CN104293927A - 一种尿嘧啶-dna糖基化酶活性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法，所述方法包括如下步骤：首先是PCR扩增反应：以双链DNA为模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶进行聚合反应，进行扩增，生成含有dU的扩增产物UDNA双链；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反应：扩增产物经受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量碱基缺失的DNA链；最后测定反应体系中单链DNA产物或UDNA双链的相对量，并根据测定结果推导出尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度与反应体系中UDNA双链的量成反比，而与单链DNA产物的量成正比。本发明方法无放射性污染，操作简单便捷，灵敏度高，可以定量检测，并且稳定。

Description

一种尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法。
背景技术
UDG酶，即尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil-DNA Glycocasylase）。UDG的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。UDG是细胞内DNA损伤修复系统中一种重要的组分，在自然界广泛存在，包括细菌、真核生物、人细胞中都有UDG酶表达。
UDG在PCR防污染方面具有非常重要的作用。PCR反应最常见，最重要的污染物是PCR扩增产物污染。因为PCR灵敏度非常高，可到单拷贝。因此如果即使痕量的扩增产物污染了模板，也会导致假阳性出现。目前常用的做法是在PCR反应体系中加入UDG，并以dUTP取代dTTP，这样PCR产物都是含有dU的DNA链。在PCR开始前增加一步较低温度的孵育步骤，UDG酶即可将反应体系中可能存在的上一轮的含有U-DNA的扩增产物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。同时UDG酶被灭活,不会再降解新扩增的产物U-DNA。
尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)活性测定通常采用20世纪80年代初建立的同位素法，其原理大致为：UDG可将同位素标记的尿嘧啶从DNA或寡核苷酸上切下．当DNA或寡核苷酸用三氯醋酸沉淀时，切下的尿嘧啶仍然留在溶液中，用液闪计数。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。
发明内容
本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)测活方法。本发明原理如图1所示。
具体来说，本发明采用如下技术方案：
一种尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：首先是PCR扩增反应：以双链DNA为模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶进行聚合反应，进行扩增，生成含有dU的扩增产物UDNA双链；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反应：扩增产物经受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量碱基缺失的DNA链；最后测定反应体系中单链DNA产物或UDNA双链的相对量，并根据测定结果推导出尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度与反应体系中UDNA双链的量成反比，而与单链DNA产物的量成正比。
优选地，双链UDNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链UDNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料，例如可在市面上商购获得的picogreen染料。
优选地，所采用的双链DNA模板是λDNA，以便建立标准测定方法。
本发明的优点：
1. 无放射性污染；
2. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的活性测定。
3. 灵敏度高，可以定量检测UDG酶的活性，并且稳定。
附图说明
图1是本发明测定方法的原理图。
图2是本发明测定方法获得的酶活-荧光曲线图。
具体实施方式
本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)测活方法。本发明原理如图1所示。
如图1所示，λDNA可以在dU/A/G/CTP存在的条件下被Taq酶聚合生成UDNA，UDG酶可以水解断裂含有dU的UDNA中的尿嘧啶糖苷键，形成有大量缺失碱基的DNA链，picogreen染料不能结合这种产物，从而不能产生荧光；但是不经过UDG酶作用的UDNA链，则还是保持UDNA双链结构，它可以被picogreen染料结合，产生荧光。
UDG酶的活性在一定范围内与单链DNA产物的量成正比，因此其活性就可以用Picogreen荧光强度来进行测定。
本发明的测定方法包含以下方面：
1. UDNA的制备
引物F：5’-cggatcgccacactcacaacaat-3’;
引物R：5’-aaaggccgggaaatacccagcc-3’;
PCR模板：λ DNA 
PCR反应：
组分 体积
DDW 至50μl
10x Taq缓冲液 5
dU/A/G/CTP混合物 1μl
引物F (10 μM) 2μl
引物R (10 μM) 2μl
λ DNA 10 ng
Taq酶 1 U
PCR产物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀的方式纯化。纯化的PCR产物用A260测定浓度。
2.UDG反应：
组分 体积
DDW 至50μl
10 x Taq缓冲液 5
UDNA 100 ng
UDG 1mU-1024mU
温度 时间
25℃ 30分钟
4℃ 保持
3. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。
5. 标准曲线绘制及待测样品酶活计算：
标准品活力单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。根据待测样品荧光强度，软件即可自动回算出待测样品的酶活 (mU/μl)。
下面将结合具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1. 荧光法测定UNG活性方法的建立
1. UDNA的制备
引物F：5’-cggatcgccacactcacaacaat-3’;
引物R：5’-aaaggccgggaaatacccagcc-3’;
PCR模板：λ DNA
PCR反应：
组分 体积
DDW 至50μl
10x Taq缓冲液 5
dU/A/G/CTP mix 1μl
引物F (10 μM) 2μl
引物R (10 μM) 2μl
λ DNA 10 ng
Taq酶 1 U
PCR产物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀的方式纯化。纯化的PCR产物用A260测定浓度。
2.UDG反应：
UDG为NEBM0280L
组分 体积
DDW 至50μl
10 x Taq缓冲液 5
UDNA 100 ng
UDG 1mU-1024mU
温度 时间
25℃ 30分钟
4℃ 保持
3. picogreen荧光检测：
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
UDG (mU) 荧光数值
1024 65.
512 65.
256 70.
128 96.
64 173.
32 372.
16 618.
8 856.
4 997.
2 1063.
1 1064.
0 1067.
这一结果表明，UDG酶可以水解断裂含有dU的UDNA中的尿嘧啶糖苷键，且水解程度呈现剂量依赖性。
以UDG活性单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现这些数据点可以很好地拟合出一条倒S型曲线，如图2所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度(EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：
实验 EC50 (mU)
1 18.25
2 18.49
3 17.97
4 18.14
平均值 (U) 18.21
标准差SD (U) 0.22
变异系数 CV (%) 1.20
因此，这一EC50值可作为本方法的活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的UDG酶量定义为1个荧光法单位（Fluoresence Unit, FU）；1 FU=18.21 mU。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (5)

1. 一种尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：首先是PCR扩增反应：以双链DNA为模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶进行聚合反应，进行扩增，生成含有dU的扩增产物UDNA双链；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反应：扩增产物经受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量碱基缺失的DNA链；最后测定反应体系中单链DNA产物或UDNA双链的相对量，并根据测定结果推导出尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度与反应体系中UDNA双链的量成反比，而与单链DNA产物的量成正比。
2. 如权利要求1所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法，其特征在于，双链UDNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链UDNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
3. 如权利要求2所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是picogreen染料。
5. 如权利要求1所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性测定方法，其特征在于，所采用的双链DNA模板是λDNA。
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