CN114480568A - 一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测T4 PNK磷酸化效率的方法及试剂盒，其包括：使用T4 PNK酶对dsDNA进行磷酸化，得到5′端磷酸化产物；使用具有识别5′端磷酸化的dsDNA并对其进行外切的酶对磷酸化产物进行酶切，得到酶切产物；最后测定酶切产物的量；该方法能够稳定而准确的检测出T4 PNK酶磷酸化效率。

Description

一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒。
背景技术
DNA的磷酸化操作是分子生物学实验的重要操作步骤，在众多生产、实验中是保障结果的关键步骤。例如，在高通量测序文库郭建过程中，磷酸化是构建DNA文库关键步骤，具体包括：步骤A将片段化的DNA进行片段的末端及磷酸化，其中使用T4PNK进行磷酸化，磷酸化效率将是影响接头连接成功的关键因素，会影响整个建库过程。
T4PolynucleotideKinase，简称T4PNK，中文名称T4多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化NTP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。产生如下的磷酸化反应：5'-OH+NTP→5'-P+NDP。可用于寡核苷酸、DNA或RNA的5’末端标记或磷酸化。目前，对于T4PNK酶活性测定的常规方法主要包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影、自由基同位素32p标记技术等。但这些方法存在复杂、耗时、通量低、潜在的放射性危害等缺陷。
在实际生产、试验过程中，往往要检测待检样品对DNA的磷酸化效率，由此需要与生产试验场景需求相适应的检测方法、试剂盒以及质检设备。但是目前的手段往往检测效率低、流程繁琐且制备预检品的品质稳定性差，质检操作时间长、操作复杂难以提高检测通量以满足生产实验中质量控制的实际要求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供了一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒，本发明通过偶联磷酸化反应和具有末端磷酸化识别活性的酶切反应，根据测定酶切反应产物的量构建连酸化反应效率检测模型，能够稳定有效的高通量处理磷酸化反应效率的质控。
1.一种检测磷酸化反应的方法，其包括：
步骤Ⅱ：质控品的磷酸化反应，磷酸化反应体系中磷酸化酶在对质控品进行磷酸化，得到磷酸化产物；
步骤Ⅲ：酶切反应，酶切反应体系中有末端磷酸基团识别功能的核酸外切酶对磷酸化产物进行酶切，得到酶切产物；
步骤Ⅳ：测定酶切产物的量。
2.根据项1所述的方法，所述磷酸化反应体系中磷酸化酶为具有DNA5’末端磷酸化活性的酶，优选为T4 PNK酶。
3.根据项1所述的方法，所述酶切反应体系中核酸外切酶为具有DNA5’末端磷酸基团特异性识别功能并对其进行顺序外切水解产生单核苷酸的酶,优选为为λexo酶。
4.根据项1所述的方法，所述质控品为任意来源的ssDNA或dsDNA，优选为dsDNA。
5.根据项4所述的方法，所述质控品的磷酸化反应还包括阴性对照组反应、待测反应和阳性对照组反应，阴性对照反应和待测反应使用阴性质控品，阳性对照反应使用阳性质控品；
所述阴性质控品和阳性质控品为序列相同的dsDNA片段，阴性质控品为5’端带有磷酸基团的dsDNA片段，阳性质控品为5’端已经磷酸化的dsDNA片段。
6.根据项1～5中任一项所述的方法，所述方法步骤Ⅱ前还包括：步骤Ⅰ质控品制备。
7.根据项1所述的方法，所述测定酶切产物的量为任一能实现对酶切产物进行峰图检测和/或浓度检测的方法。
8.根据项1所述的方法，其可以用于进行T4PNK酶、10×T4 PNK buffer、dNTP、磷酸化反应步骤时间和磷酸化反应步骤温度，任一条件磷酸化反应效率的质控。
9.一种用于检测T4 PNK磷酸化效率的试剂盒，所述试剂盒包括：
质控品；
用于磷酸化的试剂，包括：T4 PNK、10×T4 PNK buffer和dNTP；
用于酶切的试剂，包括：λexo酶和10×λexo Buffer。
10.根据项9所述的试剂盒，所述质控品替换为底物质控品、阳性质控品引物和阴性质控品引物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中的磷酸化反应检测方法为实际生产应用中建立了磷酸化反应效率的检测模型，且该模型可相适于相应的生产实验场景，同时提供相应的检测试剂盒和质检设备可以快速方便判断待检样品的磷酸化反应的效率，进而判断待检样品质量。流程简化，稳定高效的高通量检测磷酸化反应效率。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1：磷酸化反应检测方法的原理图；
图2-图7：为实施例1中，不同梯度T4PNK酶用量及阴性对照组和阳性对照组Caliper检测峰图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在一方面，本发明提供一种检测磷酸化反应的方法，其包括：
步骤Ⅱ：质控品的磷酸化反应，磷酸化反应体系中磷酸化酶在对质控品进行磷酸化，得到磷酸化产物；
步骤Ⅲ：酶切反应，酶切反应体系中有末端磷酸基团识别功能的核酸外切酶对磷酸化产物进行酶切，得到酶切产物；
步骤Ⅳ：测定酶切产物的量。
本发明中所述步骤Ⅱ中的磷酸化是指核酸某些基团上连接磷酸根的过程，核苷酸链中由5’磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键。在一具体实施例实施例中包括阴性对照组反应、待测反应和阳性对照组反应，
所述的阴性对照组反应中使用阴性质控品，待测样品的加样量为0，提供完全未发生磷酸化反应数据；
所述的阳性对照反应中使用阳性质控品，模仿完全磷酸化样，提供完全磷酸化反应数据；
所述的待测反应使用阴性质控品，其中所述的磷酸化酶、磷酸化酶对应buffer和dNTP中的任一中为待测样品。
本发明中所述质控品为任意来源的ssDNA或dsDNA，如人、动物、植物、微生物或人工随机合成等来源，其优选为dsDNA。
在一具体实施例中所述质控品还包括阴性质控品和/或阳性质控品。所述阴性质控品和阳性质控品为序列相同的dsDNA片段，其中dsDNA片段大小没有特殊限制，在本发明中选择符合酶切反应范围内的dsDNA长度。区别在于，所述阴性质控品在阴性对照反应和待测反应中使用，为末端未磷酸化的dsDNA片段，所述阳性质控品在阳性对照反应中使用，为5’端磷酸化的dsDNA片段。磷酸化过程阴性对照反应中使用T4 PNK的使用量为0。
在本发明申请中，所述步骤Ⅱ中磷酸化酶可以选自任一可催化DNA末端磷酸化修饰作用的酶，优选为具有5’末端磷酸化活性的酶，在一具体实施例中为T4 PNK酶。
所述磷酸化反应体系包括所述磷酸化酶和任一适用于该磷酸化酶的buffer和dNTP，在一具体实施例中为T4 PNK、10×T4 PNK buffer和dNTP
所述磷酸化的反应条件为20℃，25～40min，65℃，5～15min。磷酸化反应可以选择以下两组反应任意反应温度与反应时间的组合，反应温度为20℃，反应时间为27、30、33、35和37min，及反应温度为65℃，反应时间为7、10和12min。在一具体实施例中反应条件为20℃，30min和65℃，10min。所述得到磷酸化产物包括：质控品磷酸化产物；在一具体实施例中磷酸化产物还包括：阳性质控品磷酸化产物和/或阴性质控品磷酸化产物。
核酸外切酶(exonucleautomotive service en gineers)在核酸水解酶中，是具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶。可大致分为水解磷酸二酯键的3’端生成5’-单核苷酸的酶，及水解5’端生成3’-单核苷酸的酶。前者有蛇毒磷酸二酯酶及大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等；后者有脾脏磷酸二酯酶、嗜酸乳杆菌(Lac-tobacillus acidophilus)核酸酶和λ噬菌体核酸外切酶(简称λexo酶)等。这些酶中还可以区别出从分子链的3’末端或5’末端开始切断和对单链DNA或双链DNA具有特异作用的酶。
本发明中所述步骤Ⅲ中的酶切反应是指具有特异性识别末端带有磷酸基团DNA活性的酶，并可催化DNA分子末端顺序水解释放核苷酸的反应。
所述的核酸外切酶可以选自任一具有从分子链的末端顺序水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶，优选为具有特异性识别5’端磷酸化的dsDNA识别活性并对其进行外切的酶,在一具体实施例中为λexo酶。
所述的步骤Ⅲ：中酶切应体系包括所述核酸外切酶和任一适用于该核酸外切酶的buffer，在一具体实施例中为λexo酶和10×λexo Buffer。
在本发明中，所述质控品的片段选择为具体外切酶相适应片段长度范围，在一具体实施例中为λexo酶可以酶切的范围，所述质控品的片段大小可以为100～500bp，优选地，质控品片段大小为120～300bp，更优选地，质控品的片段大小为150～250bp。所述步骤Ⅲ：中的酶切反应的反应条件为37℃5～20min，75℃5～15min。酶切反应可以选择以下两组反应任意反应温度与反应时间的组合，反应温度为37℃，反应时间为7、10、15和17min，及反应温度为75℃，反应时间为7、10和12min。在一具体实施例中，酶切反应的反应条件为37℃15min，75℃10min。所述酶切产物包括：产物，在一具体实施例还包括：阳性质控品酶切产物和/或阴性质控品酶切质控品酶切产物。
本发明的方法在步骤Ⅱ：前还可以包括质控品制备步骤。将已知的DNA片段作为底物质控品，所述DNA片段可以为任何物种的DNA片段，如：人、动物、微生物、人工合成随机片段等，通过设计引物进PCR扩增，得到质控品。在一具体实施例中，本发明还包括阳性质控品和/或阴性质控品的制备步骤，二者的制备的区别在于：阳性质控品使用5’端磷酸化修饰的阳性质控品引物进行扩增，而阴性质控品则使用5’端未磷酸化的质控品引物进行扩增。其中，PCR扩增过程中选择本领域技术人员能够实现的PCR反应体系及反应条件。
在一具体实施例中，所述的底物质控品DNA为SEQ ID NO:1序列，所述的阳性质控品引物为PAR-210P-1、PAR-210P-2，所述的阴性质控品引物为PAR-210-1、PAR-210-2。
本发明中所述步骤Ⅳ：中测定酶切产物的量，可以使用任何可以检测酶切产物产量的方法，优选使用可以测量产物峰图的仪器或设备，如Agilent2100，Caliper LabChipGX等；或使用可以检测浓度的仪器或设备，如
Figure BDA0003443179360000061
荧光仪、Nanodrop_2000等。在一具体实施例中，使用Caliper LabChip GX。
一方面，本发明还可以用于测量磷酸化反应的反应条件，包括反应温度、反应时间等。
一方面，本发明提供一种用于检测T4 PNK磷酸化效率的试剂盒，包括：
质控品；
用于磷酸化的试剂，包括：T4 PNK、10×T4 PNK buffer和dNTP；
用于酶切的试剂，包括：λexo酶和10×λexo Buffer。
一方面，本发明提供一种用于检测T4 PNK磷酸化效率的试剂盒，包括：底物质控品、阳性质控品引物、阴性质控品引物、用于磷酸化的试剂和用于酶切的试剂；
所述的底物质控品，阳性质控品引物和阴性质控品引物，优选为SQE ID NO:1、PAR-210P-1/2和PAR-210-1/2；
所述用于磷酸化的试剂，包括：T4 PNK酶及磷酸化缓冲液，优选为T4PNK酶；
所述用于酶切的试剂，包括：λexo酶及酶切缓冲液。
实施例
检测采用的所有实验材料、试剂：
a)以下实施例中使用的试剂来源如下表1：
Figure BDA0003443179360000071
b)底物样品序列如下：
5'-TAGTCTGAGCCGTGCTCTTGCCAATGTGGATCGCAGAGTGGATCGACTGGAGCCATCTACAGGCTTAGTGGTAGCTGATGCGCCATTGCGCGTGATCGCTGGTCCTATGGGCGCTAACTGCGTGATAGCTGGGACTTGACGCTAATTGCGCGTGCATGCTGGGACTCAAGGCGCTAACTGCGCGTGAGTTCTGGTGCACGGAGTGCTACG-3'(SEQID NO:1)
c)引物，系列如下：
PAR-210-1(SEQ ID NO:2):5'-TAGTCTGAGC CGTGCTCTTG CCAAT-3'
PAR-210-2(SEQ ID NO:3):5'-CGTAGCACTCCGTGCACCAGAACTC-3'
PAR-210P-1(SEQ ID NO:4):5'-PTAGTCTGAGC CGTGCTCTTG CCAAT-3'
PAR-210P-2(SEQ ID NO:5):5'-PCGTAGCACTCCGTGCACCAGAACTC-3'
步骤Ⅰ：质控品制备步骤
1、底物质控品的稀释：
用灭菌纯化水将底物稀释至1ng/17μL。
2、PCR扩增反应：
1)将PAR-210-1/-2、PAR-210P-1/-2和KAPAHiFi扩增酶(KAPAHiFiHotsartReadyMix)室温解冻，振荡混匀10s，2000rpm离心5s。
2)阴性对照组和阳性对照组，制备方式仅引物不同，分别是PAR-210-1/-2和PAR-210P-1/-2，按照下表所示的用量配制PCR反应体系。
阴性质控品制备PCR反应体系：
表2
Figure BDA0003443179360000081
阳性质控品制备PCR反应体系：
表3
试剂名称 单次反应用量(μL)
KAPA HiFi Library Amplification kit 25
PAR-210P-1(10p) 4
PAR-210P-2(10p) 4
稀释后底物(1ng/17μL) 17
3)将b)配制的混合液震荡混匀，2000rpm离心10s，取50μL加入到0.2mLPCR薄壁管，短暂离心。
4)按以下方法设置PCR扩增
表4
Figure BDA0003443179360000091
5)PCR结束后，使用(1.8X)90μL纯化磁珠悬浮液进行纯化，用50μL纯化洗脱液溶解。将洗脱好的DNA文库转移到带有标签的新1.5mL离心管中。完成质控品的制备。
3、文库浓度测定：
1)使用
Figure BDA0003443179360000092
dsDNA HS Assay Kit检测质控品浓度；
2)如质控品浓度高于50ng/μL，将质控品进行稀释，稀释至50±1ng/μL。
3)吸取b的质控品10μL到新的1.5mL离心管中，对质控品进行峰图检测。
步骤Ⅱ：质控品的磷酸化反应
1)按照下表5所示的用量配制反应体系。
表5
Figure BDA0003443179360000101
(Vx——为待检样品不同梯度的进样体积)
2)将1)配制的混合液振荡混匀，2000rpm离心10s，取29μL加入到0.2mLPCR板(或0.2mLPCR薄壁管)中。
3)按表6温度条件进行磷酸化反应：
表6
步骤 反应温度 时间
Step1 20℃ 30min
Step2 75℃ 10min
4)反应结束后，获得磷酸化产物。
步骤Ⅲ：酶切反应
1)按照下表7所示的用量配制酶切反应体系：
表7
Figure BDA0003443179360000111
2)酶切部件反应条件设置如表8：
表8
步骤 反应温度 时间
Step1 37℃ 15min
Step2 75℃ 10min
Step3 4℃ ∞
3)反应结束后，获得酶切产物。
步骤Ⅳ：测定酶切产物的量
使用Caliper LabChip GX对酶切产物进行检测，和使用
Figure BDA0003443179360000112
dsDNAHS AssayKit对构建好的文库进行浓度检测。
实施例1
设置磷酸化反应中T4PNK酶为：0μL、0.1μL、0.5μL、1μL和2μL，其中0μL为阴性对照组，且均采用阴性质控品；设置阳性对照试验T4PNK酶进样量为为：1μL，采用阳性质控品；
待检样品为T4 Polynucleotide Kinase(T4 PNK)(南京诺唯赞生物科技有限公司N102-P1)——为新采购效期内在二代测序建库中验证合格的酶。
通过Caliper检测峰图发现，阴性对照组的峰图主要为210bp左右，浓度为10.6ng/ul；而加入了0.5U及以上的酶量的测试组，Caliper峰图显示为无主峰。说明0.5U及以上的酶量对起始量为7.7pmol(210bp，1ug)的dsDNA完全磷酸化。
表8
T4PNK酶用量 0ul(阴性对照组) 0.1ul 0.5ul 1ul 2ul 1ul(阳性对照组)
Caliper检测峰图 图2 图3 图4 图5 图6 图7
为验证本质检结果的出结论，使用
Figure BDA0003443179360000121
dsDNA HS Assay Kit对酶切产物进行浓度检测，检测结果如下表9。阴性对照组(T4 PNK酶用量为0ul)浓度为9.5ng/ul，0.5U及以上酶量基本浓度均小于1.5ng/ul。说明0.5U及以上的酶量对起始量为7.7pmol(210bp，1ug)的dsDNA有完全磷酸化的能力。该结果与Caliper检测结果一致。
表9
Vx 0ul 0.1ul 0.5ul 1ul 2ul
浓度ng/ul 9.5 1.013 0.769 0.809 0.809
结论：峰图检测发现，阴性对照组的峰图主要为210bp左右，浓度为10.6ng/ul；而加入了0.5U及以上的酶量的测试组，Caliper检测峰图显示为无主峰。说明0.5U及以上的酶量对起始量为7.7pmol(210bp，1ug)的dsDNA完全磷酸化。
使用
Figure BDA0003443179360000122
dsDNA HS Assay Kit对酶切产物进行浓度检测，检测结果：阴性对照组(T4 PNK酶用量为0ul)浓度为9.5ng/ul，0.5U及以上酶量基本浓度均小于1.5ng/ul。说明0.5U及以上的酶量对起始量为7.7pmol(210bp，1ug)的dsDNA有完全磷酸化的能力。该结果与Caliper峰图检测结果一致。
尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 一种磷酸化反应的检测方法及试剂盒
<130> PE02028
<150> CN202011627191.6
<151> 2020-12-30
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物样品
<400> 1
tagtctgagc cgtgctcttg ccaatgtgga tcgcagagtg gatcgactgg agccatctac 60
aggcttagtg gtagctgatg cgccattgcg cgtgatcgct ggtcctatgg gcgctaactg 120
cgtgatagct gggacttgac gctaattgcg cgtgcatgct gggactcaag gcgctaactg 180
cgcgtgagtt ctggtgcacg gagtgctacg 210
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR-210-1
<400> 2
tagtctgagc cgtgctcttg ccaat 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR-210-2
<400> 3
cgtagcactc cgtgcaccag aactc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR-210P-1
<400> 4
tagtctgagc cgtgctcttg ccaat 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR-210P-2
<400> 5
cgtagcactc cgtgcaccag aactc 25

Claims (10)

1.一种检测磷酸化反应的方法，其包括：
步骤Ⅱ：质控品的磷酸化反应，磷酸化反应体系中磷酸化酶在对质控品进行磷酸化，得到磷酸化产物；
步骤Ⅲ：酶切反应，酶切反应体系中有末端磷酸基团识别功能的核酸外切酶对磷酸化产物进行酶切，得到酶切产物；
步骤Ⅳ：测定酶切产物的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸化反应体系中磷酸化酶为具有DNA 5’末端磷酸化活性的酶，优选为T4 PNK酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切反应体系中核酸外切酶为具有DNA 5’末端磷酸基团特异性识别功能并对其进行顺序外切水解产生单核苷酸的酶,优选为为λexo酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质控品为任意来源的ssDNA或dsDNA，优选为dsDNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述质控品的磷酸化反应还包括阴性对照组反应、待测反应和阳性对照组反应，阴性对照反应和待测反应使用阴性质控品，阳性对照反应使用阳性质控品；
所述阴性质控品和阳性质控品为序列相同的dsDNA片段，阴性质控品为5’端带有磷酸基团的dsDNA片段，阳性质控品为5’端已经磷酸化的dsDNA片段。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法步骤Ⅱ前还包括：步骤Ⅰ质控品制备。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定酶切产物的量为任一能实现对酶切产物进行峰图检测和/或浓度检测的方法。
8.根据权利要求1所述的方法，其可以用于进行T4PNK酶、10×T4PNK buffer、dNTP、磷酸化反应步骤时间和磷酸化反应步骤温度，任一条件磷酸化反应效率的质控。
9.一种用于检测T4 PNK磷酸化效率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
质控品；
用于磷酸化的试剂，包括：T4 PNK、10×T4 PNK buffer和dNTP；
用于酶切的试剂，包括：λexo酶和10×λexo Buffer。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品替换为底物质控品、阳性质控品引物和阴性质控品引物。
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