CN112697858A - 基于磁性纳米材料测定t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,包括如下步骤:采用水热法制备Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子,ATP和T4 PNK存在时,核酸链S1的5′端磷酸化,末端磷酸化的S1通过与TiO2特异性反应,修饰到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面;加入金纳米粒子‑核酸链S2复合物(AuNPs‑S2),由于核酸链S1和S2之间的杂交反应,形成Fe3O4@TiO2‑S1/S2‑AuNPs复合物;以六氨基合钌[Ru(NH3)6 3+]为电活性指示剂,通过GME表面的磁性富集和电化学信号增强,实现对T4PNK活性的高灵敏、快速和定量测定。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析或生化技术领域,具体涉及一种基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法。
背景技术
T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是一种由噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质,具有5'激酶活性,可催化核酸5'羟基末端进行磷酸化,与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关。此外,T4 PNK还是一种重要的分子生物学工具,T4 PNK的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前,T4 PNK已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶,并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此,测定T4 PNK的活性在生物化学及分子生物学领域都有重要意义。
磁性纳米粒子同时具有纳米材料性质和磁学特性。四氧化三铁 (Fe3O4)磁性纳米粒子具有超顺磁性、比表面积大、优异的吸附性能、低毒性及表面原子配位不足等特点,常作为一些复合材料的载体或磁核用于富集分离过程。纳米二氧化钛(TiO2)是一种新型无机半导体材料,具有比表面积大、生物相容性好、吸附能力强、导电性好、化学惰性强和制造成本低等特性,在磷酸化蛋白选择性富集和光催化活性方面表现出广阔应用前景。采用磁性Fe3O4为核,负载TiO2纳米壳层材料,制备得到的Fe3O4@TiO2核壳纳米复合材料,不仅可以保持TiO2纳米材料的高催化活性,并且可以维持磁性核材料的强磁性,实现对磷酸化蛋白/多肽的高选择性和特异性富集和分析。
测定T4 PNK活性的方法主要是放射性同位素32P、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影法等。这些方法普遍存在不连续、耗时耗力且操作复杂、需要高素质人员、易产生放射性污染等缺点。近年来,发展了一些新的T4 PNK活性的检测方法,例如电化学方法、石英晶体微天平技术、化学发光法、荧光法、单分子荧光成像技术等。虽然此类方法灵敏度较高,但是操作过程繁琐,成本较高,其应用受到一定程度的限制。针对目前测定方法存在的缺点或不足,需要发展新型、简单方便的T4 PNK活性检测方法。
目前,缺乏一种实现对T4 PNK活性的高灵敏、快速和定量测定的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足之处,本发明的目的是提供一种实现对T4 PNK活性的高灵敏、快速和定量测定的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法。
为了实现上述技术目的,本发明采用的技术方案的如下:本发明的一种基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,包括如下步骤:(1)设计寡核苷酸序列;
(2)Fe3O4磁性纳米粒子;
(3)Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子:采用Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子,在ATP和T4PNK存在下,核酸链S1的5′端磷酸化后与TiO2特异性反应,连接到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面;
(4)AuNPs-S2纳米粒子的制备;
(5)构建电化学生物传感器
将ATP和T4 PNK分别加入核酸链S1缓冲溶液,37℃培育4小时,加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液培育4小时;之后加入 AuNPs-S2纳米粒子溶液,37℃培育2-3小时;然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极GME表面,PBS缓冲液洗涤电极后,滴加 [Ru(NH3)6]3+电活性物质,测量电极的电化学响应信号;
(6)测定T4多核苷酸激酶活性,使用电化学工作站以三电极体系进行测试,采用微分脉冲伏安法DPV进行定量,绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线。
进一步地,在步骤(1)中,所述的核酸链S1具有SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列;所述的核酸链S2具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;
在步骤(2)中,首先采用水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子,将 FeCl3溶解于乙二醇,加入NaAc和聚乙二醇,搅拌溶解后转移至聚四氟乙烯高压釜中,200℃反应8小时,冷却至室温,用乙醇洗涤数次,磁力分离,室温下干燥,得到Fe3O4磁性纳米粒子;
在步骤(3)中,取冰醋酸和钛酸丁酯溶于乙醇,加入Fe3O4纳米粒子,超声分散后加入聚乙二醇和尿素,搅拌溶解后将混合物转移到反应容器中,180℃反应8小时,过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次, 80℃干燥12小时,得到Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子;
在步骤(4)中,AuNPs-S2纳米粒子的制备
将核酸链S2溶解于PBS缓冲液,加入AuNPs溶液,37℃培育4 小时,加入胶体溶液并静置4小时,用PBS缓冲液洗涤,离心分离,制得AuNPs-S2纳米粒子;
在步骤(5)中,
加入金纳米粒子-核酸链S2复合物(AuNPs-S2),核酸链S1和S2 之间通过特异性杂交反应,AuNPs被修饰到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面,形成Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs复合物;
在步骤(6)中,采用工作电极以六氨基合钌[Ru(NH3)6 3+]为电活性指示剂,通过GME表面的磁性富集和电化学信号增强,实现对T4 PNK活性的定量测定。
进一步地,在步骤(6)中,T4多核苷酸激酶活性的测定
将ATP和T4 PNK加入核酸链S1缓冲溶液,37℃培育4小时,加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液,培育2小时;之后加入AuNPs-S2纳米粒子溶液,37℃培育2小时;然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极(GME)表面,PBS缓冲液洗涤电极后,滴加[Ru(NH3)6]3+电活性物质,电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号放大;使用电化学工作站测量电化学响应信号,根据电化学信号大小对T4 PNK的活性进行定量测定。
更进一步地,在步骤(1)中,所述的核酸链S1的长度为20个碱基,所述的核酸链S2的长度为19个碱基,核酸链S1的用量和浓度分别为10μL和10OD/mL;在步骤(3)中,Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子的直径为400nm。
进一步地,在步骤(5)中,ATP的浓度为10mM,T4 PNK的浓度为0.0001-10U/mL;AuNP-S2的用量和浓度分别为10μL和15 μM;S1磷酸化反应的时间为4h;S1修饰到Fe3O4@TiO2表面的时间为2h;S1和S2杂交的时间为2h;体系中的反应温度和杂交温度为37℃。
进一步地,在步骤(6)中,工作电极为直径为3mm的磁性金电极;电化学测量体系中[Ru(NH3)6]3+的用量和浓度分别为100μL和 50μM;Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs复合物和[Ru(NH3)6]3+电活性指示剂通过磁性富集在电极表面;T4 PNK活性测定技术为微分脉冲伏安法。
更进一步地,在步骤(6)中,电化学信号放大技术是基于 Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs纳米粒子双重信号放大技术。
进一步地,在步骤(6)中,所述的工作电极为磁性金电极;所述的磁性金电极通过磁性富集实现电化学信号的增强。
有益效果:本发明实现对T4 PNK活性的高灵敏、快速和定量测定。
相对于现有技术,本发明具有以下优点:
(1)本发明提供了一种电化学技术检测T4多聚核苷酸激酶活性;
(2)本发明利用Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs纳米粒子双重信号放大技术提高测定T4 PNK活性的灵敏度;
(3)本发明利用磁性金电极通过磁性富集实现电化学信号增强;
(4)本发明设计了特定序列的DNA,提高了检测T4 PNK活性的选择性和特异性;
(5)本发明制备的电化学生物传感器可用于T4 PNK抑制剂 EDTA、Na2HPO4和(NH4)2SO4的检测。
附图说明
图1为使用本发明的磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的制备技术和检测原理示意图。
图2为使用本发明技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的标准曲线图,横坐标是T4PNK的活度,单位是U/mL,纵坐标是DPV响应峰电流,单位是μA。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是,这些实施例是本发明的阐释和举例,并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明的一种基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学方法
本发明基于Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs双重信号放大技术检测T4 PNK活性的方法原理如图1所示。首先制备 Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子,ATP和T4PNK存在下,核酸链S1的5′端磷酸化,末端磷酸化的S1通过与TiO2特异性反应,修饰到 Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面。之后加入AuNPs-S2纳米粒子,由于核酸链S1和S2之间的杂交反应,AuNPs被修饰到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面,形成Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs复合物。最后以磁性金电极(GME)为工作电极,以六氨基合钌[Ru(NH3)6 3+]为电活性指示剂,形成的Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs/[Ru(NH3)6]3+复合物通过磁性富集在电极表面实现电化学响应信号的放大。根据电化学响应信号的大小实现对T4PNK活性的定量测定。
实施例2
寡核苷酸序列设计
本发明所设计的寡核苷酸序列由中国上海Sangon生物工程有限公司合成,并通过HPLC纯化检验,冻干。本发明设计的寡核苷酸序列如下:所述的核酸链S1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列;所述的核酸链S2具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;
核酸链S1:5′-SH-CACTTGGTTGGTGTGGTTGG-3′;
核酸链S2:5′-ACACCAACCAAGTGATGAT-3′;将寡核苷酸溶解在超纯灭菌水中,-18℃保存备用。
实施例3
Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子制备
称取0.615g FeCl3·6H2O溶解于20mL乙二醇中,加入1.8g NaAc 和0.5g聚乙二醇,搅拌溶液后,转移至100mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压反应釜中,200℃下反应8小时,冷却至室温,用乙醇洗涤数次,磁力分离,室温下风干,得到Fe3O4磁性纳米粒子。取9.6mL 冰醋酸和6.8mL钛酸丁酯溶于60mL乙醇中,加入0.4g Fe3O4磁性纳米粒子,超声分散15min,加入2.4g聚乙二醇和3.6g尿素,电动搅拌1小时,然后将混合物转移至反应容器中在180℃结晶8小时。冷却至室温后,过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次,并在80℃下干燥12 小时,得到Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子。
实施例4
AuNPs-S2纳米粒子的制备
将核酸链S2溶解于10mM PBS缓冲液(含500μM三(2-羧乙基) 膦盐酸盐),转移至100mM pH 7.4PBS缓冲液(含0.1%Tween-20 和200mM NaCl),加入AuNPs溶液,37℃培育4小时。加入0.3M NaCl盐化胶体溶液,静置4小时。用100mM pH 7.4PBS缓冲液(含 500mM NaCl)洗涤三次,10000rpm离心分离20分钟,得到AuNPs-S2 纳米粒子。
实施例5
电化学生物传感器的制备
磁性金电极(GME)用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉打磨抛光,先后用超纯水、无水乙醇、超纯水超声洗涤;将GME放入piranha 溶液中浸泡30min,超纯水洗涤;在0.5M H2SO4溶液中采用循环伏安扫描30圈活化电极,电位范围-0.2~1.6V,扫速50mV/s,N2气吹干备用。
在10μL10 OD/mL核酸链S1溶液中,加入5μL 1mM ATP和不同浓度T4 PNK,37℃培育4小时,加入5μL5 mg/mLFe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液,培育2小时;用10mM pH 7.4PBS缓冲液洗涤后,加入10μL15μM AuNPs-S2纳米粒子溶液,37℃培育2小时;取10μL上述反应混合液滴涂于处理好的磁性金电极表面,用10mM pH 7.4PBS缓冲液冲洗电极,滴加100μL50μM[Ru(NH3)6]3+电活性物质,用10mM pH 7.4PBS缓冲液冲洗电极,得到T4 PNK电化学生物传感器。
实施例6
实施例6与实施例5的区别在于:
电化学生物传感器的制备
将ATP和T4 PNK分别加入核酸链S1缓冲溶液,37℃培育4小时,加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液培育4小时;之后加入 AuNPs-S2纳米粒子溶液,37℃培育3小时;然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极GME表面,PBS缓冲液洗涤电极后,滴加 [Ru(NH3)6]3+电活性物质,测量电极的电化学响应信号。
实施例7
实施例7与实施例5的区别在于:
电化学生物传感器的制备
将ATP和T4 PNK分别加入核酸链S1缓冲溶液,37℃培育4小时,加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液培育4小时;之后加入 AuNPs-S2纳米粒子溶液,37℃培育2.5小时;然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极GME表面,PBS缓冲液洗涤电极后,滴加 [Ru(NH3)6]3+电活性物质,测量电极的电化学响应信号。
实施例8
T4 PNK活性的测定
使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,磁性金电极为工作电极。采用微分脉冲伏安法测定T4 PNK活性,以10mM Tris-HCl(pH 7.4,0.1M NaCl)为缓冲液,电位范围为-0.4~0V,电位增幅为50mV,脉冲周期为20ms。微分脉冲曲线响应峰电流大小与T4 PNK浓度的标准曲线如图2所示,峰电流与T4 PNK浓度在0.0001-10U/mL范围内呈现良好的线性关系,相关系数R2为0.9951,线性方程为ipc(μA)=0.24logc+1.67,检出限为0.00003U/mL。本发明提出的传感器相比较其他传感器,具有更宽的线性范围和更低的检出限,采用Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs双重信号放大技术可实现T4 PNK活性的定量和灵敏测定。
实施例9
T4 PNK活性抑制剂的测定
将不同浓度的抑制剂EDTA、Na2HPO4和(NH4)2SO4与T4 PNK 缓冲液混合,实验方法相同,随着抑制剂浓度加大,T4 PNK的相对活性明显降低。当加入三种抑制剂浓度分别为12.5mM、7mM和6 mM时,T4 PNK的相对活性降低了50%,表明该方法可用于T4 PNK 抑制剂的检测分析。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南民族大学
<120> 基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(核酸链S1)
<400> 1
shcacttggttggtgtggttgg 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(核酸链 S2)
<400> 2
acaccaacca agtgatgat 19
Claims (8)
1.基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,其特征在于包括如下步骤:(1)设计寡核苷酸序列;
(2)Fe3O4磁性纳米粒子;
(3)Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子:
(4)AuNPs-S2纳米粒子的制备;
(5)构建电化学生物传感器:
将ATP和T4 PNK分别加入核酸链S1缓冲溶液,37℃培育4小时,加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液培育4小时;之后加入AuNPs-S2纳米粒子溶液,37℃培育2-3小时;然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极GME表面,PBS缓冲液洗涤电极后,滴加[Ru(NH3)6]3+电活性物质,测量电极的电化学响应信号;
(6)测定T4多核苷酸激酶活性,使用电化学工作站以三电极体系进行测试,采用微分脉冲伏安法DPV进行定量,绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线。
2.根据权利要求1所述的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,其特征在于:在步骤(1)中,所述的核酸链S1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列;所述的核酸链S2具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;
在步骤(2)中,首先采用水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子,将FeCl3溶解于乙二醇,加入NaAc和聚乙二醇,搅拌溶解后转移至聚四氟乙烯高压釜中,200℃反应8小时,冷却至室温,用乙醇洗涤数次,磁力分离,室温下干燥,得到Fe3O4磁性纳米粒子;
在步骤(3)中,取冰醋酸和钛酸丁酯溶于乙醇,加入Fe3O4纳米粒子,超声分散后加入聚乙二醇和尿素,搅拌溶解后将混合物转移到反应容器中,180℃反应8小时,过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次,80℃干燥12小时,得到Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子;
在步骤(4)中,AuNPs-S2纳米粒子的制备:
将核酸链S2溶解于PBS缓冲液,加入AuNPs溶液,37℃培育4小时,加入胶体溶液并静置4小时,用PBS缓冲液洗涤,离心分离,制得AuNPs-S2纳米粒子;
在步骤(5)中,
加入金纳米粒子-核酸链S2复合物(AuNPs-S2),核酸链S1和S2之间通过特异性杂交反应,AuNPs被修饰到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面,形成Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs复合物;
在步骤(6)中,采用工作电极以六氨基合钌Ru(NH3)6 3+为电活性指示剂,通过GME表面的磁性富集和电化学信号增强,实现对T4PNK活性的定量测定。
3.根据权利要求2所述的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,其特征在于:在步骤(6)中,T4多核苷酸激酶活性的测定:
将ATP和T4 PNK加入核酸链S1缓冲溶液,37℃培育4小时,加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液,培育2小时;之后加入AuNPs-S2纳米粒子溶液,37℃培育2小时;然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极(GME)表面,PBS缓冲液洗涤电极后,滴加[Ru(NH3)6]3+电活性物质,电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号放大;使用电化学工作站测量电化学响应信号,根据电化学信号大小对T4 PNK的活性进行定量测定。
4.根据权利要求3所述的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,其特征在于:在步骤(1)中,所述的核酸链S1的长度为20个碱基,所述的核酸链S2的长度为19个碱基,核酸链S1的用量和浓度分别为10μL和10OD/mL;在步骤(3)中,Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子的直径为400nm。
5.根据权利要求4所述的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,其特征在于:在步骤(5)中,ATP的浓度为10mM,T4PNK的浓度为0.0001-10U/mL;AuNP-S2的用量和浓度分别为10μL和15μM;S1磷酸化反应的时间为4h;S1修饰到Fe3O4@TiO2表面的时间为2h;S1和S2杂交的时间为2h;体系中的反应温度和杂交温度为37℃。
6.根据权利要求4所述的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,其特征在于:在步骤(6)中,工作电极为直径为3mm的磁性金电极;电化学测量体系中[Ru(NH3)6]3+的用量和浓度分别为100μL和50μM;Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs复合物和[Ru(NH3)6]3+电活性指示剂通过磁性富集在电极表面;T4 PNK活性测定技术为微分脉冲伏安法。
7.根据权利要求6所述的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,其特征在于:在步骤(6)中,电化学信号放大技术是基于Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs纳米粒子双重信号放大技术。
8.根据权利要求7所述的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,其特征在于:在步骤(6)中,所述的工作电极为磁性金电极;所述的磁性金电极通过磁性富集实现电化学信号的增强。
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