CN104293930A

CN104293930A - 一种3’-5’外切酶活性测定方法

Info

Publication number: CN104293930A
Application number: CN201410502154.0A
Authority: CN
Inventors: 徐晓昱; 王静
Original assignee: VAZYME BIOTECH (NANJING) Co Ltd
Current assignee: Nanjing novozan Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2034-09-28
Also published as: CN104293930B

Abstract

本发明公开了一种非放射性的3’-5’外切酶活性测定方法，所述方法包括：首先根据单链模板合成有3’错配的引物，将引物与单链模板混合并退火，接着在该反应液中加入3’-5’外切酶活性进行3’碱基外切反应，然后加入足量没有3’-5’外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA，随后检测反应体系中双链DNA的相对量，由该检测结果推导出外切酶活性程度。该方法与现有技术方法相比，无放射性污染，操作步骤简单快速，可以实现高通量的自动化活性测定，可以用来筛选针对3’-5’外切酶的封闭活性。

Description

一种3’-5’外切酶活性测定方法

技术领域

本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种3’-5’外切酶活性测定方法。

背景技术

Pfu DNA聚合酶（简称Pfu）是一种来源于嗜热菌强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的高度热稳定的DNA聚合酶。Pfu具有两种活性：5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性（或称校对活性）。Pfu的3’-5’外切酶活性非常强，可以降解DNA合成链中碱基错配的核苷酸，大大增加了碱基配对的正确率，保证了DNA合成的高度忠实性。因此，该酶是目前耐热DNA聚合酶中保真度最高的酶，适合使用在那些需要高精确度的PCR应用中，包括克隆、基因表达和突变分析。

Pfu的高3’-5’外切酶活性虽然可以带来高的保真度，但同时也会引起一些副作用。3’-5’外切酶活性会降解引物，特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以，在配制PCR反应体系时，最好在冰上操作，且Pfu必须是最后加入到反应体系中，并立即进行PCR反应。另外，Pfu扩增产物为平端。如果需要进行TA克隆的话，需要首先将PCR产物纯化，去掉Pfu，再进行加A尾反应；否则，Pfu的3’-5’外切酶活性会将加上的A切掉，导致TA克隆失败。因此，业内一直希望找到一种可逆的封闭Pfu 3’-5’外切酶活性的方法，旨在不改变Pfu高保真度的前提下，减少甚至消除3’-5’外切酶活性带来的副作用，以提高Pfu相关应用的便利性。

但是找到在找到相应的封闭活性方法之前，首先要解决的一个问题是如何建立3’-5’外切酶活性的方法。标准的测活方法采用放射性同位素法，即首先合成一条3’末端带³H标记dATP的单链寡核苷酸。3’-5’外切酶活性可将[³H]-dATP切除。再经过TCA沉淀、过滤，通过测定酸可溶性物质中放射性的含量，计算3’-5’外切酶活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化，因此为筛选带来了困难。

发明内容

本发明建立了一种简便、快速、非放射性的3’-5’外切酶测活方法，利用该方法，可以快速大量的筛选目标产物，为寻找针对该3’-5’外切酶活性的封闭试剂提供了一种可靠简便的途径。

具体来说，本发明采用的技术方案如下：

一种3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根据单链模板合成有3’错配的引物，将引物与单链模板混合并退火，接着在该反应液中加入3’-5’外切酶活性进行3’碱基外切反应，然后加入足量没有3’-5’外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA，随后检测反应体系中双链DNA的相对量，并根据检测结果推导出3’-5’外切酶活性程度。

其中，反应体系中双链DNA的相对量可以通过检测双链DNA的量或者单链DNA的量而得到。

优选地，反应体系中单链DNA的存在量的检测是利用仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，更优选采用双链DNA特异性荧光染料，在一个实施方案中，本发明方案中采用的是当前在本领域中已经成熟使用的商购picogreen染料。在此，双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。

本发明测定方法中所采用的单链模板可以选用任何适合的单链模板，优选采用环状单链DNA，这样在聚合反应结束后，可以得到闭合的环状双链体，处理技术成熟，并且环状双链体可以避免对后续测量的干扰。在一个优选实施方案中，所采用的单链模板是M13噬菌体单链DNA，简称M13。M13是在生化技术中广泛使用的一种单链DNA载体，因此可以此为基础建立一种标准的测量技术。

所述测定方法中错配引物中3’错配的数目优选是1个。

在一个优选实施方案中，所采用的引物序列是5’-aagccatccgcaaaaatgacctcta-3’，其中加下划线的碱基表示错配碱基。

所加入的没有3’-5’外切酶活性的聚合酶可以采用任何适合的DNA聚合酶，在一个优选实施方案中，所采用的没有3’-5’外切酶活性的聚合酶是指Taq酶。

在另一实施方案中，所要测定的3’-5’外切酶活性是指具有3’-5’外切酶活性的Pfu酶。

本发明的优点：

1.无放射性污染；

2.操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的活性测定；

3.可以用来针对3’-5’外切酶活性进行阻断活性筛选。

附图说明

图1是本发明的测定方法的原理图。

图2是外切酶活性与荧光强度之间的关系图。

具体实施方式

要筛选到针对3’-5’外切酶活性的封闭试剂，例如单克隆抗体，必须首先建立测定3’-5’外切酶活性的方法。标准的测活方法采用放射性同位素法，即首先合成一条3’末端带³H标记dATP的单链寡核苷酸。3’-5’外切酶活性可将[³H]-dATP切除。再经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸可溶性物质中放射性的含量，计算3’-5’外切酶活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。

本发明建立了一种简便、快速、非放射性的3’-5’外切酶测活方法，其原理如图1所示。

首先制备一种末端不匹配的模板/引物，例如M13模板/错配引物复合物。3’-5’外切酶活性可将末端不匹配的碱基切除，从而将末端不匹配的模板/引物如M13模板/错配引物复合物转化为末端匹配的模板/引物复合物如M13模板/引物复合物。无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶可以M13模板/引物复合物为底物，进行聚合反应，生成M13双链DNA。M13双链DNA可被双链特异性的picogreen染料结合，产生荧光。而M13模板/错配引物复合物不能作为无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶的底物；picogreen染料不能结合单链DNA，从而不能产生荧光。

3’-5’外切酶的活性在一定范围内与M13模板/引物复合物的量成正比；而在DNA聚合酶活性一定的情况下，M13模板/引物复合物的量同荧光强度成正比。因此，本发明将3’-5’外切酶的测活体系同DNA聚合酶测活体系偶联起来。

下面将结合具体实施例来详细说明本发明。

实施例1

1. M13模板/引物复合物的制备：

M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；

引物：M13引物5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’；

M13模板/引物复合物：将M13mp18单链DNA同M13引物按摩尔比1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。

2. M13模板/错配引物复合物的制备：

M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；

引物：M13错配引物 5’-aagccatccgcaaaaatgacctcta-3’;（下划线表示该碱基与模板不匹配）

M13模板/错配引物复合物：将M13mp18单链DNA同M13错配引物按摩尔比1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。

3. 3’-5’核酸外切酶反应：

4. DNA聚合酶反应：

*1-12号管加入对应管号的3’-5’外切酶反应产物。

5. picogreen荧光检测

向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：

这一结果表明：

a. M13模板/引物复合物可被Taq酶催化聚合反应，生成M13双链DNA (13#)；

b. 由于M13错配引物的3’末端同M13单链DNA模板是不匹配的，因此Taq酶不能催化其生成M13双链DNA (14#)；

c. 3’-5’外切酶活性可将末端不匹配的碱基切除，从而将M13模板/错配引物复合物转化为末端匹配的M13模板/引物复合物。在一定范围内，3’-5’外切酶活性与M13模板/引物复合物的量成正相关，而M13模板/引物复合物的量又显然与picogreen荧光强度成正相关，因此3’-5’外切酶的活性与荧光强度成正相关，这点已被上表的结果所证明。

d. 15号数值与13号相比没有明显差异，说明聚合酶反应体系中的Taq酶量是足量的；上一步反应带入的Pfu酶的聚合酶活性不会对第二步的反应产生明显影响。因此，最终荧光强度只与3’-5’外切酶活性相关。

通过本实施例，我们将3’-5’外切酶反应同DNA聚合酶反应偶联起来，可以实现对3’-5’外切酶活性的快速、简便的表征，为后续3’-5’外切酶活性的精确测定奠定了基础。本方法的原理如图1所示。

实施例2. 3’-5’外切酶活性-荧光强度曲线的绘制及EC50计算

以2#-12#的Pfu活性单位单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现，这些数据点可以很好地拟合出一条S型曲线，如图2所示。

通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度(EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：

平均值 (mU)	17.75
		标准差SD (U)	0.47
变异系数 CV (%)	2.65

因此，这一EC50值可作为本方法中Pfu 3’-5’外切酶活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的酶量定义为1个3’-5’外切酶活性单位（exo unit）；1 exo U= 17.75 mU (polymerase unit)。

上面结合附图和具体实例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims

1. 一种3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根据单链模板合成有3’错配的引物，将引物与单链模板混合并退火，接着加入3’-5’外切酶活性进行3’碱基外切反应，然后加入足量没有3’-5’外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA，随后检测反应体系中双链DNA的相对量，并根据检测结果推导出3’-5’外切酶活性程度。

2. 如权利要求1所述的3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，反应体系中双链DNA的相对量的测量是利用仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，通过荧光法检测得到的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。

3. 如权利要求2所述的3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。

4. 如权利要求3所述的3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，所述荧光染料是picogreen染料。

5. 如权利要求1所述的3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，所采用的单链模板是环状单链DNA模板。

6. 如权利要求5所述的3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，所用模板是M13噬菌体单链DNA。

7. 如权利要求1所述的3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，错配的数目是1个。

8. 如权利要求6所述的3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，所用引物序列是5’-aagccatccgcaaaaatgacctcta-3’。