CN115491410A - 二氧化钛/锌铝水滑石类氧化物纳米材料在寡核苷酸测序中的应用 - Google Patents
二氧化钛/锌铝水滑石类氧化物纳米材料在寡核苷酸测序中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了TiO2/ZnAl‑LDO纳米材料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。合成的TiO2/ZnAl‑LDO材料兼有高紫外光吸收性能和电荷传导性能，在对寡核苷酸序列的测定中，水或甲醇作为TiO2/ZnAl‑LDO纳米颗粒的溶剂在激光的诱导下在TiO2/ZnAl‑LDO表面生成羟基自由基或甲醇自由基等活性分子，诱导寡核苷酸磷酸骨架的断裂，产生长度不同的碎片进入质谱进行检测。通过对碎片离子的分析，即可推测获得寡核苷酸序列。本发明方法对寡核苷酸的测序具有快速高通量、谱图解析简单、碎片信号强度高的特点，无需与其他外置设备耦合或进行串联质谱分析。
Description
技术领域
本发明涉及寡核苷酸生化分析领域，具体涉及TiO2/ZnAl-LDO纳米材料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。
背景技术
寡核苷酸是指由2-30个核苷酸以磷酸二酯键连接而成的多核苷酸片段，其在生物遗传信息的存储、处理和表达中起着至关重要的作用。生物内源性的寡核苷酸如miRNA，与植物动物的生长、器官的发育，细胞的凋亡和增殖有关，还可调节造血干细胞的分化，调节癌基因和抑癌基因的表达。外源性的寡核苷酸如反义寡核苷酸可作为药物分子转染mRNA使目标基因沉默。此外，具有一定空间结构的核酸适配体作为寡核苷酸的一种，可与目标靶分子形成类似抗原-抗体的复合物，继而广泛用于细胞成像、新药研发、与微生物检测等领域。因此，尽管寡核苷酸仅由4种核糖核酸构成，但不同排列组合所构成的丰富的一级序列信息使其具有完全不同的功能。
目前寡核苷酸序列的确定主要包括间接法和直接法两种，间接法主要是先将寡核苷酸反转录为相应的cDNA，然后用现有的DNA测序方法来对其cDNA序列进行测定并且最终推测出其原始序列，间接法通量较高但一定程度上存在反转录错配的可能性。直接法测序主要依靠RNA酶在RNA特定位点剪切或终止延伸，从而识别该位点核苷酸类型以达到测序的目的，直接法测序过程复杂且通量较低因此缺乏广普性。质谱技术从不同核苷酸质荷比不同的角度出发对寡核苷酸进行测序，通过质谱解离技术使寡核苷酸碎裂产生不同断裂位点的片段，根据片段质荷比信息倒推序列信息，其得到的序列信息更丰富，准确度更高，通量更大。
关于利用质谱解离技术对寡核苷酸序列进行测定在早期的一些研究报道中大多采用碰撞诱导解离(Collision Induced Dissociation，CID)和高能碰撞解离(HigherCollisional Dissociation，HCD)技术。上述解离技术由于二次解离所产生的碎片类型及噪音信号较多使得谱图复杂，且大多数碎片峰信号较低，对碎片峰的归属造成难度。近年来与红外激光发射器耦合的红外多光子解离技术(Infra-Red Multi-Photon Dissociation，IRMPD)或与紫外激光发射器耦合的紫外激光解离技术(Ulta-Violet PhotonDissociation，UVPD)使得待测寡核苷酸首先吸收能量处于高能状态再进行解离，能够提供较高的序列覆盖度，但也存在碱基部分二次丢失的问题，使得修饰位点无法得知，且由于需要与激光器耦合对实验条件的要求较高。
发明内容
本发明针对现行的寡核苷酸测序技术的技术问题，克服上述背景技术中提到的不足和缺陷，提供TiO2/ZnAl-LDO纳米材料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用，具体为一种快速、高通量，谱图简单易解析且不与其他设备耦合的直接质谱测序方法。利用TiO2/ZnAl-LDO纳米材料作为基质，在基质辅助激光解吸电离行时间质谱中，溶剂分子在激光的诱导下在纳米颗粒的表面生成羟基自由基或甲醇自由基等活性分子，活性分子进攻寡核苷酸磷酸骨架在不同位点产生a、b、c、d、w、x、y、z型碎片离子，不同长度的寡核苷酸碎片由于质荷比的不同能够在质谱内产生特征信号峰，根据信号峰的质荷比可归属为不同碎片离子即可拼凑出寡核苷酸序列。
TiO2/ZnAl-LDO纳米材料(即二氧化钛/锌铝水滑石类氧化物纳米材料)作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。
所述寡核苷酸长度在2-30nt，更优选2-10nt，最优选为2-6nt。
所述的应用，其特征在于，具体包括：
1)、基质制备：
制备TiO2/ZnAl-LDO纳米材料，通过溶解基质的溶剂配制TiO2/ZnAl-LDO纳米材料溶液；
2)、样品制备：
配制待测寡核苷酸的水溶液；
3)、靶板点样：
分别取等体积的待测寡核苷酸溶液和TiO2/ZnAl-LDO纳米材料基质溶液，采用薄层法进行点样和干燥，获得点样后的靶板；
4)、点样后的靶板送入MALDI质谱仪，进行MALDI质谱分析。
步骤1)中，制备TiO2/ZnAl-LDO纳米材料，具体包括：
1.1)将Zn(NO3)2·6H2O和Al(NO3)3·9H2O溶解在水中，超声使其充分溶解并记为A液；
1.2)将Na2MoO4·2H2O和NaOH溶于水中超声并作为B液；
1.3)将A液和B液分别放入两个滴漏斗中，然后将其滴入20～30℃的包含TiO2的水中，同时控制滴速，使溶液的pH为8.5～9.5，滴完后，继续在20～30℃下搅拌20～40min，并于搅拌晶化，离心，洗涤至中性，干燥，并在350～450℃马弗炉中煅烧2～4h，得到TiO2/ZnAl-LDO纳米材料。
步骤1.3)中，60～70℃搅拌晶化10～14h。
步骤1)中，所述的溶解基质的溶剂为甲醇、水或甲醇与水的混合溶剂。
步骤3)中，采用薄层法进行点样和干燥，具体包括：
将TiO2/ZnAl-LDO纳米材料基质溶液滴加到金属靶片上，待风干后，再滴加待测寡核苷酸溶液，继续风干后，获得点样后的靶板。
进一步优选，将TiO2/ZnAl-LDO纳米材料滴加到MALDITOF MS的金属靶片上，待风干后，再滴加寡核苷酸溶液，继续风干后，进行MALDI-TOFMS检测。
步骤3)中，所述的TiO2/ZnAl-LDO纳米材料基质溶液中TiO2/ZnAl-LDO纳米材料的浓度为0.5-10mg/mL；
所述的待测寡核苷酸溶液中寡核苷酸浓度为0.5-10nmol/μL(优选5nmol/μL)。
步骤4)中，所述的MALDI质谱分析采用的离子源检测模式为负离子模式。
步骤4)中，所述的MALDI质谱分析采用的离子检测器检测模式为反射模式或线性模式。
本发明提供了一种用于寡核苷酸的核苷酸序列进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
1、基质制备
制备TiO2/ZnAl-LDO纳米材料，配制TiO2/ZnAl-LDO纳米材料溶液。
2、样品制备
配制待测寡核苷酸的水溶液。
3、靶板点样
分别取等体积的待测寡核苷酸溶液和TiO2/ZnAl-LDO纳米材料基质溶液，采用薄层法进行点样和干燥，获得点样后的靶板。
4、点样后的靶板送入MALDI质谱仪，进行MALDI质谱分析。
步骤1中，优选上述TiO2/ZnAl-LDO纳米材料通过以下方法制得：
将1.7820g Zn(NO3)2·6H2O和0.7500g Al(NO3)3·9H2O溶解在20mL超纯水中，超声15min使其充分溶解并记为A液。将1.9356g Na2MoO4·2H2O和0.8000g NaOH溶于20mL超纯水中超声15min并作为B液。然后，将A液和B液分别放入两个滴漏斗中。然后将其滴入25℃的20mL包含0.1600g TiO2的去离子水中，同时控制滴速，使溶液的pH恒定为10。滴完后，继续在25℃下搅拌30min，并于65℃搅拌晶化12h,离心,洗涤至中性，干燥，并在400℃马弗炉中煅烧3h，得到TiO2/ZnAl-LDO纳米材料，当将该纳米材料作为基质用于MALDI-TOF MS检测中时，可以将该材料在溶剂中重悬后再使用。
所述使用的二氧化钛纳米颗粒粒径为1-100nm，TiO2/ZnAl-LDO基质浓度为0.5-10mg/mL；
所述溶解基质的溶剂包括甲醇或水，均为色谱级溶剂；
步骤2中，所述寡核苷酸长度为2-6nt；
所述配制待测寡核苷酸的水溶液为DEPC处理水；
所述寡核苷酸溶液浓度为0.5-10nmol/μL；
步骤3中，所述的寡核苷酸溶液的点样体积为0.5-2.0μL；
所述的TiO2/ZnAl-LDO基质溶液的点样体积为0.5-2.0μL；
所述的薄层法为先点基质溶液，室温干燥，然后在此基础上点样品溶液，再次室温干燥；
步骤4中，所述的MALDI质谱分析为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，简称为MALDI质谱；
所述的MALDI质谱分析采用的离子源检测模式为负离子模式；
所述的MALDI质谱分析采用的离子检测器检测模式为反射模式或线性模式。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本方法为直接法测序，不需要经过复杂的反转录及PCR扩增过程，其前处理简单且检测通量较高。
2、本方法利用激光诱导纳米粒子表面产生的自由基进行解离，无需外置设备提供能量，技术要求更低。
3、利用自由基进行解离，其自由基进攻位点更加固定，质谱谱图更加简单且碎片离子丰度更高，在碎片离子的归属上更容易。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实例1制得的TiO2/ZnAl-LDO纳米材料的SEM图；
图2为实例1制得的TiO2/ZnAl-LDO纳米材料的X射线衍射图；
图3为实例1制得的TiO2/ZnAl-LDO纳米材料的紫外-可见光吸收光谱图；
图4为TiO2/ZnAl-LDO纳米材料作为基质检测2nt寡核苷酸信号结果；
图5为2nt寡核苷酸分子结构及不同位点断裂产生碎片离子的质荷比信息；
图6为6nt寡核苷酸分子结构；
图7为TiO2/ZnAl-LDO纳米材料作为基质检测6nt寡核苷酸信号结果；
图8为TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液在有无紫外光照射下的电子顺磁波谱结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的具体型号为UlraflextremeMALDI-TOF/TOFMS(BrukerDaltonic,Germany)，激光器采用355nm波长的Nd：YAG激光器。所有检测均在负离子模式检测；离子源1电压，20.00kV；离子源2电压，17.75kV；透镜电压，8.50kV；延迟引出时间，100ns；反射器电压1，21.10kV；反射器电压2，10.7kV。所用靶板为384抛光板(MTP 384polished steel)，质谱数据分析采用BrukerFlexanalysis3.4软件。
下面简写词或外文术语的使用贯穿本发明：
TiO2 二氧化钛
ZnAl-LDO 锌铝层状双金属氧化物；
miRNA 微小核糖核酸；
RNA 核糖核酸；
cDNA 互补脱氧核糖核酸；
DNA 脱氧核糖核酸；
℃ 摄氏度；
min 分钟；
g 克；
nm 纳米；
nt 核苷酸；
DEPC 焦碳酸二乙酯；
mg/mL 毫克/毫升；
nmol/μL 纳摩尔/微升；
kV 千伏；
m/z 质荷比；
SEM 扫描电子显微镜；
XRD X射线衍射
A 腺苷酸；
G 鸟苷酸；
C 胞苷酸；
U 尿苷酸；
B 碱基；
p 磷酸基团；
Da 道尔顿；
实例一：TiO2/ZnAl-LDO的制备和表征
采用共沉淀法制备了TiO2/ZnAl-LDO。先将1.7820g六水合硝酸锌和0.7500g九水合硝酸铝超声溶解于20mL超纯水中。再将1.9356g二水合钼酸钠和0.8000g氢氧化钠超声溶解于20mL超纯水中。然后，两组溶液滴入装有20mL 0.08mg/mL二氧化钛的三孔烧瓶中，保持温度为25℃。通过控制滴加速度控制溶液的pH值为10，以确保所制备的材料具有均匀的粒径和较高的纯度。滴完后，在25℃下搅拌30min，然后在65℃下结晶12h，离心后分别用乙醇和水洗涤，直到pH＝7，最后在400℃的马弗炉中焙烧3h。然后在水或甲醇等溶剂中分散，在4℃保存备用。
对上述制得的TiO2/ZnAl-LDO纳米复合材料进行表征检测，其扫描电镜(SEM)图见图1，X射线衍射(XRD)图见图2，0.02mg/mLTiO2/ZnAl-LDO纳米复合材料甲醇溶液的紫外-可见吸收光谱图见图3。
由图1可知，该纳米复合材料为球形TiO2负载在片状ZnAl-LDO上，TiO2粒径约为20nm,ZnAl-LDO宽度为200nm，厚度为10nm。
由图2可知，11.7°、23.5°和39.2°的衍射峰分别对应于ZnAl LDH的(003)、(006)和(015)晶面。此外，31.9°、34.6°、36.9°三个峰，可归属为ZnO的特征峰，而位于25.3°、48.1°和27.4°、41.2°、54.3°的衍射峰分别为锐钛矿相和金红石相。
由图3可知，TiO2/ZnAl-LDO纳米复合材料在355nm波长处有较好的吸光度，在MALDI质谱中能够很好的吸收激光能量并传递至待测分子使待测分子电离。
实例二：以TiO2/ZnAl-LDO作为基质对2nt寡核苷酸测序
(1)配制5pmol/μL的2nt寡核苷酸，寡核苷酸序列为ApC,在-80℃冰箱保存；
(2)配制1mg/mL实施例1中的TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液，可在4℃冰箱保存；
(3)分别取1μL步骤1中的寡核苷酸溶液与1μL步骤2中的TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液，依次点在抛光靶板同一点样孔，室温25℃下自然干燥。
(4)将靶板送入MALDI质谱仪，选用负离子反射模式进行数据采集。
实施例2中，图4为以TiO2/ZnAl-LDO为基质检测ApC寡核苷酸的MALDI质谱图。图5为ApC寡核苷酸的结构图及可能碎裂位点及相应碎片的质荷比。574.569Da对应[ApC-H]-峰，346.868Da对应d-碎片离子峰，322.643Da对应w-碎片离子峰，116.984Da对应[a-B]-碎片离子峰。可见，以TiO2/ZnAl-LDO为基质在MALDI质谱中能够实现寡核苷酸断裂形成不同断裂位点的碎片离子，通过碎片离子质荷比可以与实际的寡核苷酸碎裂产生映射，进而实现测序。
实例三：以TiO2/ZnAl-LDO作为基质对6nt寡核苷酸测序
(1)配制5pmol/μL的6nt寡核苷酸，寡核苷酸序列为CpApCpUpApG(分子结构见图6),在-80℃冰箱保存；
(2)配制0.5mg/mL实施例1中的TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液，可在4℃冰箱保存；
(3)分别取1μL步骤1中的寡核苷酸溶液与1μL步骤2中的TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液，依次点在抛光靶板同一点样孔，室温下自然干燥。
(4)将靶板送入MALDI质谱仪，选用负离子反射模式进行数据采集。
实施例3中，图7为以TiO2/ZnAl-LDO为基质检测CpApCpUpApG寡核苷酸的MALDI质谱图。其中266.012Da对应z1 -碎片离子峰，282.166Da对应y1 -碎片离子峰，675.031Da对应x2 -碎片离子峰，917.111Da对应y3 -碎片离子峰，1055.094Da对应(a-B)4 -碎片离子峰，1205.806Da对应z4 -碎片离子峰，1364.380Da对应(a-B)5 -碎片离子峰，表1列举了测得的质谱信号峰质荷比和理论位点断裂产生的碎片信号峰的质荷比的对比，其相对差值在合理范围内，说明本方法得到的质谱信息可以与实际的寡核苷酸序列相映射，达到对寡核苷酸测序的目的。
表1
实例四：以TiO2/ZnAl-LDO作为基质在MALDI质谱中断裂寡核苷酸机理探究
利用电子顺磁共振波谱(Electron Paramagnetic Resonance,EPR)对紫外光照射下的TiO2/ZnAl-LDO溶液进行表征，其具体步骤如下：
(1)配制1mg/mL TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液；
(2)向步骤1溶液中加入少量5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)自由基捕获剂；
(3)将步骤2溶液注入毛细管中放置于电子顺磁共振波谱谐振腔内，并在紫外灯照射下进行数据采集。
实施例4中，图8为TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液分别在有无紫外光条件下的EPR谱图。由图可知，在无紫外光照射下，TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液无EPR信号相应，说明未产生任何自由基分子，而在紫外光照射下，TiO2/ZnAl-LDO甲醇溶液产生了高度为1：1：1：1：1：1的六重峰EPR信号，且AN＝15G；Aβ H＝22G，与标准图谱比对其为·CH2OH自由基，该自由基可进攻寡核苷酸磷酸骨架使其发生断裂，进而在质谱中产生碎片信号峰。因此检测的机理为在激光照射下，首先TiO2/ZnAl-LDO吸收激光能量并将电荷转移给寡核苷酸分子，同时溶剂分子如甲醇和水在TiO2/ZnAl-LDO表面发生光电化学反应产生自由基离子，当带电荷寡核苷酸分子和自由基一起被激发到尾焰中时，在离子引出之前会有一个短暂的延迟，此时自由基的反应攻击离子源中的磷酸盐骨架可能导致磷酸盐骨架的断裂。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.TiO2/ZnAl-LDO纳米材料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述寡核苷酸长度在2-30nt。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括：
1)、基质制备：
制备TiO2/ZnAl-LDO纳米材料，通过溶解基质的溶剂配制TiO2/ZnAl-LDO纳米材料溶液；
2)、样品制备：
配制待测寡核苷酸的水溶液；
3)、靶板点样：
分别取等体积的待测寡核苷酸溶液和TiO2/ZnAl-LDO纳米材料基质溶液，采用薄层法进行点样和干燥，获得点样后的靶板；
4)、点样后的靶板送入MALDI质谱仪，进行MALDI质谱分析。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中，制备TiO2/ZnAl-LDO纳米材料，具体包括：
1.1)将Zn(NO3)2·6H2O和Al(NO3)3·9H2O溶解在水中，超声使其充分溶解并记为A液；
1.2)将Na2MoO4·2H2O和NaOH溶于水中超声并作为B液；
1.3)将A液和B液分别放入两个滴漏斗中，然后将其滴入20～30℃的包含TiO2的水中，同时控制滴速，使溶液的pH为8.5～9.5，滴完后，继续在20～30℃下搅拌20～40min，并于搅拌晶化，离心，洗涤至中性，干燥，并在350～450℃马弗炉中煅烧2～4h，得到TiO2/ZnAl-LDO纳米材料。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1.3)中，60～70℃搅拌晶化10～14h。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中，所述的溶解基质的溶剂为甲醇、水或甲醇与水的混合溶剂。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中，采用薄层法进行点样和干燥，具体包括：
将TiO2/ZnAl-LDO纳米材料基质溶液滴加到金属靶片上，待风干后，再滴加待测寡核苷酸溶液，继续风干后，获得点样后的靶板。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中，所述的TiO2/ZnAl-LDO纳米材料基质溶液中TiO2/ZnAl-LDO纳米材料的浓度为0.5-10mg/mL；
所述的待测寡核苷酸溶液中寡核苷酸浓度为0.5-10nmol/μL。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤4)中，所述的MALDI质谱分析采用的离子源检测模式为负离子模式。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤4)中，所述的MALDI质谱分析采用的离子检测器检测模式为反射模式或线性模式。
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