CN110514631A - 一种高灵敏、快速定量检测t4 pnk酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高灵敏、快速定量检测T4多核苷酸激酶的方法，步骤是：（1）以Fe3+为配位中心，BDC为有机配体，合成金属有机骨架Fe‑MIL‑88；（2）将荧光素标记的DNA单链FAM‑ssDNA与其互补链退火形成双链FAM‑dsDNA；（3）FAM‑dsDNA经培育后，被T4 PNK催化磷酸化，磷酸化的FAM‑dsDNA被λ exo裂解得到FAM‑ssDNA；（4）加入Fe‑MIL‑88，裂解得到FAM‑ssDNA荧光被猝灭，通过检测FAM的荧光强度来定量检测T4 PNK酶活性。灵敏简便，选择性好。

Description

一种高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法
技术领域
本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于偶联核酸外切酶反应和金属有机骨架（MOFs）—Fe-MIL-88的荧光传感纳米平台用于定量测定细胞裂解液中T4多核苷酸激酶（T4 PNK）的方法。
背景技术
T4多核苷酸激酶（T4 PNK）是由T4噬菌体所感染的大肠杆菌分离出来的酶。多核苷酸激酶（PNK）能够催化三磷酸腺苷（ATP）的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5′-OH末端并生成ADP的反应。在大多数正常的细胞活动包括DNA重组、复制、修复过程中，该磷酸化反应是一个必不可少的过程。一般来说，各种外源性和内源性因素包括电离辐射、化学物质和核酸酶等都可能导致核酸中5'端羟基化，从而损伤DNA，使基因组不稳定。多核苷酸激酶通过转移ATP的γ-磷酸基团至DNA末端从而负责修复核酸的5′端羟基自由基。PNK功能障碍可能导致许多细胞活动发生异常，如核酸代谢、DNA复制、DNA重组、DNA链损伤修复异常等，最终诱发多种人类疾病，包括沃纳综合征、Rothmund-Thomson综合征等。此外，由于PNK抑制剂能够提高人体肿瘤对γ-射线的敏感性，PNK可能为癌症放射治疗的一个有重大潜力的靶点。因此，建立一种高灵敏性，选择性好，便于操作的PNK活性检测及其抑制剂筛选的方法对基础生化研究、临床诊断和药物发现具有重要意义。
目前，用于检测PNK活性的常规分析方法主要包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影、自由基同位素32p标记技术等，但这些方法存在复杂、耗时、潜在的放射性危害等缺陷。近年来，纳米通道生物传感器、电化学方法、比色法、荧光法等逐渐引起关注，其中荧光法以其简便、高效、灵敏等优点越来越受到人们的重视。
近年来，金属有机骨架材料（MOFs）作为一种具有晶体多孔性的新型材料，以其生物降解性、高比表面积和灵活可控的孔隙度，显示出了巨大的应用潜力。MOFs的常见应用包括气体储存、催化和药物传递。此外，利用MOFs具有良好的猝灭能力，可以用于构建荧光传感平台。MOFs通常对单链DNA（ssDNA）显示良好的吸附作用。这是由于MOFs包含的有机基团通常存在π电子共轭体系产生π-π相互作用的结果，同时为可能的氢键提供来源。然而，利用MOFs进行酶活性检测的例子很少，因此利用MOFs进行酶活性检测的应用尚待进一步探索。
发明内容
针对现有技术存在的设计复杂、操作繁琐、费用高等缺陷，本发明的目的在于提供一种基于偶联核酸外切酶反应和MOFs（Fe-MIL-88）的用于高灵敏、快速定量检测T4多核苷酸激酶的方法。利用λ exo对磷酸化DNA的裂解作用、Fe-MIL-88对ssDNA和双链DNA（dsDNA）的吸附能力的明显区别及其良好的荧光猝灭能力，检测细胞裂解液中T4 PNK酶活性。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种快速定量检测T4 PNK酶的方法，步骤如下：
（1）、合成以Fe3+为配位中心，BDC为有机配体的Fe-MIL-88[参考文献：Liu Y, Fu W,Li C, Huang C. Gold nanoparticles immobilized on metal–organic frameworkswith enhanced catalytic performance for DNA detection. Analytica ChimicaActa. 2015;861:55-61.]：将1,4-对苯二甲酸（BDC），六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF），随后加入冰乙酸。将此混合溶液在120 ℃条件下保持4 h。将所得产物离心并弃去上清液，随后分别用DMF，乙醇，水清洗数次。将最终得到的沉淀重新分散于水中。
（2）、制备FAM 荧光标记的双链DNA（FAM-dsDNA），将FAM荧光标记的单链DNA(FAM-ssDNA)与其互补链在Tris-HCl 缓冲液（20 mM Tris，10 mM MgCl2，pH 8.0）中混合，然后在95 ℃失活10 min，随后缓慢降至室温得到dsDNA-FAM。
（3）、检测T4 PNK酶活性：将细胞裂解液稀释，加入步骤（2）中的dsDNA-FAM与4 U λexo、0.5 mM ATP至反应缓冲液中，并在37 ℃条件下培育30 min。
（4）、将步骤（1）所得Fe-MIL-88加入到步骤（3）中的混合溶液中，步骤（3）反应所得FAM-ssDNA荧光被猝灭。测定FAM荧光强度，根据标准曲线，得到T4 PNK酶活性。
本发明定量检测细胞裂解液中的T4 PNK的含量的原理是：当没有T4 PNK存在于体系中，dsDNA将不会被磷酸化，因此不能满足λ exo的裂解条件。由于Fe-MIL-88对dsDNA的吸附作用较弱，Fe-MIL-88对FAM-DNA的淬灭效率较低。相比之下，当T4 PNK存在于体系中时，dsDNA的5'-羟基端被磷酸化，磷酸化的dsDNA将被λ exo裂解。随后得到5'端荧光标记的FAM-ssDNA。FAM-ssDNA将被Fe-MIL-88显著猝灭。其中以Fe-MIL-88为受体，FAM-ssDNA为供体，当FAM-ssDNA与Fe-MIL-88之间的距离缩小时，两者之间发生荧光共振能量转移（FRET）,FAM-ssDNA将被Fe-MIL-88猝灭。而Fe-MIL-88对ssDNA的吸附作用对缩小两者之间的距离起到了关键作用。因此，通过检测FAM荧光强度可以检测T4 PNK活性。
有益效果：本发明利用了λ exo对磷酸化的DNA链的裂解作用、Fe-MIL-88对ssDNA和dsDNA的不同吸附能力及其良好的猝灭能力高灵敏、快速定量检测T4多核苷酸激酶。Fe-MIL-88对FAM的猝灭强度与FAM-dsDNA被λ exo裂解的程度有关，FAM-dsDNA被λ exo裂解需满足FAM-dsDNA被T4 PNK催化磷酸化的条件，因此检测最终FAM荧光可以检测T4 PNK活性。
与传统的检测方法相比，本方法具有灵敏度高、选择性好、便于操作的优点。可以直接应用于检测细胞裂解液中T4 PNK活性。整个检测过程环保、安全、方便。
附图说明
图1A是实施例1制备的Fe-MIL-88的图像透射电子显微镜图；如图所示，Fe-MIL-88粒径约为300 nm（图中标尺为1 μm）。
图1B是实施例1制备的Fe-MIL-88的图像扫描电子显微镜图；如图所示，Fe-MIL-88呈八面体形貌（图中标尺为1 μm）；
图1C是实施例1制备的Fe-MIL-88的X射线光电子能谱图；图1D是实施例1制备的Fe-MIL-88的紫外-可见吸收光谱图和Fe3+的紫外-可见吸收光谱图。
图2是实施例2考察FAM-dsDNA和FAM-ssDNA对Fe-MIL-88的响应图；如图所示，随着Fe-MIL-88的浓度增加，FAM-dsDNA和FAM-ssDNA的荧光逐渐被猝灭，FAM-dsDNA相对于FAM-ssDNA的荧光信号比值逐渐增大，当Fe-MIL-88浓度增大至100 μg mL-1时，荧光信号比值达到最大且逐渐趋于稳定。
图3是实施例3考察ATP浓度对磷酸化反应的影响图；如图所示，当ATP浓度增大时，荧光强度比值先增大再减小，当ATP浓度增大至0.5 mM时，荧光强度比值达最大值。
图4是实施例4考察磷酸化时间对磷酸化反应的影图；如图所示，随着磷酸化时间的增长，荧光强度逐渐减弱，当磷酸化时间达30 min时，荧光强度逐渐趋于稳定。
图5是实施例5考察pH值对磷酸化反应的影响图；如图所示，随pH值增大，荧光强度比值先增大后减小，并在pH为8.0时，荧光强度比值达最大值。
图6是实施例6考察λ exo浓度对磷酸化反应的影响图；如图所示，随λ exo浓度增大，荧光强度逐渐减弱，并在λ exo为4 U时，荧光强度达最小值逐渐趋于稳定。
图7A是实施例7在缓冲溶液中对T4 PNK酶浓度定量检测的荧光光谱图；如图所示，随着T4 PNK酶浓度增大，荧光逐渐减弱。
图7B是实施例7在缓冲溶液中T4 PNK酶浓度与荧光强度的相关图；如图所示，随着T4 PNK酶浓度增大，荧光逐渐减弱，在0.01-5.0 U mL-1浓度范围内，T4 PNK酶活性与荧光强度呈线性关系，线性回归方程为F=670–76CT4 PNK，相关系数R2=0.991。
图8A是实施例8在细胞裂解液中对T4 PNK酶浓度定量检测的荧光光谱图；如图所示，随着T4 PNK酶浓度增大，荧光逐渐减弱。
图8B是实施例8在细胞裂解液中T4 PNK酶浓度与荧光强度的相关图；如图所示，随着T4 PNK酶浓度增大，荧光逐渐减弱，在0.05-10 U mL-1浓度范围内，T4 PNK酶活性与荧光强度呈线性关系，线性回归方程为F=680–55CT4 PNK，相关系数R2=0.996。
具体实施方式
T4多核苷酸激酶（T4 PNK）、λ核酸外切酶（λ exo）（New England Biolabs公司）；六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O）、1,4-对苯二甲酸（BDC）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、腺苷5’-三磷酸腺苷(ATP)、氯化镁(MgCl2)、蛋白激酶A（PKA）、尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）、亲和素、溶菌酶、牛血清白蛋白（BSA）、腺苷5 ' -二磷酸腺苷（ADP）、NaCl、(NH4)2SO4（Sigma-Aldrich有限公司）；DNA序列（FAM-ssDNA: 5 ' -FAM-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3 ';cDNA: 5′-ACC TTC CTC CGC AAT ACT CCC CCA GGT-3′）（中国上海生工生物技术有限公司）。
实施例1 Fe-MIL-88的合成，步骤如下：
将 0.692 mmol BDC，0.692 mmol FeCl3·6H2O溶于15 mL DMF，随后加入200 μL 冰乙酸。将此混合溶液在120 ℃条件下保持4 h。将所得产物离心并弃去上清液，随后分别用DMF，乙醇，水清洗数次。将最终得到的沉淀重新分散于水中[参考文献：Liu Y, Fu W, LiC, Huang C. Gold nanoparticles immobilized on metal–organic frameworks withenhanced catalytic performance for DNA detection. Analytica Chimica Acta.2015;861:55-61.]。其透射电子显微镜图如图1A所示，扫描电子显微镜图如图1B所示,X射线光电子能谱分析如图1C所示,紫外吸收图谱如图1D所示。
实施例2 考察FAM-dsDNA和FAM-ssDNA对Fe-MIL-88的响应，步骤如下：
将100 nM的FAM-ssDNA和100 nM 的FAM-dsDNA分别加入到含有4 U λ exo、0.5 mM ATP的反应缓冲液中（70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 8.0）。加入不同浓度的Fe-MIL-88后（0、20、40、60、80、100、120、140 μg mL-1），室温下测定混合溶液的荧光，激发波长488 nm，发射波长范围为500 nm到600 nm。实验结果如图2所示。
实施例3 考察ATP浓度对磷酸化反应的影响，步骤如下：
将100 nM的FAM-dsDNA、4 U λ exo、10 U mL-1 T4 PNK和不同浓度的ATP(0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10 mM)加入至30 μL反应缓冲液中（70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 8.0）,并在37 ℃条件下培育30 min。加入100 μg mL-1的Fe-MIL-88，常温条件下培育30 min后，测定FAM荧光强度。实验结果如图3所示。
实施例4 考察磷酸化时间对磷酸化反应的影响，步骤如下：
将100 nM的FAM-dsDNA、4 U λ exo、10 U mL-1 T4 PNK和0.5 mM的ATP加入至30 μL反应缓冲液中（70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 8.0）, 并在37 ℃条件下培育不同时长（0、10、20、30、45、60 min）。加入100 μg mL-1的Fe-MIL-88，常温条件下培育30 min后，测定FAM荧光强度。实验结果如图4所示。
实施例5 考察pH值对磷酸化反应的影响，步骤如下：
将100 nM的FAM-dsDNA、4 U λ exo、10 U mL-1 T4 PNK和0.5 mM的ATP加入至30 μL不同pH值反应缓冲液中（70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2）,pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并在37 ℃条件下培育30 min。加入100 μg mL-1的Fe-MIL-88，常温条件下培育30 min后，测定FAM荧光强度。实验结果如图5所示。
实施例6 考察λ exo浓度对磷酸化反应的影响，步骤如下：
将100 nM的FAM-dsDNA、10 U mL-1 T4 PNK、0.5 mM的ATP和不同单位λ exo（0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 U）加入至30 μL反应缓冲液中（70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH8.0）, 并在37 ℃条件下培育30 min。加入100 μg mL-1的Fe-MIL-88，常温条件下培育30min后，测定FAM荧光强度。实验结果如图6所示。
实施例7 对T4 PNK活性定量检测，步骤如下：
将不同浓度的T4 PNK（0、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、1.4、1.6、2.0、3.0、5.0、8.0、10、20 U mL-1）分别与100 nM的dsDNA-FAM、0.5 mM的ATP、4 U λ exo加入到30 μL 的反应缓冲液中（70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 8.0）。37 °C 培育30 min后，加入5 μL的Fe-MIL-88（100 μg mL-1），然后用488 nm激发波长进行荧光检测。实验结果如图7A、7B所示。
实施例8 实际细胞裂解液样品中T4 PNK酶活性定量检测，步骤如下：
细胞裂解液样品用水稀释100倍后冷冻保存待用，检测T4 PNK酶活性时，取少量细胞裂解液样品分散于反应缓冲液中（70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，pH 8.0）。将不同浓度的T4PNK（0、0.05、0.3、0.5、1.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、20 U mL-1）分别与100 nM的dsDNA-FAM、0.5 mM的ATP、4 U λ exo加入到30 μL 的上述包含细胞裂解液的反应缓冲液中。37 °C 培育30 min后，加入5 μL的Fe-MIL-88（100 μg mL-1），然后用488 nm激发波长进行荧光检测。实验结果如图8A、8B所示。

Claims (5)

1.一种高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）、合成金属有机骨架Fe-MIL-88：
以Fe3+为配位中心，BDC为有机配体，通过油浴法得到金属有机骨架Fe-MIL-88；
（2）、合成荧光素标记的FAM-dsDNA：
将荧光素标记的DNA单链FAM-ssDNA与其互补链退火合成双链FAM-dsDNA；
（3）、将细胞裂解液稀释，与步骤（2）所得FAM-dsDNA与 λ exo、 ATP加入至反应缓冲液中，在37 ℃条件下培育，进行FAM-dsDNA磷酸化反应及λ exo对磷酸化FAM-dsDNA的裂解得到FAM-ssDNA；
（4）、将步骤（1）所得Fe-MIL-88加入到步骤（3）的混合溶液中，步骤（3）反应所得FAM-ssDNA荧光被猝灭；测定FAM荧光强度，根据标准曲线，得到T4 PNK酶活性。
2.根据权利要求1所述的高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法，其特征在于，步骤（4）中，T4 PNK酶浓度在0.01-5.0 U mL-1范围内，T4 PNK酶活性与荧光强度呈线性关系。
3.根据权利要求1所述的高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法，其特征在于，步骤（4）中，所用Fe-MIL-88的浓度为50-300 μg mL-1。
4.根据权利要求3所述的高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法，其特征在于，步骤（4）中，所用Fe-MIL-88的浓度为100 μg mL-1。
5.根据权利要求1所述的高灵敏、快速定量检测T4 PNK酶的方法，其特征在于，步骤（3）中，当ATP浓度增大时，荧光强度比值先增大再减小，当ATP浓度增大至0.5 mM时，荧光强度比值达最大值；
随着磷酸化时间的增长，荧光强度逐渐减弱，当磷酸化时间达30 min时，荧光强度逐渐趋于稳定；
随λ exo浓度增大，荧光强度逐渐减弱，并在λ exo为4 U时，荧光强度达最小值逐渐趋于稳定；
随pH值增大，荧光强度比值先增大后减小，并在pH为8.0时，荧光强度比值达最大值。
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