CN109652501A

CN109652501A - 一种检测核酸酶对特定碱基3′-5′外切活性的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN109652501A
Application number: CN201710948000.8A
Authority: CN
Inventors: 李长英; 章文蔚; 陈奥; 徐崇钧; 龚梅花; 王静静; 罗银玲; 罗宇芬
Original assignee: Shenzhen Hua Made Dazhi Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Hua Made Dazhi Technology Co Ltd
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2037-10-12
Also published as: CN109652501B

Abstract

本发明公开了一种检测核酸酶对特定碱基3'‑5'外切活性的方法和试剂盒。本发明首次提出检测酶对特定碱基的外切活性；利用该发明可以检测任一碱基，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP以及简并碱基等，应用范围十分广泛；该发明可以检测大多数核酸酶的3’‑5’外切活性；使用荧光作为检测信号，避免了放射性污染，且灵敏度高；无需荧光基团修饰的核苷酸链，成本低；可以用来快速大量地筛选核酸酶，应用灵活，通量高。

Description

一种检测核酸酶对特定碱基3′-5′外切活性的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性的方法和试剂盒。

背景技术

很多核酸酶具有3’-5’的外切活性。检测核酸酶3’-5’外切活性对于了解 DNA聚合酶的校正能力、DNA外切酶的降解速率等具有重要意义。核酸酶对不同碱基(包括各种修饰碱基、简并碱基等)的外切能力不同，对碱基在正确配对和不同形式的错误配对情况下的外切能力也不同。研究核酸酶对某一特定碱基的外切活性对分子生物学研究和药物研发等均有重要意义。

现有的检测3’-5’外切酶活性的技术多是需要放射性标记、凝胶电泳、酶联免疫吸附反应或者合成带荧光基团和淬灭基团的探针等，操作复杂、成本高而且易污染。同时现有的技术不能检测核酸酶针对任一特定碱基的外切活性。

利用放射性同位素检测核酸酶3’-5’外切活性是常用的方法。通过合成一条 3'末端带³H标记核苷酸的寡核苷酸链，利用核酸酶3'-5'外切活性切除该放射性同位素标记的碱基，然后经过一系列复杂的沉淀、过滤等步骤，最后通过测定放射性的含量计算3'-5'外切酶活性。

有研究人员(专利CN104293930 A，一种3'-5'外切酶活性测定方法)将3'端有错配碱基的引物与单链模板混合并退火，加入酶进行3'碱基外切反应，然后加入足量没有3'-5'外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA，通过检测反应体系中双链DNA的相对量来推导出外切酶活性程度。

有研究人员(专利CN104293917 B，用于具有3’-5’外切活性的核酸酶检测的硫代探针)通过发明一种具有茎环结构的硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针来检测核酸酶的3’-5’外切活性。该探针环部是单链结构，颈部则是双链结构，每两个碱基之间的磷酸二酯键全部硫酰化，只有3’末端的碱基不硫酰化，同时3’末端碱基链接有荧光基团，3’-5’的第四个碱基上含有淬灭基团。在没有目标酶存在时荧光基团与淬灭基团靠近，没有荧光信号，当酶切除了3’端碱基之后荧光基团与淬灭基团远离，荧光信号恢复。通过检测荧光信号来检测酶的外切活性。

放射性同位素法易产生污染，且操作复杂，周期长，难以实现高通量、自动化。专利CN104293930 A中对于外切活性特别高的或者特别低的酶检测结果不能十分准确，所以具有一定的局限性，同时也不能准确地检测出核酸酶对某一个特定碱基的外切活性。专利CN104293917 B需要合成有茎环结构且带有淬灭基团和荧光基团的探针，成本高，同样无法检测核酸酶对某一个特定碱基的外切活性，尤其是由于3’端最后一个碱基带有荧光基团，限制了所能检测的修饰碱基的范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测不同的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)根据含有已知序列的单链DNA分子设计合成与所述已知序列互补的引物；该引物中按照5’-3’的顺序倒数第二个碱基和倒数第三个碱基之间的磷酸二酯键作防止外切酶外切修饰，5’端碱基用防止外切酶外切修饰，3’端最后一个碱基为特定碱基；

所述含有已知序列的单链DNA分子上设有碱基甲和碱基乙；所述碱基甲为所述已知序列中与所述特定碱基对应配对的碱基；所述碱基乙为所述已知序列中从 5’端起所述碱基甲上游紧邻的第一个碱基；所述碱基甲和所述碱基乙不同；

2)将固定在固定相上的所述含有已知序列的单链DNA分子与所述引物杂交，再用不同的待测核酸酶酶切杂交的产物，得到酶切产物；

3)向所述酶切产物中引入DNA聚合酶和荧光修饰目标dNTP,聚合反应，根据聚合反应产生的荧光信号来判断所述不同的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性；

所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基甲或所述碱基乙互补。

上述方法中，

所述含有已知序列的单链DNA分子上还设有碱基丙；

所述碱基丙为所述已知序列中从5’端起所述碱基甲上游紧邻的第二个碱基；

所述碱基乙与所述碱基丙相同或不同；

若所述碱基乙与所述碱基丙相同，则所述荧光修饰目标dNTP的糖环上3’羟基做阻断修饰。

上述方法中，

所述特定碱基为可切除的碱基；

或所述特定碱基为可切除的碱基，所述可切除的碱基具体为天然碱基、简并碱基、正确碱基、错配碱基或非防止外切酶外切修饰的修饰碱基。

上述方法中，

所述固定在固定相上的含有已知序列的单链DNA分子的裸露末端碱基进行防止外切酶外切修饰。

上述方法中，

针对碱基的所述防止外切酶外切修饰为磷酸化修饰、硫代修饰或其他防止外切的修饰方式；

针对磷酸二酯键的所述防止外切酶外切修饰为硫酰化或甲基化修饰。

上述方法中，

所述根据聚合反应产生的荧光信号来判断所述不同的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性为如下：

当所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基甲互补时，比较所述不同的待测核酸酶中任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号强的待测核酸酶的对特定碱基3'- 5'外切活性大于荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性；

或当所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基乙互补时，比较所述不同待测的核酸酶中任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'- 5'外切活性大于荧光信号强的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性。

本发明另一个目的是提供一种定量检测待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：以已知酶活性的核酸酶作为参照，按照上述的方法的步骤1)-3)分别检测所述已知酶活性的内参核酸酶的荧光强度和所述待测核酸酶荧光强度；再通过计算该待测核酸酶荧光强度与所述内参核酸酶的荧光强度的比值，得到该待测核酸酶的对特定碱基3'-5'外切酶活。

本发明第三个目的是提供一种检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述方法中的所述含有已知序列的单链DNA分子和所述引物。

上述试剂盒还包括上述方法中的所述DNA聚合酶和上述方法中的所述荧光修饰目标dNTP。

上述的试剂盒在检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂盒在定量检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活大小中的应用也是本发明保护的范围。

上述中，所述含有已知序列的单链DNA分子大小为15-1000bp,所述已知序列的大小为15-1000bp。

所述碱基甲为所述已知序列中与所述特定碱基对应配对的碱基，即为所述已知序列中与所述特定碱基正确配对或错误配对的碱基。

所述固相为芯片或磁珠。

所述特定碱基为1个或多个碱基；

或所述不同的待测核酸酶为大于等于2个待测核酸酶。

本发明的实验证明，本发明首次提出检测酶对特定碱基的外切活性；利用该发明可以检测任一碱基，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP，以及简并碱基等，在正确配对和错误配对情况下核酸酶对其3’-5’的外切活性，应用范围十分广泛；该发明可以检测大多数核酸酶的3’-5’外切活性；使用荧光作为检测信号，避免了放射性污染，且灵敏度高；无需荧光基团修饰的核苷酸链，成本低；可以用来快速大量地筛选核酸酶，应用灵活，通量高。

附图说明

图1为检测核酸酶对特定碱基3'-5'的外切活性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性大小的方法的建立

一、检测原理

如图1所示，

1)用一段固定在固相上的含有已知序列的单链DNA分子作为模板，如利用链霉亲和素和生物素固定在磁珠上的寡聚核苷酸或用点样仪点在芯片上的寡聚核苷酸等，该含有已知序列的单链DNA分子的裸露端需进行防止外切酶酶切修饰，如磷酸化修饰、硫代修饰等(如图1a)；

根据实验需求设计一段与已知序列部分互补的引物，该引物中按照5’-3’的顺序倒数第二个碱基和倒数第三个碱基之间的磷酸二酯键作硫酰化修饰，5’端用磷酸化修饰，3’端最后一个碱基根据实验目的设计成天然碱基、简并碱基、正确碱基、错配碱基或非防止外切的修饰碱基等。

2)将该引物与含有已知序列的单链DNA分子杂交退火(如图1b)，再加入不同的待测核酸酶，使其发挥3’-5’的外切活性，切除掉引物最后一个碱基。由于引物序列的3’端倒数第二个碱基和倒数第三个碱基之间的磷酸二酯键用了硫酰化修饰，所以核酸酶切掉最后一个碱基就会停止3’-5’的切除，同时引物的5’端和固相上模板的裸露端都已经作了防止外切的修饰所以待测酶不会切除掉引物和模板(如图1c，exo是待测核酸酶)。

注意在设计引物时，被切除的碱基对应的模板上的碱基不能与其5’端上游紧邻的第一个碱基相同，且其5’端上游紧邻的第一个碱基不能与5’端上游紧邻的第二个碱基相同，如果5’端上游紧邻的两个碱基相同，则需要将后续检测用到的荧光修饰目标dNTP糖环上3’羟基做阻断修饰。

3)切除完成之后，根据模板序列加入DNA聚合酶和被切除的碱基处能与模板准确配对的带荧光的脱氧核糖核苷酸或被切除的碱基后一个能与模板准确配对的带荧光的脱氧核糖核苷酸，利用DNA聚合酶的聚合能力，将带荧光的dATP或dCTP 或dGTP或dTTP聚合到引物上(如图1d)，最后采集荧光信号，根据荧光信号来判断酶外切活性的强弱；

如果加入的碱基在被切除的碱基的位置，比较任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号强的待测核酸酶(表明加入的碱基发生聚合)对特定碱基3'-5'外切活性大于荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性。

或，如果加入的碱基在被切除碱基之后，比较任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号弱的待测核酸酶(表明加入的碱基没有发生聚合)对特定碱基3'- 5'外切活性大于荧光信号强的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性。

也可以用已知外切活性的核酸酶作为内参，根据待测核酸酶的荧光信号强度和内参核酸酶的荧光信号强度的比值来算出待测核酸酶具体的酶活值。

二、方法的建立

1、合成与已知序列部分互补的引物

根据固定在芯片上的含有已知序列的单链DNA分子和实验需求，设计与已知序列部分互补的引物，且引物3’末端最后一个碱基为特定碱基(可以为天然碱基、简并碱基、正确碱基、错配碱基或非防止外切的修饰碱基)，引物中按照 5’-3’的顺序倒数第二个碱基和倒数第三个碱基之间的磷酸二酯键作硫酰化修饰，引物5’末端磷酸化修饰。

含有已知序列的单链DNA分子上设有碱基甲、碱基乙和碱基丙；碱基甲为已知序列中与特定碱基正确或错误配对的碱基；碱基乙为已知序列中从5’端起碱基甲上游紧邻的第一个碱基；碱基甲和碱基乙不同；碱基丙为已知序列中从5’端起碱基甲上游紧邻的第二个碱基；碱基甲和碱基乙不同。

固定在芯片上的含有已知序列的单链DNA分子的裸露端进行磷酸化修饰。

2、杂交和酶切

1)杂交

将引物与固定在芯片上的含有已知序列的单链DNA分子杂交，得到杂交产物；

2)、酶切

用多个待测核酸酶分别酶切上述1)得到的杂交产物，得到酶切产物；

3、聚合反应

1)荧光修饰目标dNTP的准备

荧光修饰目标dNTP为与已知序列中的碱基甲或碱基乙互补的dNTP，且荧光修饰，

碱基乙与碱基丙相同或不同；若碱基乙与碱基丙相同，则将荧光修饰目标 dNTP糖环上3’羟基做阻断修饰。

2)将上述2得到的酶切产物、DNA聚合酶和荧光修饰目标dNTP进行聚合反应，根据聚合反应的荧光信号判断任2个待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性大小。

上述根据聚合反应的荧光信号判断任2个待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性大小为如下：

当荧光修饰目标dNTP与碱基甲互补时，比较任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号强的待测核酸酶(表明加入的碱基发生聚合)的对特定碱基3'-5'外切活性大于荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性，反之，则不大于；

或当荧光修饰目标dNTP与碱基乙互补时，比较任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性大于荧光信号强的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性，反之，则不大于。

三、定量检测

方法与上述二基本相同，不同的是将已知活性大小的核酸酶作为参照，检测已知活性大小的核酸酶的荧光强度和待测核酸酶荧光强度；

计算待测核酸酶荧光强度与内参核酸酶荧光强度的比值，来算出待测核酸酶具体的酶活值。

实施例2、检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性

本实施例以核酸外切酶I作为已知活性的内参核酸酶(活性大小为 10U/ul)，按照实施例1的二的方法检测Enzymatic的phi29DNA聚合酶和BGI 的phi29DNA聚合酶在没有聚合反应所需的dNTP的情况下对没有修饰的C碱基在正确配对的情况下3’-5’的外切活性大小。在测试过程中同时设置两个对照组，以防止被检测的酶完全没有切除碱基或将芯片上所有的碱基都切除干净而导致结果不准确。

下面方法采用的器材:BGISEQ-500测序仪

下面方法采用的试剂如下表1所示:

表1

具体步骤如下：

1、合成与已知序列部分互补的引物

(1)固定在芯片上的含有已知序列的单链DNA分子

已知序列为:AAGT CGG ATC GTA GCC ATG TCG TTC TGT GAG CCA AGG AGT TG(序列 1),

含有已知序列的单链DNA分子3’端作磷酸化修饰，5’端被固定在芯片上；

(2)引物制备合成

根据已知序列中第3-32位(30bp)，设计与已知序列部分互补的引物，且引物按照5’-3’的顺序倒数第二个碱基和倒数第三个碱基之间的磷酸二酯键作硫酰化修饰，引物5’末端磷酸化修饰，引物3’末端最后一个碱基为特定碱基，可以为天然碱基、简并碱基、正确碱基、错配碱基或非防止外切的修饰碱基。

实验组与已知序列部分互补的引物：#GCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCG*AC， (序列2，#代表碱基磷酸化修饰，*代表硫酰化修饰的磷酸二酯键)，特定碱基为 C。

设计与已知序列部分互补对照组引物，该引物序列与实验组引物相比，仅不含有特定碱基：

对照组引物序列：#GCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCG*A(序列3，#代表碱基磷酸化修饰，*代表硫酰化修饰的磷酸二酯键)

2、杂交和酶切

1)杂交

将固定在芯片上的含有已知序列的单链DNA分子分别与不同的引物杂交，得到各反应组的杂交产物，具体如下：

对照组1：加入200ul用5X SSC稀释至终浓度为1uM的对照组引物；

对照组2：加入200ul用5X SSC稀释至终浓度为1uM的实验组引物；

核酸外切酶I组：加入200ul用5X SSC稀释至终浓度为1uM的实验组引物；

BGI phi29组：加入200ul用5X SSC稀释至终浓度为1uM的实验组引物；

Enzymatics phi29组：加入200ul用5X SSC稀释至终浓度为1uM的实验组引物。

上述杂交条件为35℃ 10分钟。

2)、酶切

向上述2)得到的核酸外切酶I组杂交产物、BGI phi29组杂交产物和 Enzymaticsphi29组杂交产物分别加入核酸外切酶I、待测核酸酶BGI phi29DNA 聚合酶和待测核酸酶Enzymatics phi29DNA聚合酶，酶切，得到核酸外切酶I酶切产物、待测核酸酶BGI phi29DNA聚合酶酶切产物和待测核酸酶Enzymatics phi29DNA聚合酶酶切产物；

向上述2)得到的对照组1杂交产物和对照组2杂交产物中分别加入洗脱缓冲液，给予其与其他三组相同的实验条件，得到对照组1产物和对照组2产物。

上述酶切体系如下：

对照组1加入200ul洗脱缓冲液；

对照组2加入200ul洗脱缓冲液；

核酸外切酶I组杂交产物加入200ul核酸外切酶I混合液，混合液中核酸外切酶I被稀释10倍，稀释后的终浓度为1U/ul,核酸外切酶I混合液的反应体系如下表2：

表2

BGI phi29组杂交产物中加入200ul BGI phi29DNA聚合酶混合液,混合液中BGIphi29DNA聚合酶的聚合活性为10U/ul,将其稀释10倍，稀释后的终浓度为1U/ul,BGIphi29DNA聚合酶混合液的反应体系如下表3：

表3

Enzymatics phi29组杂交产物加入200ul Enzymatics phi29DNA聚合酶混合液,混合液中Enzymatics phi29DNA聚合酶的聚合活性为10U/ul,将其稀释10 倍，稀释后的终浓度为1U/ul,Enzymatics phi29DNA聚合酶混合液的反应体系如下表4：

表4

Enzymatics phi29DNA聚合酶混合液

上述酶切反应的条件为37℃孵育10分钟。

3、聚合反应

1)荧光修饰目标dNTP的准备

碱基甲为模板上已知序列中与被切除的C碱基正确配对的碱基，此处为G，碱基乙为模板上已知序列中从5’端起碱基甲上游紧邻的第一个碱基，此处为已知序列第2位的A。

检测所用的荧光修饰目标dNTP为用ROX修饰的dTTP，由于本实验中碱基乙与其5’端上游紧邻的一个碱基(碱基丙)相同，所以所用的dTTP糖环上3’羟基做阻断修饰。

2)上述2得到的5组酶切产物中均加入聚合反应混合液，使其进行聚合反应，根据各组聚合反应的荧光信号判断对应的BGI phi29DNA聚合酶和 Enzymatics phi29DNA聚合酶在没有聚合所需的dNTP时对C碱基在正确配对情况下的3'-5'外切活性大小；并以已知外切活性的核酸外切酶I作为内参，计算出具体的数值。

上述聚合反应混合液如下表5:

表5聚合反应混合液

上述聚合反应的条件为55℃孵育2分钟；用洗脱缓冲液清洗芯片，在 BGISEQ-500测序仪上采集信号。

上述根据聚合反应的荧光信号判断对应的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性大小为如下：

上述荧光修饰目标dNTP为ROX修饰且糖环上3’位羟基被阻断的dTTP,该碱基与已知序列中的碱基乙互补，判断标准如下：

当荧光修饰目标dNTP与碱基乙互补时，比较任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性大于荧光信号强的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性，反之，则不大于。

结果如表6所示，

表6

结果显示：

1)对照组1的信号值只有233，说明在C碱基被完全切除掉时，只有极少部分的T可以被加到引物上；

2)对照组2的信号值最强，说明3种酶都发挥了3’-5’的外切活性；

3)信号值核酸外切酶I>Enzymatics phi29DNA聚合酶>BGI phi29DNA聚合酶,说明这三种酶对C碱基在正确配对情况下3’-5’的外切活性BGI phi29DNA 聚合酶>Enzymaticsphi29DNA聚合酶>核酸外切酶I；

4)对照组2的信号值可以看出在完全没有切除的情况下T的信号为4500，通过计算可以得出核酸外切酶I、BGI phi29DNA聚合酶、Enzymatics phi29DNA聚合酶被切掉的碱基换算成信号分别为1906、3411、2952(4500-2594/1089/1548)。

已知核酸外切酶I的酶活为10U/ul，根据所得的信号比值可以算出BGI phi29 DNA聚合酶在没有聚合所需的dNTP时对C碱基在正确配对情况下3’-5’外切活性约为18U/ul,Enzymatics phi29DNA聚合酶在没有聚合所需的dNTP时对C碱基在正确配对情况下3’-5’外切活性约为15U/ul。

序列表

<110>深圳华大生命科学研究院

<120> 一种检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性的方法和试剂盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aagtcggatc gtagccatgt cgttctgtga gccaaggagt tg 42

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gctcacagaa cgacatggct acgatccgac 30

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gctcacagaa cgacatggct acgatccga 29

Claims

1.一种检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性的方法，包括如下步骤：

所述含有已知序列的单链DNA分子上设有碱基甲和碱基乙；所述碱基甲为所述已知序列中与所述引物中特定碱基对应配对的碱基；所述碱基乙为所述已知序列中从5’端起所述碱基甲上游紧邻的第一个碱基；所述碱基甲和所述碱基乙不同；

2)将固定在固相上的所述含有已知序列的单链DNA分子与所述引物杂交，再用不同的待测核酸酶酶切杂交的产物，得到酶切产物；

所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基甲或所述碱基乙互补。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述含有已知序列的单链DNA分子上还设有碱基丙；

所述碱基乙与所述碱基丙相同或不同；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述特定碱基为可切除的碱基；

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述固定在固相上的含有已知序列的单链DNA分子的裸露端碱基进行防止外切酶外切修饰。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述根据聚合反应产生的荧光信号来判断所述不同的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性为如下：

当所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基甲互补时，比较所述不同的待测核酸酶中任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号强的待测核酸酶的对特定碱基3'-5'外切活性大于荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性；

或当所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基乙互补时，比较所述不同待测的核酸酶中任2个待测核酸酶的荧光信号强度，荧光信号弱的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性大于荧光信号强的待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性。

7.一种定量检测待测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活的方法，包括如下步骤：以已知酶活性的内参核酸酶作为对照，按照权利要求1-6中任一所述的方法的步骤1)-3)分别检测所述已知酶活性的内参核酸酶的荧光强度和所述待测核酸酶荧光强度；再通过计算该待测核酸酶荧光强度与所述内参核酸酶的荧光强度的比值，得到该待测核酸酶的对特定碱基3'-5'外切酶活。

8.一种检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活的试剂盒，包括权利要求1-6任一所述方法中的所述含有已知序列的单链DNA分子和所述引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括权利要求1-8任一所述方法中的所述DNA聚合酶和权利要求1-8任一所述方法中的所述荧光修饰目标dNTP。

10.权利要求8或9所述的试剂盒在检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切活性中的应用；

或权利要求8或9所述的试剂盒在定量检测核酸酶对特定碱基3'-5'外切酶活大小中的应用。