测DNA聚合酶与相应的DNA聚合酶标准品经相同的补平条件和酶切条件后获得扩增模板，比较两者扩增模板PCR扩增反应中所经历的循环数即可获得待测DNA聚合酶的酶活性。
在一个实施方式中，由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：将DNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的DNA聚合酶标准品。具体地，进行梯度稀释所用的稀释液例如为TE缓冲液。在dNTP存在的条件下，分别将每一个酶活性的DNA聚合酶标准品与足量的待补平模板混合，得到多个补平模板，其中多个补平模板分别为每一个酶活性的DNA聚合酶标准品对应的补平模板。分别将多个补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应。获取每一个酶活性的DNA聚合酶标准品对应的实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，根据CT值与酶活性的对应关系建立标准曲线。
检测时，将待测DNA聚合酶在对应的在PCR扩增反应中获得的CT值带入标准曲线中运算即可获得待测DNA聚合酶的活性。
上述检测DNA聚合酶活性的方法为非放射性的检测，操作简便。待测DNA聚合酶诱导待补平模板中的第一DNA片段延伸形成与凸出片段的碱基互补补平片段，从而将待补平模板补平形成补平模板。将补平模板、正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应。补平模板中的U碱基被足量的UDG酶消化去除，得到适于PCR扩增的模板，正向引物针对凸出片段设计，反向引物针对第一DNA片段的5’端设计，即正向引物能够结合补平片段，诱导第一模板链扩增。而未经补平的模板由于没有形成补平片段，经消化酶去除U碱基后则无法与正向引物配对，即不能进行PCR扩增反应。根据不同酶活性的DNA聚合酶和PCR扩增反应的CT值与相应的DNA聚合酶标准品的CT值比较运算即可获得待测DNA聚合酶的酶活性。实验结果表明该方法重现性好、灵敏度高，能够实现高通量的检测。
一实施方式的检测DNA聚合酶活性的检测试剂盒包括待补平模板、正向引物、反向引物和探针。
其中，待补平模板包括第一模板链和第二模板链，第一模板链包括第一DNA片段，第二模板链包括第二DNA片段以及与所述第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，第二DNA片段与第一DNA片段碱基互补，凸出片段中含有U碱基。
正向引物针对凸出片段设计，具体地，正向引物的碱基序列与凸出片段中的部分或全部的碱基序列相同。
反向引物针对第一DNA片段的5’端设计，具体地，反向引物的碱基序列与第一DNA片段5’端的部分碱基序列相同。
探针针对第一DNA片段中的部分碱基设计。PCR扩增时，探针用于检测第一DNA片段。探针的碱基序列与第一DNA片段中的部分碱基序列相同。
在一个实施方式中，第一模板链从5’端到3’端的序列如SEQ ID No.1所示，第二模板链从5’端到3’端的序列如SEQ ID No.2所示。设计的第一模板链和第二模板链长度适宜，凸出片段的碱基数量合适，便于根据该模板链设计适宜的扩增引物和探针。实验结果表明，序列如SEQ ID No.1所示的第一模板链和序列如SEQ ID No.2所示的第二模板链组成的待补平模板能够特异性的结合DNA聚合酶，从而在待测DNA聚合酶的诱导下得到补平模板。
具体地，正向引物从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.3所示，反向引物从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
具体地，探针从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
具体地，荧光报告基团结合在探针的5’端，荧光淬灭基团结合在探针的3’端。荧光报告基团例如为FAM(6-羧基荧光素)，荧光淬灭基团例如为BHQ1。
具体地，使用时，正向引物、反向引物以及探针的的摩尔比为0.5～2:0.5～2：1，例如1：1：1。
上述检测试剂盒可用于检测T4 DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种DNA聚合酶的酶活性。
上述检测试剂盒用于检测DNA聚合酶活性时，不需要放射性的试剂，操作简便、快速，检测的重现性好、灵敏度高。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
由T4 DNA聚合酶标准品建立的标准曲线
1.1、提供包括第一模板链和第二模板链的待补平模板，第一模板链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，第二模板链的碱基序列如SEQ ID No.2所示。取10μL的T4 DNA聚合酶标准品(3U/μL)加入90μL的1×TE缓冲液中，进行连续6个10倍梯度稀释，形成6个标准品梯度。分别按下表1配置补平反应体系，补平反应条件为：37℃，1h，补平后得到补平模板。
表1：补平反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 10×T4 DNA聚合酶缓冲液 | 5μL |
| dNTP(10mmol/L) | 0.2μL |
| 待补平模板(0.025μmol/L) | 10μL |
| 梯度稀释T4 DNA聚合酶 | 5μL |
| ddH2O | 补充至总体积为50μL |
其中，T4 DNA聚合酶标准品为商品化T4 DNA聚合酶(NEB-T4 DNA Polymerase)。10×的T4 DNA聚合酶缓冲液的配方如下：NaCl 500mmol/L、Tris-HCl 100mmol/L、MgCl2100mmol/L、DTT 10mmol/L，25℃下pH为7.9。
1.2、取10μL1.1中补平后的体系按下表2配置PCR反应体系，其中，正向引物从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.3所示。反向引物从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.4所示。探针从5’端到3’端的碱基序列如SEQ ID No.5所示，探针的5’端结合有荧光报告基团FAM，3’端结合有荧光淬灭基团BHQ1。
表2：PCR反应体系
1.3、将按表2配置PCR反应体系，每个梯度稀释的样品至少两份样品，置于荧光定量PCR扩增仪中，按下表3设置PCR扩增条件，并实时检测荧光亮度，获得扩增曲线。
表3：PCR扩增条件
不同稀释倍数的T4 DNA聚合酶标准品的PCR后的扩增曲线如图3所示，对应的CT值如下表4。
表4：不同稀释倍数的T4 DNA聚合酶标准品的CT值
从结果可以看出，在足量的待补平模板的条件下，T4 DNA聚合酶的酶活性越高，诱导补平后获得的补平模板的量越多，酶切后的获得的扩增模板的量也越多，PCR扩增反应的对应的CT值越小。相反，T4 DNA聚合酶的酶活性越低，诱导补平后获得的补平模板的量越少，酶切后的获得的扩增模板的量也越少，PCR扩增反应的对应的CT值越大。以T4 DNA聚合酶标准品的酶活性为横坐标，PCR扩增反应对应的CT值为纵坐标用GraphPad Prism5作图得到图4，T4DNA聚合酶标准品的酶活性与CT值呈对数型线性关系，得到曲线方程为y＝-0.876ln(x)+13.235，R2＝0.9982。
实施例2
检测未知T4 DNA聚合酶的酶活性
将待检样品SDS-PAGE跑胶，根据蛋白浓度初步标定待检样品中T4 DNA聚合酶酶活。取10μL待检样品进行100倍稀释，平行稀释8组。根据实施例1中表1配制补平体系，按照表2的PCR反应体系配置PCR反应体系，并根据表3中的PCR扩增条件进行PCR扩增，获取8组样品PCR扩增对应的CT值，结果如表5所示。
表5：T4 DNA聚合酶样品的CT值
| 样品标号 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | 7# | 8# |
| CT值 | 16.67 | 16.68 | 16.61 | 16.65 | 16.67 | 16.62 | 16.58 | 16.6 |
将样品对应的CT值分别带入图4的曲线方程中，推算待检样品中T4 DNA聚合酶的酶活，结果如下表6。
表6：样品中T4 DNA聚合酶的酶活性
通过多次重复实验，并计算曲线的相关系数和待检样品的酶活，我们发现，相关系数和待检样品的酶活多次实验间保持稳定，重现性好。
实施例3
检测不同来源的T4 DNA聚合酶的酶活性
为了进一步验证检测方法的可行性，选择两种商品化T4 DNA聚合酶进行检测，商品化T4 DNA聚合酶1为NEB-T4 DNA Polymerase，商品化T4 DNA聚合酶2为Enzymatics-T4DNA Polymerase。另外还检测自行表达纯化T4 DNA聚合酶的酶活性，自制T4 DNA聚合酶克隆自T4噬菌体DNA聚合酶I基因，克隆至pET28a表达载体并转化大肠杆菌BL21进行表达。表达产物采用常规层析方法纯化至约98％的纯度。
两种商品化的酶和自行表达纯化T4 DNA聚合酶均先用标准放射性同位素掺入法测定，国际单位(IU)定义为：1小时内使1nmol同位素标记的dATP掺入酸不溶性沉淀物所需的酶量定义为1个单位(U)。以放射性同位素标定后的T4DNA聚合酶作为标准品，稀释后按照实施例1的方法获得CT值并绘制标准曲线，如下表7。
表7：不同来源的T4 DNA聚合酶的CT值以及标准曲线的相关系数
其中，商品化T4 DNA聚合酶1曲线方程为：y＝-0.876ln(x)+13.235，R2＝0.9982(参见实施例1，曲线图请参阅图4)。商品化T4 DNA聚合酶2曲线方程为：y＝-0.881ln(x)+13.127，R2＝0.9992，曲线图请参阅图5。自制T4 DNA聚合酶曲线方程为：y＝-0.877ln(x)+13.211，R2＝0.9985，曲线图请参阅图6。
上述结果表明，不同来源的T4 DNA聚合酶的聚合酶均可形成标准曲线，且CT值彼此无明显差异。因此，这种标准曲线方法可作为聚合酶活性标定。
参照实施例2的方法，检测未知T4 DNA聚合酶活性的CT值，每组重复8个样品，结果如下表8。其中未知T4 DNA聚合酶8组样品PCR扩增对应的CT值如表8所示。
表8：未知T4 DNA聚合酶样品的CT值
| 未知样品标号 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | 7# | 8# |
| CT值 | 16.31 | 16.29 | 16.33 | 16.32 | 16.34 | 16.28 | 16.27 | 16.3 |
将未知T4 DNA聚合酶对应的CT值分别带入商品化T4 DNA聚合酶1曲线方程：y＝-0.876ln(x)+13.235，商品化T4 DNA聚合酶2曲线方程：y＝-0.881ln(x)+13.127自制T4 DNA聚合酶曲线方程：y＝-0.877ln(x)+13.211。计算检样品中T4 DNA聚合酶的酶活，结果如下表9。
表9：未知样品中T4 DNA聚合酶的酶活性
上述结果表明，不同来源的T4 DNA聚合酶均可采用上述检测方法进行检测，标准差以及变异系数小，表明检测的重现性好、灵敏度高。以上具体实施例以检测T4 DNA聚合酶的结果为例说明，可以理解，上述检测方法对其他的DNA聚合酶也依然能够检测。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 菲鹏生物股份有限公司、广东菲鹏生物有限公司
<120> 检测DNA聚合酶活性的方法及检测试剂盒
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaatataata ataagatcga ataatagata gagcagctga gctaccgtag ccaaaggctg 60
ccgctgaacg gatagagtac agcttgccac gat 93
<210> 2
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cauauagcau aucgaucgua gctgatcgtg gcaagctgta ctctatccgt tcagcggcag 60
cctttggcta cggtagctca gctgctctat ctattattcg atcttattat tatattt 117
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
catatagcat atcgatcgta gctg 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaatataata ataagatcga ata 23
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tggcaagctg tactctatcc gttcagcggc 30
Claims (10)
1.一种检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供待补平模板，所述待补平模板包括第一模板链和第二模板链，所述第一模板链包括第一DNA片段，所述第二模板链包括第二DNA片段以及与所述第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，所述第二DNA片段与所述第一DNA片段碱基互补，所述凸出片段中含有U碱基；
在dNTP存在的条件下，将待测DNA聚合酶与足量的所述待补平模板混合，使得所述第一DNA片段的3’端延伸形成补平片段，得到补平模板，所述补平片段与所述凸出片段碱基互补；
将所述补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，其中所述正向引物针对所述凸出片段设计，所述反向引物针对所述第一DNA片段的5’端设计，所述探针用于检测所述第一DNA片段；以及
获取所述实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，将所述CT值带入由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，得到所述待测DNA聚合酶的酶活性。
2.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述由DNA聚合酶标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：
将DNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的所述DNA聚合酶标准品；
在dNTP存在的条件下，分别将每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品与足量的所述待补平模板混合，得到多个补平模板，所述多个补平模板分别为每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品对应的补平模板；
分别将所述多个补平模板与正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应；以及
获取每一个酶活性的所述DNA聚合酶标准品对应的实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，根据所述CT值与酶活性的对应关系建立所述标准曲线。
3.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述第一模板链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述第二模板链的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
5.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述探针的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
6.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述将待测DNA聚合酶与足量的所述待补平模板混合的操作中，混合的温度为25℃～40℃，混合的时间为0.5h～1.5h。
7.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述将所述补平模板、正向引物、反向引物、探针、dNTP以及足量的UDG酶混合进行实时荧光定量PCR扩增反应的操作中，所述荧光定量PCR扩增反应的热循环条件为：
45℃～55℃、20min～40min，1～3个循环；
93℃～97℃、5min～15min，1～3个循环；以及
90℃～100℃、15s～25s，50℃～60℃、15s～25s，70℃～75℃、25s～35s，35～45个循环。
8.根据权利要求1所述的检测DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶选自T4DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种。
9.一种检测DNA聚合酶活性的检测试剂盒，其特征在于，包括待补平模板、正向引物、反向引物和探针；
所述待补平模板包括第一模板链和第二模板链，所述第一模板链包括第一DNA片段，所述第二模板链包括第二DNA片段以及与所述第二DNA片段5’端相连接的凸出片段，所述第二DNA片段与所述第一DNA片段碱基互补，所述凸出片段中含有U碱基；
所述正向引物针对所述凸出片段设计；
所述反向引物针对所述第一DNA片段的5’端设计；
所述探针针对所述第一DNA片段中的部分碱基设计。
10.根据权利要求9所述的检测DNA聚合酶活性的检测试剂盒，其特征在于，所述第一模板链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述第二模板链的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示，所述探针的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
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