CN114839236A - 一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和碳纳米管复合材料测定t4多聚核苷酸激酶活性的方法 - Google Patents

一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和碳纳米管复合材料测定t4多聚核苷酸激酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列；(2)合成磷酸盐柱[5]芳烃；(3)采用超声分散制备磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料；(4)构建电化学生物传感器；(5)测定T4多核苷酸激酶活性；(6)测定T4多核苷酸激酶抑制剂；(7)实际样品测定。本发明操作简单、成本低、非放射性、灵敏度高、选择性好，基于磷酸盐柱[5]芳烃优异的主客识别特性和多壁碳纳米管比表面积大、稳定性好、导电性能优异的特点。

Description

一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和碳纳米管复合材料测定T4多聚 核苷酸激酶活性的方法
技术领域
本发明涉及生化分析技术领域，具体涉及一种基于磷酸盐柱[5] 芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。
背景技术
T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是从感染了噬菌体T4中分离得到，简称T4激酶，具有5'激酶活性，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移，与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关。此外，T4 PNK还是一种重要的分子生物学工具，T4 PNK的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前，T4 PNK已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶，并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此，测定T4 PNK的活性在生物化学及分子生物学领域都有重要意义。
柱芳烃(pillararene)是一类结构新颖的芳香族大环化合物，具有刚性的柱状结构，是继冠醚、环糊精、杯芳烃、葫芦脲之后的第五代经典大环宿主分子，由于其特殊的化学结构以及优良的主客体化学性质受到超分子研究者的关注。柱芳烃具备易于修饰、刚性空腔大小可调、热稳定性高、配体作用专一、结构刚性强、高度对称等特点，与客体分子表现出独特的主体和客体识别和络合性能。柱芳烃独特的空腔结构和易于修饰合成，良好的主客体性能和生物兼容性，在生物医用材料、药物包载、靶向传递和可控释放等方面具有应用潜力。磷酸盐柱芳烃是一种水溶性柱芳烃，具有亲水的边缘和疏水的刚性空腔，能容纳多种客体分子。碳纳米管是一维碳纳米材料和碳的一种同素异形体，由类似石墨的六边形网格组成的管状物，分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管。多壁碳纳米管(MWCNTs)是由若干个单层管同心套迭而成，具有同心圆柱结构。因其独特的结构和优异的性能，多壁碳纳米管在纳电子器件、能量存储器件、复合材料、传感器等诸多领域具有广泛应用。硫堇(Thionin)是一种阳离子染料，可用于细胞和蛋白等生物染色。硫堇作为客体分子，可与磷酸盐柱芳烃主体络合，进入磷酸盐柱芳烃的空腔形成络合物，产生电化学信号，构建高灵敏的电化学传感器。
测定T4 PNK活性的方法主要有放射性同位素32P、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影法等。这些方法普遍存在不连续、耗时耗力且操作复杂、需要高素质人员、易产生放射性污染等缺点。近年来，发展了一些新的T4 PNK活性的检测方法，例如比色分析法、荧光分析法、电化学分析法、化学发光法及荧光成像分析技术等。虽然此类方法灵敏度较高，但是操作过程繁琐，成本较高，其应用受到一定程度的限制。
目前，缺乏一种实现对T4 PNK活性的高灵敏度、高选择性、快速和定量检测的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定 T4多聚核苷酸激酶活性的方法。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种灵敏度高，选择性好的测定T4多核苷酸激酶活性的电化学生物传感方法。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列：所述的DNA底物链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的DNA底物链的长度为21个碱基，5′端标记羟基，3′端标记巯基；
(2)合成磷酸盐柱[5]芳烃：以1,4-二(2-羟基乙氧基)苯为原料，采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；
(3)采用超声分散制备磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料；
(4)构建电化学生物传感器：DNA底物链通过形成金-硫键固定在金电极表面，MCH封闭，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料连接到电极表面，琉堇客体分子通过主体和客体识别作用进入复合材料中磷酸盐柱[5]芳烃的空腔形成主体和客体络合物，实现电化学响应信号放大；
(5)测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线；
(6)测定T4多核苷酸激酶抑制剂；
(7)实际样品测定。
进一步地，在步骤(2)中，称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应5h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇(体积比为1:1)溶液洗涤，得到化合物2；称取1.6g化合物2和 0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应6h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化(石油醚/二氯甲烷，体积比为1:1)，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下 165℃搅拌72h，减压浓缩，柱层析纯化(甲醇/乙酸乙酯，体积比为 1:2)，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌72h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌30min，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌72h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
进一步地，在步骤(3)中，所述的多壁碳纳米管的长度为50μm，外径为10nm，内径为4nm；称取4mg多壁碳纳米管放入20mL 1 mg/mL磷酸盐柱[5]芳烃溶液中，室温下超声分散6h，得到磷酸盐柱 [5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料溶液。
更进一步地，在步骤(4)中，在预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μM DNA底物链溶液，30℃下孵育2h，在1mM MCH溶液中室温孵育15min，PBS缓冲液冲洗；之后电极在DNA反应缓冲液(含1.5 mMATP和不同浓度T4 PNK)中，37℃下磷酸化反应20min，PBS 缓冲液冲洗；电极表面滴涂5μL 1mg/mL TiO2纳米粒子溶液，室温下反应30min，继续滴涂5μL磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料溶液，室温下反应1h，PBS缓冲液冲洗；最后将电极浸入1mM琉堇溶液中室温静置1.5h，PBS缓冲液冲洗，制得T4 PNK电化学传感器。
进一步地，在步骤(4)中，所述的主体为磷酸盐柱[5]芳烃，客体为琉堇分子，介导为二氧化钛纳米粒子。
进一步地，在步骤(4)中，DNA底物链溶液的用量和浓度分别为5μL和1μM；DNA底物链的孵育温度和时间分别为30℃和2h； MCH溶液的浓度为1mM，孵育时间为15min；DNA反应缓冲液中 ATP的浓度为1.5mM，T4 PNK的浓度为0.00001至5U/mL，磷酸化反应的温度和时间分别为37℃和20min；TiO2纳米粒子溶液的用量和浓度分别为5μL和1mg/mL，反应温度和时间分别为室温和30 min；磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料溶液的用量为5μL，反应温度和时间分别为室温和1h；琉堇溶液的浓度分别1mM，反应温度和时间分别为室温和1.5h。
更进一步地，在步骤(4)中，所述的磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料中磷酸盐柱[5]芳烃与琉堇形成主体和客体络合物，琉堇客体通过静电相互作用和电荷转移相互作用进入磷酸盐柱[5]芳烃主体的空腔中。
进一步地，在步骤(5)中，使用电化学工作站测量电化学响应信号，根据电化学信号大小对T4 PNK的活性进行定量测定。
进一步地，在步骤(6)中，所述的T4多核苷酸激酶抑制剂为硫酸铵((NH4)2SO4)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、二磷酸腺苷(ADP)；在步骤(7)中，所述的实际样品为HeLa细胞。
有益效果：本发明操作简单、成本低、非放射性、灵敏度高、选择性好，基于磷酸盐柱[5]芳烃优异的主客识别特性和多壁碳纳米管比表面积大、稳定性好、导电性能优异的特点。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明提供了一种电化学技术检测T4多聚核苷酸激酶活性，本发明利用磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料提高了测定T4 PNK的选择性。本发明利用磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料产生放大的电化学响应信号提高了测定T4 PNK活性的灵敏度。
(2)本发明制备的电化学生物传感器可用于T4 PNK抑制剂硫酸铵((NH4)2SO4)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和二磷酸腺苷(ADP) 的检测，本发明制备的电化学生物传感器可用于实际样品HeLa细胞中T4 PNK活性的测定。
(3)本发明以琉堇(Thi)为电活性客体分子，利用二氧化钛 (TiO2)纳米粒子的介导作用，构建了一种电化学生物传感器用于 T4 PNK活性检测；设计的DNA底物链通过形成金-硫键固定在金电极表面，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料连接到电极表面，琉堇客体分子通过主体和客体识别作用进入复合材料中磷酸盐柱[5]芳烃的空腔形成主体和客体络合物，实现电化学响应信号放大；产生的电化学信号与T4 PNK浓度成正比，实现对 T4PNK的高灵敏度和高选择性测定。
附图说明
图1为本发明的磷酸盐柱[5]芳烃和和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的制备技术和检测原理示意图。
图2为本发明的磷酸盐柱[5]芳烃的合成路线图。
图3为本发明技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的工作曲线图，横坐标是T4 PNK的浓度，单位是U/mL，纵坐标是DPV响应峰电流，单位是μA。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4 PNK活性的方法原理如图1所示。首先DNA寡核苷酸3'端通过形成金-硫键固定在金电极上，利用MCH封闭电极表面。在ATP和T4 PNK 的存在下，DNA寡核苷酸5'端-OH被磷酸化-PO4。以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料连接到电极表面，琉堇客体分子通过主体和客体识别作用进入复合材料中磷酸盐柱[5]芳烃的空腔形成主体和客体络合物，实现电化学响应信号放大，产生的电化学信号与T4 PNK浓度成正比，实现对T4 PNK的定量检测。
(1)DNA寡核苷酸序列设计
本发明所设计的DNA寡核苷酸序列由中国大连Takara生物技术有限公司合成，并通过HPLC纯化检验，冻干。本发明设计的寡核苷酸序列如下：
所述的DNA底物链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列： 5′-HO-GTG CTG GTC GTGCTG TAG TAG-SH-3′；
将寡核苷酸溶解在超纯灭菌水中，-18℃保存备用。
(2)磷酸盐柱[5]芳烃的合成
磷酸盐柱[5]芳烃采用艾伯佐夫(Arbuzov)反应和麦肯纳 (McKenna)反应合成，合成过程如图2所示。称取10g化合物1 (1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL 乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL 乙腈)，室温下反应5h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇(体积比为1:1)溶液洗涤，得到化合物2。称取1.6g 化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL 1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应6h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化(石油醚/二氯甲烷，体积比为1:1)，得到化合物3。称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌72h，减压浓缩，柱层析纯化(甲醇/乙酸乙酯，体积比为1:2)，得到化合物4。称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌72h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌30min，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5。称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌72h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
(3)磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料的制备：
采用超声分散法制备磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料，称取4mg多壁碳纳米管放入20mL 1mg/mL磷酸盐柱[5]芳烃溶液中，室温下超声分散6h，得到磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料溶液。
(4)构建电化学生物传感器：
DNA底物链通过形成金-硫键固定在金电极表面，MCH封闭，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料连接到电极表面，琉堇客体分子通过主客体识别作用进入复合材料中磷酸盐柱[5]芳烃的空腔形成主客体络合物，实现电化学响应信号放大；
金电极(直径3mm)先在piranha溶液中浸泡10分钟，超纯水冲洗，之后依次用粒径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光，依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声清洗；在0.5M H2SO4溶液中采用循环伏安扫描30圈活化电极，电位范围-0.2～1.6V，扫速0.1V/s， N2气吹干备用。
预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μM DNA溶液，30℃下孵育2 h，在1mM MCH溶液中孵育15min，PBS缓冲液冲洗；之后将电极在DNA反应缓冲液(含1.5mMATP和不同浓度T4 PNK)中，37℃下磷酸化反应20min，PBS缓冲液冲洗；电极表面滴涂5μL 1mg/mL TiO2纳米粒子溶液，室温下反应30min，继续滴涂5μL磷酸盐柱[5] 芳烃和多壁碳纳米管复合材料溶液，室温下反应1h，PBS缓冲液冲洗；最后将电极浸入1mM琉堇溶液中室温静置1.5h，PBS缓冲液冲洗，得到T4 PNK电化学传感器。
(5)测定T4多核苷酸激酶活性
使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法 DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线。
使用电化学工作站以三电极体系进行测试，金电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。采用微分脉冲伏安法测定T4 PNK活性，以100mM PBS(pH7.4)为缓冲液，电位范围为-0.5～-0.1V，电位增幅为50mV，脉冲周期为50ms。微分脉冲曲线响应峰电流与T4 PNK浓度的关系曲线及工作曲线如图3所示，峰电流与T4 PNK浓度在0.00001-5U/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.9998，线性方程为ipc(μA)＝0.20logc+1.63，检出限为0.00001U/mL。本发明提出的传感器相比较其他传感器，具有更宽的线性范围和更低的检出限，采用磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料构建的电化学传感器可实现对T4 PNK活性的定量和灵敏测定。
(6)测定T4多核苷酸激酶抑制剂：
将不同浓度的抑制剂硫酸铵((NH4)2SO4)、乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)、二磷酸腺苷(ADP)和与T4 PNK缓冲液混合，实验方法相同，随着抑制剂浓度加大，T4 PNK的相对活性明显降低。当加入上述三种抑制剂浓度分别为6.07mM、2.69mM和2.17mM时，T4 PNK的相对活性降低了50％，表明该方法可用于T4PNK抑制剂的检测分析。
(7)实际样品测定：所述的实际样品为HeLa细胞。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 云南民族大学
<120> 一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法
<130> 2022
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA底物链)
<400> 1
gtgctggtcg tgctgtagta g 21

Claims (9)

1.一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列：所述的DNA底物链具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；所述的DNA底物链的长度为21个碱基，5′端标记羟基，3′端标记巯基；
(2)合成磷酸盐柱[5]芳烃：以1,4-二(2-羟基乙氧基)苯为原料，采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；
(3)采用超声分散制备磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料；
(4)构建电化学生物传感器：DNA底物链通过形成金-硫键固定在金电极表面，MCH封闭，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料连接到电极表面，琉堇客体分子通过主体和客体识别作用进入复合材料中磷酸盐柱[5]芳烃的空腔形成主体和客体络合物，实现电化学响应信号放大；
(5)测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线；
(6)测定T4多核苷酸激酶抑制剂；
(7)实际样品测定。
2.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(2)中，称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应5h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇(体积比为1:1)溶液洗涤，得到化合物2；称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL 1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应6h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化(石油醚/二氯甲烷，体积比为1:1)，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌72h，减压浓缩，柱层析纯化(甲醇/乙酸乙酯，体积比为1:2)，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌72h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌30min，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌72h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。
3.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的多壁碳纳米管的长度为50μm，外径为10nm，内径为4nm；称取4mg多壁碳纳米管放入20mL 1mg/mL磷酸盐柱[5]芳烃溶液中，室温下超声分散6h，得到磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料溶液。
4.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(4)中，在预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μMDNA底物链溶液，30℃下孵育2h，在1mM MCH溶液中室温孵育15min，PBS缓冲液冲洗；之后电极在DNA反应缓冲液(含1.5mM ATP和不同浓度T4 PNK)中，37℃下磷酸化反应20min，PBS缓冲液冲洗；电极表面滴涂5μL 1mg/mL TiO2纳米粒子溶液，室温下反应30min，继续滴涂5μL磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料溶液，室温下反应1h，PBS缓冲液冲洗；最后将电极浸入1mM琉堇溶液中室温静置1.5h，PBS缓冲液冲洗，制得T4 PNK电化学传感器。
5.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述的主体为磷酸盐柱[5]芳烃，客体为琉堇分子，介导为二氧化钛纳米粒子。
6.根据权利要求4所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(4)中，DNA底物链溶液的用量和浓度分别为5μL和1μM；DNA底物链的孵育温度和时间分别为30℃和2h；MCH溶液的浓度为1mM，孵育时间为15min；DNA反应缓冲液中ATP的浓度为1.5mM，T4 PNK的浓度为0.00001至5U/mL，磷酸化反应的温度和时间分别为37℃和20min；TiO2纳米粒子溶液的用量和浓度分别为5μL和1mg/mL，反应温度和时间分别为室温和30min；磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料溶液的用量为5μL，反应温度和时间分别为室温和1h；琉堇溶液的浓度分别1mM，反应温度和时间分别为室温和1.5h。
7.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述的磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料中磷酸盐柱[5]芳烃与琉堇形成主体和客体络合物，琉堇客体通过静电相互作用和电荷转移相互作用进入磷酸盐柱[5]芳烃主体的空腔中。
8.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(5)中，使用电化学工作站测量电化学响应信号，根据电化学信号大小对T4 PNK的活性进行定量测定。
9.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和多壁碳纳米管复合材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述的T4多核苷酸激酶抑制剂为硫酸铵((NH4)2SO4)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、二磷酸腺苷(ADP)；在步骤(7)中，所述的实际样品为HeLa细胞。
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