CN113267557A - 木质素作为maldi基质在小分子物质检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了木质素作为MALDI基质在小分子物质检测中的应用，所述的小分子化合物为糖类、糖苷类、酯类、维生素类、氨基酸类、羟基酸类或者脂肪酸类小分子化合物，所述的小分子化合物的m/z<1000。木质素具有优良的光学吸收特性，且其本身在质谱中难电离，因此可以克服传统有机小分子基质在低分子量区间易产生基质背景干扰的缺点。在MALDI质谱中，基于木质素基质可实现对多种小分子化合物的快速定性分析。此外，采用内标法可实现小分子物质的精准定量。通过核磁表征和信号归属，可确定木质素中起基质作用的主要结构单元。

Description

木质素作为MALDI基质在小分子物质检测中的应用

技术领域

本发明涉及MALDI质谱的小分子分析领域，具体涉及木质素作为MALDI基质在小分子物质检测中的应用。

背景技术

基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)和电喷雾电离(Electrospray ionization,ESI)是20世纪八十年代发明的软电离质谱技术，软电离质谱技术的发明和应用将质谱分析对象从易挥发、热稳定性好的小分子化合物拓展至难挥发、热稳定性差的极性大分子，从而使质谱学发展进入了生物质谱阶段。1988年，Tanaka(田中耕一)用甘油和钴粉末的混合物做MALDI基质首次检测到分子量超过3.4kDa的完整蛋白质信号，并因此获得了2002年诺贝尔化学奖。

MALDI-TOF-MS仪器主要由两部分组成，基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI检测原理有多种假说，但公认的一种机制是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收、传递能量给待测分子，在气相中激发态的基质分子与分析物之间发生质子转移从而使分析物离子化的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，所测定的离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比。MALDI源中产生的通常是准分子离子，这是MALDI相较于ESI的最大特点之一。

基质的选择是MALDI电离技术的关键影响因素。目前常用的有机小分子基质包括α-氰基-4-羟基-肉桂酸(CHCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)、3-羟基-2-吡啶苯甲酸(HPA)、蒽三酚(DIT)、3-氨基喹啉(3AQ)等。但以上传统有机小分子基质辅助电离过程在低分子量区间易产生大量碎片信息(m/z<1000)，严重干扰小分子物质的分析，在很大程度上限制了MAIDL在小分子化合物检测方面的应用。然而，小分子物质种类繁多，且许多与人体新陈代谢、疾病早期检测、食品药品安全或环境污染等的问题息息相关。此外，MALDI成像技术的顺利开展也是以高性能小分子基质为前提。因此，开发新型适用于小分子化合物分析的MAIDI基质具有重要意义。

近年来，国内外学者针对小分子化合物的MALDI-MS检测难题，设计尝试了多种不同类型的基质，包括小分子新型有机基质、无机纳米材料、有机无机杂合材料、反应型基质、大分子型基质等。但纳米材料的合成和修饰繁琐；反应型基质通常针对具有某一类特定的官能团分子，局限性较强；人工合成的大分子型基质分离纯化较难、成本高，难以实现商业化。由此可知，开发性质稳定、来源广泛、成本低廉、操作简单的适用于小分子化合物检测的基质具有重要的科学和实用价值。

发明内容

本发明提供了木质素作为MALDI基质在小分子物质检测中的应用。木质素具有优良的光学吸收特性，且其本身在质谱中难电离，因此可以克服传统有机小分子基质在低分子量区间易产生基质背景干扰的缺点。在MALDI质谱中，基于木质素基质可实现对多种小分子化合物的快速定性分析。此外，采用内标法可实现小分子物质的精准定量。通过核磁表征和信号归属，可确定木质素中起基质作用的主要结构单元。

本发明所述的木质素为脱碱木质素。

所述的基质辅助激光解吸电离质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

所述的小分子化合物为糖类、糖苷类、酯类、维生素类、氨基酸类、羟基酸类或者脂肪酸类小分子化合物，所述的小分子化合物的m/z<1000。、

所述的糖类为L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖或者麦芽六糖；

所述的糖苷类为尿苷、β-胸苷、2'-脱氧腺苷、2-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞嘧啶核苷或者杨梅苷；

所述的酯类为甘油三乙酸酯、甘油三丁酸酯、甘油单硬脂酸酯、丙二酸二乙酯和亚磷酸二辛酯；维生素类为胆固醇、维生素E或者维生素B2；

所述的氨基酸类为L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸或者L-缬氨酸；

所述的羟基酸类为乙酰水杨酸、D-苯乳酸、苹果酸或者柠檬酸；

所述的脂肪酸类为亚油酸、软脂酸或者硬脂酸。

所述的基质辅助激光解吸电离质谱的待测样品为小分子化合物溶液、植物提取物、动物血清和尿液样品。

所述的小分子检测为小分子的定性定量检测，所述的应用具体包括如下步骤：

1、基质制备

配制木质素甲醇溶液或水溶液；配制DHB或CHCA的甲醇溶液。

2、样品制备

配制待测小分子的水溶液或氯化钠水溶液或乙醇溶液；制备添加内标的标准样品或真实样品小分子溶液。

3、靶板点样

分别取等体积的待测小分子溶液和木质素基质溶液，采用薄层法或干滴法进行点样和干燥，获得点样后的靶板。

4、点样后的靶板送入MALDI质谱仪，进行MALDI质谱分析。

步骤1中，所述的溶解基质的甲醇为分析纯或色谱级溶剂；

所述的配制待测还原糖的水溶液的溶剂是超纯水或双蒸水；

所述的木质素溶液浓度为5～30mg/mL。

步骤2中，所述的待测小分子溶液浓度为0.01～10mg/mL。

所述的内标小分子为L-阿拉伯糖、L-丙氨酸、苹果酸、软脂酸、甘油三乙酸酯和槲皮苷，浓度为0.01～0.2mg/mL。

步骤3中，所述的待测小分子溶液的点样体积为0.5～2.0μL。

所述的木质素基质溶液的点样体积为0.5～2.0μL。

所述的薄层法为先点基质溶液，室温干燥，然后在此基础上点样品溶液，再次室温干燥。

所述的干滴法为依次点基质和样品溶液于同一个靶板点样孔，吸打混匀，室温干燥。

步骤4中，所述的MALDI质谱分析采用的检测模式为反射模式下的正离子模式或负离子模式。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、木质素来源广泛，性质稳定，成本低廉。

2、木质素具有芳香骨架结构，光学吸收特性优良，且在MALDI质谱中自身的电离化效率差，因此克服了传统有机小分子基质在低分子量区间易产生基质背景干扰的缺点。

3、木质素基质适用于多种类型小分子的快速检测，且可实现正负双离子模式检测。

4、木质素可用于小分子物质的准确定量分析(R²>0.99)。

附图说明

图1为木质素与传统有机基质检测小分子化合物的性能比较；图1A是基质本身的信号；图1B是不同基质检测葡萄糖的质谱图；

图2为脱碱木质素基质检测小分子化合物的条件系统优化；图2A是点样方法和溶剂的优化；图2B是木质素浓度的优化；

图3为脱碱木质素定性检测糖类、糖苷类、酯类、维生素类、氨基酸类、羟基酸类和脂肪酸类小分子化合物的质谱图；图3A-3G为正离子反射模式；图3H-3J为负离子反射模式；

图4为脱碱木质素定量检测小分子的线性范围考察；图4A-4F分别是葡萄糖、缬氨酸、柠檬酸、硬脂酸、三丁酸甘油酯和杨梅苷的定量线性曲线；

图5为脱碱木质素定量检测植物提取物中杨梅苷含量的准确性；

图6为木质素基质的表征；图6A是紫外吸收光谱图；图6B和6C是HSQC NMR谱；

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但本发明并不限于下述实施例。

下述实施例中所用的样品、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的具体型号为UlrafleXtreme^TM MALDI-TOF/TOF MS(Bruker Daltonic,Germany)，激光器采用355nm波长的Nd:YAG激光器。糖类、糖苷类、酯类和维生素类在正离子模式检测；氨基酸类、羟基酸类和脂肪酸类在正离子或负离子模式检测。正离子反射模式参数：加速电压，24.98kV；延迟引出电压，22.28kV；延迟引出时间，130ns，反射器电压1，26.48kV；反射器电压2，13.51kV；透镜电压，8.55kV；频率，1000Hz。负离子反射模式参数：加速电压，20.00kV；延迟引出电压，17.75kV；延迟引出时间，100ns，反射器电压1，20.99kV；反射器电压2，10.71kV；透镜电压，8.52kV；频率，2000Hz。所用靶板为384抛光板(MTP 384polished steel)，质谱数据分析采用Bruker Flexanalysis 3.4软件。

下面简写词或外文术语的使用贯穿本发明：

DHB 2,5-二羟基苯甲酸；

CHCA α-氰基-4-羟基肉桂酸；

ESI电喷雾质谱；

min 分钟；

μL 微升；

NMR 核磁共振；

MeOH 甲醇；

EtOH 乙醇；

ddH₂O 去离子水

V 伏特；

rt 室温；

S/N 信噪比；

MW 分子量

m/z 质荷比

HPLC 高效液相色谱

WM 乌梅

TZM 特早梅

RSAHB 软丝安海变

实施例1：木质素与传统有机基质检测小分子化合物的性能比较

(1)称取一定量的葡萄糖，配制成1mg/mL水溶液母液，并根据情况进行稀释；

(2)称取一定量的DHB和CHCA，配制成0.10mol/L的甲醇溶液；称取一定量的脱碱木质素和碱性木质素，配制成30mg/mL的水溶液母液，并根据情况进行稀释；

(3)分别取1μL步骤1中的葡萄糖糖液与1μL步骤2中的15mg/mL脱碱木质素水溶液，依次点在靶板同一点样孔。使用移液枪直接在MALDI靶板重复吸打，进行混匀，室温条件下自然干燥；

(4)作为对照，分别取1μL步骤1中的葡萄糖糖液与1μL步骤2中的0.1mol/L DHB甲醇溶液，0.1mol/L CHCA甲醇溶液和15mg/mL碱性木质素水溶液，依次进行步骤3中的点样和干燥；

(5)靶板送入MALDI质谱仪，选用正离子反射模式进行数据采集。

实施例1中，图1为木质素与传统有机基质检测小分子化合物的性能比较图。与传统有机基质DHB，CHCA和碱性木质素相比，脱碱木质素在小分子范围的基质背景干扰小(图1A)。以葡萄糖为待分析物，采用以上四种基质进行检测，脱碱木质素具有明显更高的信噪比(图1B)，表明其作为小分子基质潜在的特性。

实施例2：脱碱木质素作为基质检测小分子化合物的条件优化

(1)配制实施例1中30mg/mL的脱碱木质素甲醇溶液和水溶液的母液，并进行稀释得5mg/mL，10mg/mL，15mg/mL，20mg/mL和25mg/mL的脱碱木质素溶液；

(2)薄层法为先点基质溶液，室温干燥，然后在此基础上点样品溶液，再次室温干燥。

(3)干滴法为依次点基质和样品溶液于同一个靶板点样孔，吸打混匀，室温干燥。

(4)靶板送入MALDI质谱仪，选用正离子反射模式进行数据采集。

实施例2中，图2为木质素基质检测小分子化合物的条件系统优化。以葡萄糖为待分析物，图2A中对溶剂类型和点样方式进行了考察，发现ddH₂O作为溶剂信噪比高于以甲醇为溶剂的信噪比；薄层法点样信噪比高于干滴法点样。以ddH₂O为溶剂，采用薄层法进行点样，图2B中对于脱碱木质素的浓度进行了考察，信噪比呈现先上升后下降的趋势，15mg/mL脱碱木质素水溶液的检测效果最佳。

实施例3：脱碱木质素定性检测小分子化合物

(1)以ddH₂O为溶剂，分别配制1mg/mL的阿拉伯糖，缬氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，精氨酸，苹果酸，柠檬酸，苯乳酸，乙酰水杨酸，尿苷，2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷，脱氧胞嘧啶和β-胸苷水溶液；以ddH₂O为溶剂，分别配制4mM的麦芽糖，麦芽三糖和麦芽六糖水溶液；以5mg/mL氯化钠水溶液为溶剂，配制1mg/mL的维生素B2；以乙醇为溶剂，配制1mg/mL的软脂酸，硬脂酸，亚油酸，丙二酸二乙酯，维生素E，甘油三乙酸酯，磷酸二辛酯，三丁酸甘油酯，硬脂酸甘油酯和胆固醇乙醇溶液；

(2)配制实施例2中15mg/mL的脱碱木质素水溶液；

(3)采用实施例2中的薄层法进行点样和干燥；

(4)靶板送入MALDI质谱仪，选用正离子反射模式或负离子反射模式进行数据采集。

实施例3中，图3为脱碱木质素定性检测小分子化合物的质谱图。对于前四种中性小分子进行了正离子模式检测(图3A至3D)。这些化合物的特征峰主要归属于钠离子加合物[M+Na]⁺。以麦芽三糖(MW＝504.438)为例，光谱中的分子离子峰(图3A)可归属于m/z527.158的碱金属离子加合物[M+Na]⁺。在图3B中，也有一些其他类型的离子加合物如[M+2Na-H]⁺的归属。特别地，2'-脱氧鸟苷和脱氧胞嘧啶容易形成糖苷键的碎裂，随着激光能量的增加，观察到完全脱糖基化的产物。对于后三种酸性小分子，采用双离子模式检测。在正模式下，与中性化合物的结果不同，离子加合物[M+2Na-H]⁺占很大比例(图3E-3G)，但也有其他离子加合物生成，谱图较复杂。当以负离子模式检测这些化合物时(图3H-3J)，获得单一的去质子离子[M-H]^-峰。

实施例4：脱碱木质素定量检测小分子的线性范围考察

(1)配制实施例3的1mg/mL的葡萄糖水溶液，5mg/mL的缬氨酸和柠檬酸水溶液，1mg/mL的硬脂酸和三丁酸甘油酯乙醇溶液，并分别进行梯度稀释；配制1mg/mL的杨梅苷甲醇溶液并进行梯度稀释；

(2)分别选取阿拉伯糖，丙氨酸，苹果酸，软脂酸，甘油三乙酸酯和槲皮苷作为葡萄糖，缬氨酸，柠檬酸，硬脂酸，三丁酸甘油酯和杨梅苷的内标化合物进行标准添加，制备系列溶液；

(3)采用实施例2中的薄层法进行点样和干燥；

(4)靶板送入MALDI质谱仪，选用正离子反射模式或负离子反射模式进行数据采集。

实施例4中，图4为脱碱木质素定量检测小分子的线性范围考察。选取葡萄糖，缬氨酸，柠檬酸，硬脂酸，三丁酸甘油酯和杨梅苷6种典型具有代表性的化合物作为定量参照物进行线性范围考察。以待分析物浓度为横坐标，分析物相对于内标化合物的信号强度为纵坐标进行线性拟合。分析物的信号强度通过计算正离子模式下所有类型离子加合物的峰值强度之和。6种化合物的线性相关系数均大于0.99，表明脱碱木质素用于小分子化合物定量的可行性。

实施例5：脱碱木质素基质定量检测植物提取物中杨梅苷

(1)以三个品种的杨梅叶片和茎为试材，各称取鲜样粉末0.15g于2mL离心管中，加入1mL甲醇，涡旋充分混匀，超声提取(超声频率为60kHz，功率为30W)30min后，提取液12000rpm室温离心10min，取上清。沉淀按照上述步骤再提取两次，合并上清液；

(2)在步骤1的提取液中标准添加内标化合物槲皮苷，用于后续定量；

(3)采用实施例2中的薄层法进行点样和干燥；

(4)靶板送入MALDI质谱仪，选用正离子反射模式或负离子反射模式进行数据采集。

(5)HPLC检测体系如下：流速1mL/min，进样量为10μL，检测波长为350nm。流动相溶液是含0.1％甲酸的水(A)和乙腈：0.1％甲酸水溶液(1：1，v/v)(B)，按以下程序梯度洗脱：0-40min，10-38％B；40-60min，38-48％B；60-70min，48-100％B；70-75min，100-10％B；75-80min，10％B。

实施例5中，图5为脱碱木质素基质定量检测植物提取物中杨梅苷的准确性考察。以‘乌梅’、‘特早梅’和‘软丝安海变’的叶片和茎为植物材料，分别提取4个生物学重复。对24份提取液中杨梅苷含量分别进行HPLC和MALDI定量分析，结果如表1所示。对两组含量进行相关性分析，相关系数为0.999，表明以脱碱木质素为基质对实际样品中小分子定量的准确性。

表1 MALDI和HPLC对杨梅苷的定量结果

实施例6：木质素基质的表征和机理探究

(1)对脱碱木质素进行紫外光谱吸收和HSQC NMR分析，碱性木质素为对照

实施例6中，图6为脱碱木质素作为小分子化合物基质的机理探究。与对照相比，脱碱木质素在靠近355nm附近具有更强的吸收能力。对HSQC谱的信号进行归属，脱碱木质素主要在芳香区有更强的信号峰，可归属为G，G'和pCA。紫外吸收光学特性表明脱碱木质素具有潜在的激光能力吸收和传递特性，而G，G'和pCA的芳香共轭结构进一步细化了脱碱木质素起基质作用的结构单元。木质素本身为大分子化合物，在质谱中电离化效率差，因此在很大程度上避免了小分子范围基质背景峰的干扰。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.木质素作为基质辅助激光解吸电离质谱在小分子物质检测中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的木质素为脱碱木质素。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基质辅助激光解吸电离质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的小分子化合物为糖类、糖苷类、酯类、维生素类、氨基酸类、羟基酸类或者脂肪酸类小分子化合物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的糖类为L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖或者麦芽六糖；

所述的糖苷类为尿苷、β-胸苷、2'-脱氧腺苷、2-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞嘧啶核苷或者杨梅苷；

所述的酯类为甘油三乙酸酯、甘油三丁酸酯、甘油单硬脂酸酯、丙二酸二乙酯和亚磷酸二辛酯；维生素类为胆固醇、维生素E或者维生素B2；

所述的氨基酸类为L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸或者L-缬氨酸；

所述的羟基酸类为乙酰水杨酸、D-苯乳酸、苹果酸或者柠檬酸；

所述的脂肪酸类为亚油酸、软脂酸或者硬脂酸。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述的基质辅助激光解吸电离质谱的待测样品为小分子化合物溶液、植物提取物。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的小分子检测为小分子的定性定量检测，所述的应用具体包括如下步骤：

(1)基质制备：

配制木质素甲醇溶液或水溶液；

(2)样品制备：

配制待测小分子的水溶液或氯化钠水溶液或乙醇溶液；制备添加内标的标准样品或真实样品小分子溶液；

(3)靶板点样：

分别取等体积的待测小分子溶液和木质素基质溶液，采用薄层法或干滴法进行点样和干燥，获得点样后的靶板；

(4)点样后的靶板送入MALDI质谱仪，进行MALDI质谱分析。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的木质素溶液的浓度为5～30mg/mL。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的待测小分子的浓度为0.01～10mg/mL；

步骤(2)中，所述的内标的真实样品小分子为L-阿拉伯糖、L-丙氨酸、苹果酸、软脂酸、甘油三乙酸酯和槲皮苷，浓度为0.01～0.2mg/mL。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述的薄层法为：先点基质溶液，干燥，然后在此基础上点样品溶液，干燥；

步骤(3)中，所述的干滴法为依次点基质和样品溶液于同一个靶板点样孔，吸打混匀，干燥；

步骤(4)中，所述的MALDI质谱分析采用的检测模式为反射模式下的正离子模式或负离子模式。

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