CN104357543A - 一种Poly (A)聚合酶活性测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非放射性的Poly(A)聚合酶活性测定方法，所述方法包括：首先根据单链模板合成引物，然后进行PAP酶催化的加尾反应，反应完成后与单链模板退火，随后在足量没有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶存在下进行聚合反应生成双链DNA，最后测定聚合反应完成后反应体系中双链DNA的相对量，并利用该检测结果推导出Poly(A)聚合酶活性程度，其中所用单链模板上引物3’方向上的碱基不是t。本发明的方法不采用放射性元素，没有放射性污染，操作步骤简单快速，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种Poly (A)聚合酶活性测定方法。
背景技术
Poly(A)聚合酶(Poly(A)polymerase，PAP)是一种特殊的RNA聚合酶。该酶可不依赖模板特异性的催化三磷酸腺甘(ATP)，逐个聚合至单链RNA片段的3’-OH端上，其反应方程式为：
PAP是基因工程技术，特别是microRNA研究中一种重要的工具酶。microRNA是一种长度在21nt左右的单链RNA，没有成熟的mRNA中常见的poly A尾巴。PAP可以在microRNA的3’-OH末端加上长度不一的poly A尾巴，这样就可以universal-oligo dT为引物与加上的poly A尾巴结合进行逆转录；再用特异的正向引物与universal反向引物进行PCR，从而实现microRNA的检测，其原理如图1所示。
PAP加尾反应是上述流程的第一步，也是最关键的步骤。因此，准确测定PAP酶的活性，保证批次活性的稳定性，对于microRNA检测试剂盒的性能和质量具有至关重要的意义。
标准的PAP酶活力测定法采用放射性底物掺入法，即采用以3H标记的ATP为底物，经PAP催化使其掺入到oligo(rA)15上，其反应式如下：
通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出PAP酶的活性。这种方法关键在于掺入产物和标记ATP的分离。三氯乙酸TCA可使oligo(rA)15沉淀，而标记的ATP不被沉淀；将TCA处理的产物加在whatman滤纸上，就可以实现掺入产物和标记ATP的分离。再经过洗涤、干燥、洗脱，最后测定放射性同位素或者荧光强度。因此，“掺入法”存在易产生放射性污染、步骤多、周期长的 缺陷，难以实现高通量、自动化。
发明内容
本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的PAP酶测活方法。本发明摈弃了传统的“掺入法”，采用了一种全新的“转化法”，其原理如图2所示。
具体来说，本发明采用了以下技术方案：
一种Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根据单链模板合成引物，然后进行PAP酶催化的加尾反应，反应完成后与单链模板退火，随后在足量没有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶存在下进行聚合反应生成双链DNA，最后测定聚合反应完成后反应体系中双链DNA的相对量，并由该检测结果推导出Poly (A)聚合酶活性程度，其中所用单链模板上引物3’方向上第一位的碱基不是t。
优选地，反应体系中双链DNA的相对量是利用荧光染料，例如仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，利用荧光法检测得到的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
在一个实施方案中，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。更优选，所采用的荧光染料是picogreen染料。
优选地，所采用的单链模板是单链环状DNA模板。更优选，所采用的单链模板是M13噬菌体单链DNA。因此，在一个实施方案中，所用的引物是5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’。并且据此可以建立一套标准的测定方法。
在一个实施方案中，所采用的DNA聚合酶是Klenow DNA聚合酶exo-突变体，即突变致使3’-5’外切酶活性缺失的Klenow大片段。
本发明的优点：
1. 无放射性污染；
2. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的活性测定。
3. 灵敏度高，可检测到0.1 U的PAP活性。
附图说明
图1是采用PAP测定microRNA的原理图。
图2是本发明的Poly (A)聚合酶活性测定方法的原理图。
图3是本发明方法的一个实施例中PAP活性与荧光强度的关系图。
图4是本发明方法的另一个实施例中PAP活性与荧光强度的关系图。
具体实施方式
本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的PAP酶测活方法。本发明摈弃了传统的“掺入法”，采用了一种全新的“转化法”，如图2所示。PAP酶可在单链RNA引物的末端加上数量不等的AMP，形成ssRNA-(rA)n产物。加入单链DNA模板，例如M13 ssDNA后，单链RNA引物可与其形成末端匹配的模板/引物，例如M13模板/引物复合物，而ssRNA-(rA)n与其形成末端不匹配的模板/引物，例如M13模板/错配引物复合物。无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶可以M13模板/引物复合物为底物，进行聚合反应，生成M13双链DNA。M13双链DNA可被双链特异性的picogreen染料结合，产生荧光。而M13模板/错配引物复合物不能作为无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶的底物；picogreen染料不能结合单链DNA，从而不能产生荧光。
PAP酶的活性在一定范围内同M13模板/错配引物复合物的量成正比；而在DNA聚合酶活性一定的情况下，M13模板/错配引物复合物的量同荧光强度成反比。因此，本发明将PAP的测活体系同DNA聚合酶测活体系偶联起来。
本发明测定方法的反应体系如下建立：
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
单链RNA引物：M13引物5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’；
1. PAP反应：
2. 聚合酶反应：
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 30分钟 |
| 4℃ | 保持 |
3. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。
4. 标准曲线绘制及待测样品酶活计算：
标准品活力单位(U)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。根据待测样品荧光强度，软件即可自动回算出待测样品的酶活(U/μl)。
下面将结合具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例1. “转化法”测定PAP活性的可行性验证
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
单链RNA引物：M13引物5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’；
M13错配引物5’-aagccatccgcaaaaatgacctctaaa-3’ (下划线表示3个a与模板不匹配)；
PAP：NEB M0276S，来源自重组大肠杆菌（E. coli）菌株，携带克隆自大肠杆菌的Poly(A)聚合酶基因。
PAP反应：
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 30分钟 |
| 4℃ | 保持 |
DNA聚合酶反应：
*1-12号管加入对应管号的PAP反应产物。
| 温度 | 时间 |
| 37℃ | 30分钟 |
| 4℃ | 保持。 |
picogreen荧光检测
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
| 管号 | 荧光数值 |
| 1 | 1129 |
| 2 | 1130 |
| 3 | 1124 |
| 4 | 1111 |
| 5 | 1030 |
| 6 | 997 |
| 7 | 872 |
| 8 | 722 |
| 9 | 418 |
| 10 | 322 |
| 11 | 265 |
| 12 | 203 |
| 13 | 1202 |
| 14 | 213 |
这一结果表明：
a. 模板/引物复合物可被klenow DNA聚合酶exo-酶催化聚合反应，生成M13双链DNA；
b. 由于M13错配引物的3’末端同M13单链DNA模板是不匹配的，因此klenow DNA聚合酶exo-酶不能催化其生成M13双链DNA；
c. PAP可以在单链RNA引物的3’末端按照不依赖模板的方式加上若干个AMP（这一性质是本领域研究者所熟知的），造成其末端与M13 ssDNA模板不匹配，即将模板/引物复合物转化成为M13模板/错配引物复合物。在一定范围内，PAP的活性与M13模板/错配引物复合物的量成正相关，而M13模板/错配引物复合物的量又显然与picogreen荧光强度成负相关，因此PAP的活性与荧光强度成负相关，这点已被上表的结果所证明。
通过本实施例，我们将PAP反应同DNA聚合酶反应偶联起来，可以实现对PAP活性的快速、简便的表征，为后续PAP活性的精确测定奠定了基础。本方法的原理如图2所示。
实施例2. PAP活性-荧光强度曲线的绘制及EC50计算
以2#-12#的PAP活性单位单位(U)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现，这些数据点可以很好地拟合出一条倒S型曲线，如图3所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度 (EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：
| 实验 | EC50 (U) |
| 1 | 6.84 |
| 2 | 6.72 |
| 3 | 6.50 |
| 4 | 7.23 |
| 5 | 6.93 |
| 平均值 (U) | 6.84 |
| 标准差SD (U) | 0.24 |
| 变异系数 CV (%) | 3.52 |
因此，这一EC50值可作为本方法即“转化法”的活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的PAP酶量定义为1个转化法单位（Transformation Unit, TU）；1 TU=6.84 IU。
实施例3. 基因工程重组大肠杆菌PAP酶活性测定
基因克隆自大肠杆菌BL21基因组，构建到常规的大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌并诱导表达。采用标准层析手段纯化。SDS-PAGE检测纯度>95%，蛋白浓度为0.2μg/μl.
将酶从0.2 μg/μl两倍稀释11个梯度。按照实施例1的方法，进行“转化法”测活反应。以加入到反应体系中的原液体积(μl)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制酶量-荧光强度曲线并计算EC50。结果如图4所示。
EC50=0.12μl。则酶的活性浓度为8.33 TU/μl=57 IU/μl。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (8)
1. 一种Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根据单链模板合成引物，然后进行PAP酶催化的加尾反应，反应完成后与单链模板退火，随后在足量没有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶存在下进行聚合反应生成双链DNA，最后测定聚合反应完成后反应体系中双链DNA的相对量，并通过该检测结果推导出Poly (A)聚合酶活性程度，其中所用单链模板上引物3’方向上第一位的碱基不是t。
2. 如权利要求1所述的Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，反应体系中双链DNA的相对量是利用仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，利用荧光法检测得到的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
3. 如权利要求2所述的Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述荧光染料是picogreen染料。
5. 如权利要求1所述的Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的单链模板是单链环状DNA模板。
6. 如权利要求5所述的Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的单链模板是M13噬菌体单链DNA。
7. 如权利要求6所述的Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所用的引物是5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’。
8. 如权利要求1所述的Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所采用的DNA聚合酶是Klenow DNA聚合酶exo-突变体。
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