CN110108780B - 3-肼基苯甲酸衍生化葡聚糖在maldi-tof-ms质量校准中的应用 - Google Patents
3-肼基苯甲酸衍生化葡聚糖在maldi-tof-ms质量校准中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于质谱检测领域，具体公开了一种反应型基质3‑肼基苯甲酸衍生化葡聚糖在MALDI质谱质量校准中的应用。3‑肼基苯甲酸与还原糖末端的半缩醛发生成腙反应，该反应衍生化效率高，且利用靶板在线衍生，操作简便。利用该衍生策略，在正负离子模式下均可检测到衍生化产物。且3‑肼基苯甲酸中所带羧酸根显著提高了还原糖在负离子模式下的离子化效率。本发明用3‑肼基苯甲酸衍生化的葡聚糖作为MALDI质谱的质量校准物，相邻信号峰之间质量相差162Da，对应一个葡萄糖残基，实现了同时在正负离子模式下的精确校准。
Description
技术领域
本发明涉及质谱检测技术领域，具体涉及3-肼基苯甲酸(3-HBA)作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)质量校准中的应用。
背景技术
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)被广泛应用于大分子的质量测定，如蛋白质、多糖及聚合物等。精确的质荷比校准是质谱进行物质分析的首要前提，因此选择合适的质量校准物至关重要。
作为质量校准物的化合物应具备：(1)精确的谱图特征，准确的分子量；(2)校准范围内谱峰丰富且相邻质谱峰差值合适；(3)容易制备，价格便宜；(4)易于储存，保质期长；(5)纯度高等特点。目前常用于校准物的物质有蛋白质、多肽混合物等，但该类校准物分离纯化成本高，对环境敏感，保存条件有较高的要求；金属簇合物，如[CsnIn-1]+和[Csn-1In]-簇合物可用于MALDI-MS正负离子模式校准，但使用该类校准物时，随着分子量增加，峰强度明显减弱；聚合物，如聚乙二醇、聚乙烯乙二醇等，T.Gruending等用聚丙胺酸校准MALDI质谱质量数，可在m/z 1000～3500范围内进行校准，但正负离子的校准需分别用到DHB和CHCA作为基质，操作较繁琐。基于此，设计和开发新型MALDI质谱校准物具有重要的意义。
发明内容
本发明提供3-肼基苯甲酸(3-HBA)作为反应型基质，Dextran 2000(D2000)为还原性葡聚糖，通过成腙反应衍生化该聚合物。该反应衍生化效率高，在正负离子模式下均能得到很强的衍生化产物信号，可用于MALDI-TOF MS的质量校准。同时，对成腙产物进行二级碎裂，可得到丰富的碎片信息，进而用于二级质量的精确校准。有机酸基质DHB和3-HBA混合使用，可显著提高糖类化合物的衍生化效率和检测灵敏度。其中，DHB为催化型基质，而3-HBA为反应型基质，DHB和3-HBA均为碳水化合物的优良基质，因此，过量的衍生化试剂不需要分离，简化了操作步骤。本发明所述的3-HBA结构式如式(1)所示：
3-肼基苯甲酸(3-HBA)作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)质量校准中的应用
本发明的3-HBA作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS质量校准中的应用，具体步骤如下：
(1)试剂配制
配制DHB(2,5-二羟基苯甲酸)甲醇溶液，将3-HBA(3-肼基苯甲酸)溶于甲醇和二甲亚砜的混合溶剂中得到3-HBA溶液，然后将DHB甲醇溶液和3-HBA溶液混合得到DHB/3-HBA混合基质溶液，将葡聚糖(D2000)溶于水中得到葡聚糖水溶液；
(2)点样
分别取等体积的葡聚糖水溶液和DHB/3-HBA混合基质溶液，依次点在MALDI-TOF-MS仪器的靶板的同一点上，在靶板上直接进行吸打混匀，得到点样后的靶板；
(3)靶板衍生化反应
点样后的靶板在60～70℃下反应20～40min，样品点完全干燥，得到含质量校准物的靶板；
(4)质谱校准
将含质量校准物的靶板送入MALDI-TOF-MS质谱仪，分别在正负离子模式采集数据并进行质量校正，仪器校准后所得校正参数将自动用于校准实际样品的质谱检测结果。
步骤(1)中，用于溶解基质DHB(2,5-二羟基苯甲酸)的甲醇为分析纯或色谱级溶剂；
甲醇和二甲亚砜的混合溶剂中甲醇与二甲亚砜的体积比为7.5～9.5:1，进一步优选为9:1，在使用时采用体积比为9:1的甲醇/二甲亚砜混合溶剂体系，将3-HBA(3-肼基苯甲酸)现配现用，3-HBA溶液为3-HBA的饱和溶液；
所述的DHB甲醇溶液和3-HBA溶液的体积比为1:0.5～1.5，进一步优选为1:1。
所述的DHB/3-HBA混合基质溶液中DHB的浓度为0.3～0.5mol/L，进一步优选为0.4mol/L；
用于溶解葡聚糖的水是超纯水或双蒸水；
所述的葡聚糖为麦芽糊精2000，Dextran 2000(D2000)为还原性葡聚糖，所述的葡聚糖水溶液中葡聚糖的浓度为0.03～0.07mg/mL，进一步优选为0.05mg/mL；
步骤(2)中，所述的葡聚糖水溶液的点样体积为0.5～1.0μL；
所述的DHB/3-HBA混合基质溶液的点样体积为0.5～1.0μL；
在靶板上直接进行吸打混匀使用移液枪直接在靶板进行重复吸打10～20次；
步骤(3)中，点样后的靶板在65℃下反应30min。
步骤(4)中，MALDI-TOF-MS质谱仪采用的检测方式为正离子或负离子模式下的反射模式；
另一方面，本发明还提供了利用衍生化的D2000进行仪器校准后，对实际样品进行测定和分析的方法。
本发明中所述的“MALDI质谱”是指基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，简称为MALDI质谱。MALDI的工作原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给样品分子而使其电离的过程。它是一种软电离技术，适用于生物大分子的测定。
本发明中所述的“反应型基质”是指作为常规基质辅助还原糖电离的同时，可与其还原端半缩醛发生快速反应，共价结合离子化标签，提高电离化效率。
本发明中所述的“酸性糖”是指带有羧基(-COOH)酸性取代基的还原糖，如含有唾液酸的糖分子。
本发明中所述的“中性糖”是指不含有酸性取代基的还原糖分子。
本发明中所述的衍生化效率＝衍生化产物峰强度/(衍生化产物峰强度+未衍生的峰强度)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)3-HBA结构中带有活性基团肼基，与多糖发生成腙反应，该反应在弱酸条件下进行，衍生化效率高。反应型基质3-HBA除了作为衍生化试剂外，还可以作为基质辅助样品离子化，因此反应过量的衍生化试剂不需要分离；
(2)3-HBA与DHB形成组合型基质，共同作用提高样品离子化效率。DHB为有机酸基质，可显著催化成腙反应的进行。本发明提供的靶板衍生化方法，操作简便，大大提高了效率；
(3)3-HBA结构中带有羧基，容易失去质子在负离子模式下出峰，通过本发明提供的方法能够显著提高中性糖及酸性糖在负离子模式下的检测灵敏度，克服了多糖在负离子模式检测灵敏度低等问题；
(4)本发明中，正负离子模式下均能检测到很强的衍生化产物峰，实现了正负离子模式下同时对MALDI-TOF MS的精确质量校准，且在二级质谱中能得到质量数差值同样为162 Da的特征性碎片峰，因而还可以进行二级质谱校准。通过选用不同聚合度的葡聚糖可实现不同质荷比范围内的精确校准；
(5)本发明中所用的样品制备简单，来源广泛，成本低廉，易于储存。校准方法操作简单，选用葡聚糖作为校准物质量分布均匀，准确度高。
附图说明
图1为本发明3-HBA衍生化还原糖的原理示意图；
图2为不同反应条件下麦芽六糖(G6)的衍生化效率；图2a不同反应时间；图2b不同反应温度；图2c溶剂中不同乙酸含量；图2d不同DHB浓度；
图3为负离子模式下不同浓度D2000的MALDI质谱图；图3a D2000浓度为0.05mg/mL；图3b D2000浓度为0.5mg/mL；图3c D2000浓度为5mg/mL；
图4为标准条件下衍生化D2000的MALDI质谱图；图4a正负离子模式下的一级质谱图；图4b负离子模式下母离子为m/z2257.89的二级质谱图；
图5为质量校准后，标准品G7(a)、NA2(b)、NA2F(c)及A1(d)的MALDI质谱图；
图6为质量校准后，对大肠癌患者血清中中性糖检测的MALDI质谱图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但本发明并不限于下述实施例。
下述实施例中所用的样品、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的具体型号为UlrafleXtremeTM MALDI-TOF/TOF MS(Bruker Daltonic,Germany)，激光器采用355nm波长的Nd:YAG激光器。正离子反射模式参数：加速电压，25.00kV；延迟引出电压，22.30kV；延迟引出时间，130ns；反射器电压1，26.50kV；反射器电压2，13.50kV；透镜电压，7.50kV；频率，1000 Hz。负离子反射模式参数：加速电压，20.00kV；延迟引出电压，17.75kV；延迟引出时间，100ns；反射器电压1，21.10kV；反射器电压2，10.70kV；透镜电压，8.50kV；频率，2000Hz。所用靶板为384抛光板(MTP 384 polished steel)，质谱数据分析采用BrukerFlexanalysis 3.4软件。
下面简写词或外文术语的使用贯穿本发明：
3-HBA 3-肼基苯甲酸；
DHB 2,5-二羟基苯甲酸；
CHCA α-氰基-4-羟基肉桂酸；
D2000 麦芽糊精2000；
MALDI 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；
min 分钟；
μL 微升；
G6 麦芽六糖；
G7 麦芽七糖；
V 伏特；
DMSO 二甲基亚砜；
PNGase F 肽N-糖苷酶F；
MeOH 甲醇；
℃ 摄氏度；
v 体积；
Da 道尔顿；
实施例1：基于3-HBA反应型基质的还原糖靶板衍生化条件优化。
配制20pmol/μL的麦芽六糖(G6)为模型化合物，对反应的温度、时间、乙酸比例和DHB浓度比例进行考察，具体步骤如下：
(1)温度条件优化：用体积比为9:1的MeOH:DMSO混合溶剂配制3-HBA饱和溶液，并加入体积比为10％的乙酸作为催化剂。取1μLG6和1μL基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀。分别在30℃、45℃、65℃和85℃反应30min后进行检测，以峰强度计算衍生化效率。如图2a所示，衍生化效率随温度升高而提高；
(2)反应时间优化：在65℃、10％乙酸条件下，取1μLG6和1μL基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀。分别反应15min、30min、45min、60min和75min后进行检测，以峰强度计算衍生化效率。如图2b所示，衍生化效率随反应时间增加而提高；
(3)乙酸比例优化：配制步骤1中的3-HBA饱和溶液，并分别在100μL饱和溶液中加入体积分数为1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％和50％的乙酸，得到不同乙酸比例的3-HBA基质溶液。取1μLG6和1μL基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀。在65℃下反应30min后检测，以峰强度计算衍生化效率。如图2c所示，乙酸最佳加入体积比例为10％；
(4)DHB浓度比例优化：配制步骤1中的3-HBA饱和溶液和浓度分别为0.1M、0.2M、0.25M、0.3M、0.4M和0.5M的DHB甲醇溶液。取不同浓度的DHB与饱和3-HBA溶液1:1混合，得到不同DHB/3-HBA混合基质溶液。取1μLG6和1μL基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀。65℃反应30min，与溶剂中添加体积分数为10％的乙酸作为催化剂相比，使用DHB/3-HBA混合基质时共结晶更均匀，且衍生化效率均达到90％以上。表明DHB作为糖类物质基质的同时可高效催化成腙反应的进行，如图2d；
实施例1表明，通过优化还原糖靶板衍生化条件，可使衍生化效率达到90％以上。综合考虑基质浓度、反应时间和反应温度等因素，后续实验选用0.4M DHB与饱和3-HBA结合的组合型基质，反应条件为65℃下进行30min。
实施例2：D2000浓度的优化。
分别配制浓度为0.05mg/mL、0.5mg/mL和5mg/mL的D2000水溶液，采用0.4M DHB与饱和3-HBA结合的组合型基质。取1μL D2000溶液和1μLDHB/3-HBA混合基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀，65℃反应30min。如图3所示，当D2000浓度为0.05mg/mL时，衍生化效果最好，质量分布范围广。
实施例3：3-HBA衍生化D2000用于MALDI-TOFMS校准
(1)配制如实施例2的DHB/3-HBA混合基质溶液和0.05mg/mL D2000水溶液，取1μLD2000溶液和1μLDHB/3-HBA混合基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀，65℃反应30min。将靶板放入质谱仪，分别在正负离子模式下采集一级质谱图并对质谱仪进行校准。图4a为D2000正负离子模式下的MALDI质谱图，信号峰呈正态分布，质量分布均匀，准确度高。相邻信号峰之间质荷比相差m/z162，正好对应一个葡萄糖残基，一级质谱校准数据列于表1。
表1：3-HBA衍生化D2000的一级校准数据
(2)分别取步骤1中1μL D2000溶液和1μLDHB/3-HBA混合基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀，65℃反应30min。二级质谱校准方法为，在负离子模式选择母离子m/z2257.89进行二级质谱测定，图4b所示为其相应的二级质谱图。通过碎片归属发现，3-HBA衍生化后的多糖二级碎裂方式仅为2,4A，单一的碎裂方式有利于二级质量数的校准。相邻信号峰之间质荷比相差为m/z162，表明相邻碎片离子之间相差一个葡萄糖残基。由于所有碎片都有精确的质量数，因此，本发明的方法也可用于MALDI-TOF MS二级质谱校准，二级质谱校准数据列于表2。
表2：3-HBA衍生化D2000的负离子模式二级校准数据
| Species | m/zA-type[M-H]<sup>-</sup>(Theoretical) |
| <sup>2,4</sup>A<sub>4</sub> | 545.1712 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>5</sub> | 707.2240 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>6</sub> | 869.2769 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>7</sub> | 1031.3297 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>8</sub> | 1193.3825 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>9</sub> | 1355.4353 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>10</sub> | 1517.4882 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>11</sub> | 1679.5410 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>12</sub> | 1841.5938 |
| <sup>2,4</sup>A<sub>13</sub> | 2003.6466 |
实施例4：标准样品G7、NA2、NA2F、A1的质谱检测
(1)分别配制20pmol/L的麦芽七糖(G7)水溶液，1pmol/L的NA2水溶液，1pmol/L的NA2F水溶液和10pmol/L的A1水溶液；
(2)分别取1μL样品糖溶液和1μL基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀，65℃反应30min。经过实施例3中质谱校准后对标准品进行检测。
图5所示为负离子模式下4种标准样品经衍生化的质谱图，谱图清晰，没有干扰峰，分辨率高，质量数准确。表明3-HBA衍生化后的D2000可用于MALDI质谱的精确校准。且3-HBA作为反应型基质，中性糖和酸性糖均可在负离子模式下进行检测。
实施例5：血清糖蛋白酶解后的还原N-糖的质谱检测
本发明采用PNGase F酶法制备N-还原糖，步骤如下：
(1)酶解。10μL血清中加入1μL 10X糖蛋白变性缓冲液，100℃加热10min使蛋白变性，后冷却至室温。加入2μL 10X GlycoBuffer 2反应缓冲液，2μL 10％NP-40,4μL ddH2O,1μL PNGase F，混匀，37℃孵育24h进行酶解。
(2)纯化。将酶解得到的样品离心，依次用C18固相萃取小柱和石墨化碳固相萃取小柱对解离的还原性N-糖进行纯化。C18固相萃取小柱用于除去杂质肽、蛋白和其他污染物，纯化过程如下：4mL甲醇用于活化柱子，4mL超纯水用于平衡柱子。吸取上清液加入小柱内，分3次用超纯水洗脱柱子，每次1mL，收集洗脱液。然后，采用石墨化碳固相萃取小柱对盐和小分子极性化合物进行除杂，具体过程如下：依次用3mL乙腈和1mL50％的乙腈水溶液对小柱进行活化，用3mL超纯水进行小柱的平衡。将C18纯化过程收集的糖液上样，5mL超纯水洗脱除杂。用2mL40％的乙腈水溶液洗脱中性糖，收集洗脱糖液，室温真空离心去除溶剂，复溶于50μL超纯水中，可在-20℃冰箱保存；
(3)分别取1μL步骤2中的样品糖溶液和1μL实施例3中的DHB/3-HBA混合基质溶液依次点在靶板同一点样孔，并进行混匀，65℃反应30min。经过实施例3中质谱校准后对实际样品进行检测。
图6为质量校准后，对大肠癌患者血清中中性糖检测的MALDI质谱图。图6a中数字1～13为反应产物相应的[M+Na]+峰，菱形黑块标记为相应的[M+K]+峰，图6b中数字1～13所示为反应产物相应的[M-H]-峰，具体结构信息列于表3。正离子模式下检测出11种还原N-糖，负离子模式下检测出13种还原N-糖。经过质量校准后，所测得的样品分子量准确，便于各糖链分子的结构确证和归属。
表3：大肠癌患者血清中还原性N-糖的分子量信息和可能的结构
Claims (10)
1.3-肼基苯甲酸作为反应型基质衍生化葡聚糖在MALDI-TOF-MS质量校准中的应用，所述的葡聚糖为还原性葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的3-肼基苯甲酸如式(1)所示：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：
(1)试剂配制
DHB为2,5-二羟基苯甲酸，配制DHB甲醇溶液，3-HBA为3-肼基苯甲酸，将3-HBA溶于甲醇和二甲亚砜的混合溶剂中得到3-HBA溶液，然后将DHB甲醇溶液和3-HBA溶液混合得到DHB/3-HBA混合基质溶液，将葡聚糖溶于水中得到葡聚糖水溶液；
(2)点样
分别取等体积的葡聚糖水溶液和DHB/3-HBA混合基质溶液，依次点在MALDI-TOF-MS仪器的靶板的同一点样孔上，在靶板上直接进行吸打混匀，得到点样后的靶板；
(3)靶板衍生化反应
点样后的靶板在60～70℃下反应20～40min，样品点完全干燥，得到含质量校准物的靶板；
(4)质谱校准
将含质量校准物的靶板送入MALDI-TOF-MS质谱仪，分别在正负离子模式采集数据并进行质量校正，仪器校准后所得校正参数将自动用于校准实际样品的质谱检测结果。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的甲醇和二甲亚砜的混合溶剂中甲醇与二甲亚砜的体积比为7.5～9.5:1。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的DHB甲醇溶液和3-HBA溶液的体积比为1:0.5～1.5。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的DHB/3-HBA混合基质溶液中DHB的浓度为0.3～0.5mol/L。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的葡聚糖为还原性葡聚糖，所述的葡聚糖水溶液中葡聚糖的浓度为0.03～0.07mg/mL。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的葡聚糖水溶液的点样体积为0.5～1.0μL；
所述的DHB/3-HBA混合基质溶液的点样体积为0.5～1.0μL。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，在靶板上直接进行吸打混匀使用移液枪直接在靶板进行重复吸打10～20次。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，点样后的靶板在65℃下反应30min。
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