CN107271593A - 还原性糖链的靶板衍生化和maldi‑tof‑ms分析方法 - Google Patents

还原性糖链的靶板衍生化和maldi‑tof‑ms分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于糖生物技术领域，具体涉及一种还原性糖链的靶板衍生化方法，其包括以下步骤：分别配制还原性糖链溶液、吉拉德试剂T溶液和基质DHB的溶液，分别取基质DHB的溶液、还原性糖链溶液、吉拉德试剂T溶液，依次点在MALDI‑TOF‑MS仪器靶板的同一点上；点样后的靶板在室温下放置，直至样品点完全干燥。本发明还提供了对衍生化后的样品进行MALDI‑TOF‑MS分析的方法。本发明的还原性糖链的靶板衍生化及MALDI‑TOF‑MS分析方法，衍生化效率高，且可以有效防止酸性糖链降解，对中性糖链和酸性糖链均可以在正离子模式下进行检测，不需要切换，通用性强，更加简捷、高效。

Description

还原性糖链的靶板衍生化和MALDI-TOF-MS分析方法
技术领域
本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及一种还原性糖链的靶板衍生化和MALDI-TOF-MS分析方法。
背景技术
糖类物质作为构建生命体的第三类生物大分子，具有十分重要生物学功能，如为生物体提供能量物质，是构成植物细胞壁的主要组成部分，在细胞的分化、发育、肿瘤的发生与细胞间的信号转导、识别、免疫应答等发挥着重要的作用。糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用。50％以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，并且越来越多的研究表明，糖基化异常可导致人类疾病。在临床治疗过程中，使用的抗体药物均带有糖基化。
目前，大量的研究表明，糖蛋白上的糖链的异常变化和许多疾病有关，因此以研究糖链的结构和功能为主要内容的功能糖组学吸引了生命科学领域广泛的关注，尤其是以糖链作为研究对象来筛选癌症血清标志物的研究，为人类癌症的早期诊断、预后、治疗、反应预测和群体筛查开辟了新的途径，例如，糖蛋白的糖链末端常常会发生唾液酸化修饰，它不仅可稳定糖链结构，而且与许多恶性疾病的发生发展密切相关；因此对糖链结构进行解析显得十分的重要。
随着对糖类物质的研究的深入，生物质谱技术尤其是MALDI-TOF-MS技术在糖类物质的结构分析中起着重要的作用。由于它具有“软电离”、广泛的检测范围等优点，已经成为糖类检测分析中不可或缺的工具。但是由于生物来源的糖类物质含量少、结构复杂、不均一性及糖链的微量表达，造成在质谱检测中一些低丰度糖链及糖链上一些不稳定功能基团如唾液酸基团信号的丢失，给糖链的结构解析带来很大的困难。
衍生化技术通过给糖链C-1端半缩醛结构带上疏水性化学基团，改善糖链结构的疏水性，提高糖类物质的离子化效率，进而可提高糖类物质在MALDI-TOF-MS检测分析中的灵敏度。因此，衍生化技术越来越广泛的应用在糖链的MALDI-TOF-MS检测分析中。
目前针对还原性糖链C-1末端醛基的柱前衍生化技术主要有：(1)还原胺化法，此类反应需在酸性、加热(60℃～85℃)条件下进行，易造成唾液酸丢失；并且在催化剂的作用下才能发生反应，衍生化后需要对样品进行除盐纯化等步骤，且不适用于酸性糖链；(2)与吡唑啉酮的碱性缩合反应，此类反应需要在碱性、加热(65℃～75℃)条件下进行，且衍生化后样品也需经纯化处理；(3)肼类试剂成腙反应：此类反应条件相比于前两种方法温和，在弱酸性条件下就可以发生反应，目前常用的衍生化试剂主要有苯肼等。但是，此反应的衍生化效率不够高，较多类型的糖链不能被充分衍生化，后期的检测灵敏度下降。
可以得知，检测前的常规衍生化方法，一方面都具有反应后需纯化、富集处理，才可以进行检测，步骤过于繁杂，衍生化效率不高等缺陷，不利于提高实验效率。另一方面反应过程中一般需要加热，因此，对于酸性糖链来说，在衍生化过程中酸性基团，例如唾液酸易丢失，造成样品大量损失，后续检测灵敏度不高，因此，化学衍生化法用于生物来源糖链的分析和检测仍需改进。
目前，已有研究公开了还原性糖链的靶板衍生化MALDI-TOF-MS分析方法，利用样品在靶板上点样和衍生化过程同时完成，简化了MALDI-TOF-MS分析检测程序。
Kaneshiro等人在Rapid quantitative profiling of N-glycan by theglycan-labeling method using 3-aminoquinoline/α-cyano-4-hydroxycinnamic acid[J].Analytical Chemistry,2012,84(16):7146-7151，中公开了使用3-氨基喹啉和CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)对糖链进行靶板上衍生化的方法，其靶板上衍生化过程需要加热至60℃。该方法一方面需要加热升温，对于含有唾液酸的酸性糖链而言，会造成唾液酸降解，从而检测灵敏度交底，另一方面，此方法衍生化之后的酸性糖必须在负离子模式下才可以进行检测，因此不能同时实现对中性糖和酸性糖的检测。因此，以上靶板上衍生化方法，对于酸性糖链而言，MALDI-TOF-MS检测具有诸多不便。
因此，针对以上问题，对还原性糖链MALDI-TOF-MS分析前的靶板衍生化方法进行改进，寻找一种条件温和，并且可以同时进行中性糖链和酸性糖链检测的衍生化方法，对还原性糖链的分析鉴定具有非常重要的价值。
发明内容
为了解决现有技术中对还原性糖链进行MALDI-TOF-MS分析前的靶板衍生化方法不能同时适用于中性糖链和酸性糖链的检测，并且对于含有不稳定功能基团如唾液酸基团的酸性糖链，容易造成样品降解，信号丢失，检测灵敏度下降的缺陷，本发明一方面提供一种还原性糖链的靶板衍生化方法，另一方面提供了该靶板衍生化方法得到的靶板点样样品的MALDI-TOF-MS分析方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：
一种还原性糖链的靶板衍生化方法，其包括以下步骤：
(1)试剂配制
配置基质DHB溶液，将还原性糖链样品溶于水中得到还原性糖链溶液，将吉拉德试剂T溶解于甲醇、乙酸和水的混合溶剂中得到酸性的吉拉德试剂T溶液，在靶板点样时，取样量相同的情况下，吉拉德试剂T溶液与还原性糖链溶液的质量浓度比大于3.9：1；
(2)点样
分别取基质DHB溶液、还原性糖链溶液、吉拉德试剂T溶液，依次点在MALDI-TOF-MS仪器靶板的同一点上；
(3)干燥
点样后的靶板在室温下放置，直至样品点完全干燥。
进一步地，本发明所述的还原性糖链的靶板衍生化方法中，还原性糖链溶液的质量浓度范围是3.42mg/mL～0.003mg/mL。
进一步地，本发明所述的还原性糖链的靶板衍生化方法中，在靶板点样时，取样量相同的情况下，所述吉拉德试剂T溶液与还原性糖链溶液的摩尔浓度比为10：1～1：1。
进一步地，本发明所述的还原性糖链的靶板衍生化方法中，在取样量相同的情况下，所述吉拉德试剂T溶液与还原性糖链溶液的摩尔浓度比大于8：1。
进一步地，本发明所述的还原性糖链的靶板衍生化方法中，用于溶解吉拉德试剂T的甲醇、乙酸和水的混合溶剂，其中，甲醇和水体积比为1：6～1：8时，在混合溶剂中添加10％～30％(v/v)的乙酸，至混合溶剂的pH＝3～6。
进一步地，本发明所述的还原性糖链的靶板衍生化方法中，用于溶解还原性糖链的水是超纯水或双蒸水；
用于溶解基质DHB的溶剂是体积比为CH3CN：0.1％的TFA水溶液＝1：1的混合溶剂，基质DHB溶液的浓度为20.00mg/mL。
另一方面，本发明还提供了靶板衍生化方法得到的靶板点样样品的MALDI-TOF-MS分析方法，采用的检测模式为反射模式或线性模式；
设定平滑滤过器宽度为30chans；
设定基线滤过器宽度为90chans。
进一步地，本发明所述的MALDI-TOF-MS分析方法中，还设定以下检测参数：
分子量范围为500～10000(m/z)；
工作系统为氮气激光355nm；
频率为40.0Hz；
加速电压为20kv；
压力为1×10-6Torr；
激光在每个靶点上2个不同位置照射累计1000次；
能量为90mV～105mV。
本发明中所述的“酸性糖链”是指带有羧基(-COOH)酸性取代基的糖链，例如含有唾液酸的糖链。
本发明中所述的“中性糖链”是指不含有酸性取代基的糖链，例如，核心α-1,3-岩藻糖糖基化糖链。
本发明所述的“吉拉德试剂T”又称为Girard’s T试剂或GT试剂，化学名称为，氯化三甲胺基乙酰肼，化学式[(CH3)N+CH2CONHNH2]Cl–。
本发明所述的“MALDI-TOF-MS”，是指基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，在本发明额实施例中简称为飞行时间质谱。MALDI-TOF-MS的原理是当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来检测离子。MALDI-TOF-MS的中心技术就是依据样品的质荷比(M/Z)的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。
本发明所述的“基质”是指基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测时辅助样品离子化的试剂；将基质与待测样品仪器点在靶板上，待测样品分散在基质中形成共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给样品分子，从而促进样品分子离子化。
本发明所述的“质量浓度”是指单位体积混合物中某组分的质量称为该组分的质量浓度。
本发明所述的“摩尔浓度”是指单位体积溶液中所含溶质的物质的量。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明的还原性糖链的靶板衍生化方法，MALDI-TOF-MS靶板上，待分析的还原性糖链样品的点样和衍生化过程同时进行，利用吉拉德试剂T在弱酸性、常温条件下与还原性糖链的还原性末端羰基反应，生成稳定的糖腙结构，提高MALDI-TOF-MS检测灵敏度；经过大量实验，本发明的靶板衍生化中所选用的吉拉德试剂T，带有正电荷，并且按照反应的化学计量计算，吉拉德试剂T是过量的，因此经衍生化效率接近100％，可显著提高糖链在质谱检测中的离子化效率，进而具有非常高的检测灵敏度，以对乳糖为例，检测限可达0.15ng左右。
2、本发明的还原性糖链的靶板衍生化方法，以吉拉德T试剂为衍生化试剂，因其结构中带有肼基和正电荷中心(季铵盐)，因此无论是对于中性糖链还是酸性糖链，在衍生化后的质谱检测中均只形成正离子态的分子离子，也就是说，对中性糖链和酸性糖链均可以在正离子模式下进行检测，不需要切换，通用性强，更加简捷、高效。
3、经本发明的还原性糖链的靶板衍生化方法处理得到的靶板点样样品在MALDI-TOF-MS分析中，具有非常高的灵敏度，糖链样品用量只需n mol～p mol级别，衍生化之后不需要后处理，直接进行MALDI-TOF-MS分析，省去了传统衍生化方法除盐、富集等步骤，更高效、简便、快捷，提高了还原性糖链的MALDI-TOF-MS分析效率，为深入研究寡糖链结构与功能奠定基础。
4、本发明的还原性糖链的靶板衍生化方法，衍生化过程中pH条件为弱酸性，室温下反应，不需要加热，对于带有不稳定功能基团，本发明的衍生化条件可以有效抑制或防止样品降解，经验证尤其是可以减少或抑制唾液酸的降解，对于酸性糖链的分析也具有较高灵敏度。
5、采用本发明的还原性糖链的靶板衍生化方法处理后的中性糖链和酸性糖链样品，在后续的MALDI-TOF-MS分析中，还原性糖链溶液的质量浓度范围在3.42mg/mL～0.003mg/mL范围内，都具有非常好的线性，证明了本发明的糖链靶板衍生化和MALDI-TOF-MS分析方法的检测范围广范；样品在10天内检测结果差别很小，证明了该方法具有非常好的稳定性，重复实验RSD低于3％，反应了本方法具有很好的重复性、可靠性。
附图说明
图1为本发明的糖链靶板衍生化方法和MALDI-TOF-MS分析方法研究策略图；
图2为Maltodextrin(麦芽糊精)靶板衍生化之前的MALDI-TOF-MS质谱图(a)和靶板衍生化之后的MALDI-TOF-MS质谱图(b)；
图3乳糖靶板衍生化方法的线性范围评价的标准曲线；
图4为鸡蛋白蛋N-糖链在不同样品浓度下的MALDI-TOF-MS质谱图；
图5为乳糖、鸡蛋白蛋白和RNase B中的N-糖链在衍生化前、衍生化后的MALDI-TOF-MS检测丰度(灵敏度)对比图；
图6为羊乳总蛋白N-糖链靶板衍生化前的MALDI-TOF-MS质谱图(a)和靶板衍生化后的MALDI-TOF-MS质谱图(b)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面所描述的实施例，除非其他方面表明所有的温度定为摄氏度，如无特殊说明温度的误差范围为实施例中无特殊说明，反应温度为室温，室温指25℃±5℃，所有的温度误差为±5℃。
鸡蛋白蛋白、DHB、吉拉德试剂T、乳糖、Maltodextrin(麦芽糊精)、甲醇和微晶纤维素均购于Sigma-Aldrich公司；PNGase F购于New England BioLabs公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、NP-40均购于Aladdin Industrial Inc公司；胎牛血清(FBS)购于Thermo Scientific公司；羊乳购买于西安郊区养羊场。
固相萃取小柱Sep-Pak C18(100mg/1mL)购于Waters公司；固相萃取小柱多孔石墨碳柱(150mg/4mL)购于Alltech Associates公司；微晶纤维素小柱是用一次性枪头自制。色谱纯乙腈购于Fisher Scientific公司，其它试剂均为分析纯。
双蒸水是实验室用自动双重纯水蒸馏器进行制备得到。
超纯水是经Molgene超纯水系统(上海摩勒科学仪器有限公司)进行制备得到。
本发明中基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)使用AXIMAConfidence日本Shimadu公司的MALDI-TOF-MS仪器进行检测，如无特别说明，检测条件如下：
中性糖链样品采用的检测模式为反射模式，酸性糖链样品选用线性模式；
分子量范围为500～10000(m/z)；
工作系统为氮气激光355nm；
频率为40.0Hz；
加速电压为20kv；
压力为1×10-6Torr；
激光在每个靶点上2个不同位置照射累计1000次；
能量为90mV～105mV；
数据采集使用Shimadzu Bioctech MALDI-MS软件，糖链结构的分析软件是Glycoworkbench。
本发明中的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析，均是在正离子模式下检测的。
下面简写词或外文术语的使用贯穿本发明：
ACN 乙腈
TFA 三氟乙酸
DHB 2，5-二羟基苯甲酸，又称龙胆酸
DMSO 二甲基亚砜
DTT 二硫苏糖醇
FBS 胎牛血清
Lactose 乳糖
Int％ 相对丰度
MeOH 甲醇
mL 毫升
min 分钟
ms 毫秒
h 小时
Retention time 保留时间
Relative Abundance 相对丰度
Reducing sugar 还原性糖
RNase B 核糖核酸酶B
Ovalbmin 鸡蛋白蛋白
On-target derivatization 靶板衍生化
Mass spectra of the GT labeled glycan GT试剂衍生化后的寡糖的质谱图
SDS 十二烷基硫酸钠
Samples 样品
Samples and internal Standard Ratio 样品和内标的丰度比
THF 四氢呋喃
Underivatized 衍生化前，未衍生化的
After derivatized with GT GT试剂衍生化后
V 伏
具体实施例：
本发明中的实施例是关于还原性糖链的靶板衍生化方法及经靶板衍生化之后的靶板点样样品的MALDI-TOF-MS分析方法。本发明的糖链靶板衍生化方法和MALDI-TOF-MS分析方法研究策略如图1所示，
本发明的靶板衍生化中选用吉拉德试剂T，反应条件温和，对于带有不稳定功能基团，本发明的衍生化条件可以有效抑制或防止样品降解；衍生化效率接近100％，可显著提高糖链在质谱检测中的离子化效率，进而具有非常高的检测灵敏度。以吉拉德T试剂为衍生化试剂，因其结构中带有肼基和正电荷中心(季铵盐)，因此无论是对于中性糖链还是酸性糖链，在衍生化后的质谱检测中均只形成正离子态的分子离子，对中性糖链和酸性糖链均可以在正离子模式下进行检测，不需要切换，通用性强，更加简捷、高效。
具体实验过程以下详述。
实施例1：麦芽糊精(Maltodextrin)的靶板衍生化及衍生化后的MALDI-TOF-MS分 析
麦芽糊精(Maltodextrin)是一种大分子还原性寡糖，称取麦芽糊精，用超纯水作为溶剂，配制成质量浓度为0.10mg/mL的糖链溶液；称取吉拉德试剂T，溶解于甲醇、乙酸和水的混合溶剂中得到酸性的吉拉德试剂T溶液，混合溶剂中，甲醇：乙酸：水(v：v：v)＝1：3：6，配制成质量浓度为13.36mg/mL的吉拉德试剂T溶液。基质DHB溶解于CH3CN：0.1％的TFA水溶液(v：v)＝1：1的混合溶剂中，配制成质量浓度为20.00mg/mL的基质溶液。
分别吸取基质DHB的溶液、还原性糖链溶液、吉拉德试剂T溶液各0.5μL，依次点在MALDI-TOF-MS仪器靶板的同一点上；点样后的靶板在室温下放置0.5小时，样品点完全干燥。
将靶板放入MALDI-TOF-MS仪器中，设定检测参数：
采用的检测模式为反射模式；
分子量范围为500～10000(m/z)；
工作系统为氮气激光355nm；
频率为40.0Hz；
加速电压为20kv；
压力为1×10-6Torr；
激光在每个靶点上2个不同位置照射累计1000次；
能量为90mV～105mV；
平滑滤过器宽度(Smoothing filter width)为30chans；
基线滤过器宽度(Baseline filter width)为90chans；
数据采集使用Shimadzu Bioctech MALDI-MS软件，糖链结构的分析软件是Glycoworkbench。
本实施例中改进了常规的MALDI-TOF-MS分析方法，调整了检测参数，尤其是将
平滑滤过器宽度(Smoothing filter width)调整为30chans；基线滤过器宽度(Baseline filter width)调整为90chans，提高了质谱分析样品时图谱的质量，降低背景峰的干扰，获得了更准确的检测结果。
进行MALDI-TOF-MS检测分析，同时将未经衍生化的麦芽糊精配制成相同浓度的溶液，直接进行MALDI-TOF-MS分析；得到麦芽糊精靶板衍生化之前的MALDI-TOF-MS质谱图如图2中(a)所示和靶板衍生化之后的MALDI-TOF-MS质谱图如图2中(b)所示。
衍生化后由图2(b)可以看出衍生化完全，衍生化后聚合度可以到48(DP48)，此处的聚合度指的是糖链中所包含单糖的个数，以衍生化后未衍生化的糖链和衍生化前的糖链的在质谱图中的相对丰度比为衡量指标，在图2的(b)中未发现未衍生化的糖链，因此可以看出麦芽糊精样品经靶板衍生化后的衍生化效率接近100％。
经靶板衍生化方法处理得到的靶板点样样品在MALDI-TOF-MS分析中，衍生化过程操作简单、反应时间短，且衍生化之后不需要后处理，直接进行MALDI-TOF-MS分析，省去了传统衍生化方法除盐、富集等步骤，更高效、简便、快捷，提高了还原性糖链的MALDI-TOF-MS分析效率，为深入研究寡糖链结构与功能奠定基础。
实施例2：以乳糖为例对靶板衍生化条件进行优化
按照实施例1的实验步骤进行乳糖的靶板衍生化及MALDI-TOF-MS分析，观察吉拉德试剂T的用量与糖链的用量之间的关系。
称取乳糖，用超纯水作为溶剂，配制成质量浓度为3.42mg/mL的乳糖溶液；称取吉拉德试剂T，溶解于甲醇、乙酸和水的混合溶剂中得到酸性的吉拉德试剂T溶液，混合溶剂中，甲醇：乙酸：水(v：v：v)＝1：3：6，配制成质量浓度为1.67mg/mL、3.34mg/mL、5.01mg/mL、6.68mg/mL、8.35mg/mL、10.02mg/mL、11.69mg/mL、13.36mg/mL、15.03mg/mL、16.7mg/mL。换算成摩尔浓度，即吉拉德试剂T溶液与还原性糖链溶液的摩尔浓度比为10：1～1：1。也就是说用吉拉德试剂T对还原性糖链进行衍生化时，反应中衍生化试剂与底物糖链的化学计量比为10：1～1：1。
吉拉德试剂T溶液配制时，对溶剂进行筛选，选取甲醇和水的混合溶剂时，比单纯使用甲醇作溶剂，溶解效果好。经过筛选，甲醇和水体积比为1：6～1：8时，溶解效果较好。在混合溶剂中添加10％～30％(v/v)的乙酸目的是为了提供还原性糖链与吉拉德试剂T反应时所需的弱酸性环境，加入乙酸后pH调整为3～6的弱酸性范围内均具有较好的衍生化效率。
基质DHB溶解于CH3CN：0.1％的TFA水溶液(v：v)＝1：1的混合溶剂中，配制成质量浓度为20.00mg/mL的基质溶液。
用超纯水做溶剂配制浓度为11.34mg/mL的环糊精溶液，环糊精作为内标，以衍生化后生成的糖腙与环糊精的丰度比作为衡量标准，计算衍生化效率。
分别吸取基质DHB的溶液、还原性糖链溶液、吉拉德试剂T溶液各0.5μL，依次点在MALDI-TOF-MS仪器靶板的同一点上；点样后的靶板在室温下放置0.5小时，样品点完全干燥。
将点样后的靶板放入MALDI-TOF-MS仪器中，设定同实施例1相同的检测参数，进行MALDI-TOF-MS检测分析。发现在取样量相同的情况下，随着吉拉德试剂T的浓度提高，衍生化效率逐渐提高，吉拉德试剂T溶液与乳糖溶液的质量浓度比为3.9：1(摩尔浓度大于8：1)时，衍射化效率接近100％，吉拉德试剂T溶液的浓度继续增加，基线噪音略有增加，衍生化效率保持接近100％。
因对蛋白中释放的还原性糖链而言，一般分子量都大于乳糖(二糖，分子量342)，因此，为了保证衍生化效率保持较高水平，在采用本发明的靶板衍生化方法时，对于其他的糖链而言，分子量一般都大于乳糖，在靶板点样时相同取样量的情况下，吉拉德试剂T溶液与还原性糖链溶液的质量浓度比大于3.9：1(摩尔浓度比大于8：1，也就是化学计量比大于8：1)，衍生化效率接近100％，检测效果最佳，灵敏度最高。
吉拉德试剂T与还原性糖链的还原性末端羰基反应，生成稳定的糖腙结构，选用的吉拉德试剂T，带有正电荷，并且按照反应的化学计量计算，吉拉德试剂T是大大过量的，因此经衍生化效率接近100％。
实施例3：以乳糖为例对经靶板衍生化后的样品进行MALDI-TOF-MS分析方法评估
按照实施例2中优化后的靶板衍生化条件进行乳糖的衍生化，然后按照实施例1的方法进行MALDI-TOF-MS分析，对该方法的线性范围、稳定性、重复性进行评估。
用超纯水作为溶剂，也可以用双蒸水，配制浓度范围为3.42mg/mL、1.71mg/mL、0.85mg/mL、0.43mg/mL、0.22mg/mL、0.11mg/mL、0.06mg/mL和0.03mg/mL的乳糖水溶液，吉拉德试剂T溶液浓度为13.36mg/mL，DHB 20.00mg/mL。用超纯水做溶剂配制浓度为11.34mg/mL的环糊精溶液，环糊精作为内标试剂，以衍生化后生成的糖腙与环糊精的丰度比作为指标参数，计算相对丰度比。
(1)线性评价
对各个浓度的乳糖样品进行靶板衍生化MALDI-TOF-MS分析检测，对糖链浓度和相对丰度比做标准曲线，计算相关系数，得到在糖链浓度变化128倍范围内，即0.03mg/mL/mL～3.42mg/mL内的线性关系，相关系数R2大于0.99代表线性良好。
标准曲线如图3所示，本实施例中得到线性回归方程为：y＝1.4687x+0.2215，相关系数R2＝0.9992，线性良好。
(2)重复性评价
对靶板上的相同条件下的每个待分析点每隔1、2、3、4、5、7和10天进行MALDI-TOF-MS检测，重复6次，然后计算RSD值(RSD≤3％表示重复性良好)。具体实验结果如下表1所示：
表1乳糖靶板衍生化重复性检测
由表中可知：本实施例中，经计算RSD＝3.00％，重复性良好。
(3)稳定性评价
上述乳糖样品放置10天后，重复实验，对稳定性的计算方法和重复性相同，计算RSD值(RSD≤3％代表重复性良好)。具体实验结果如下表2所示：
表2乳糖靶板衍生化稳定性检测
天数(d) 1 2 3 4 5 7 10
相对丰度比平均值 13.30 11.36 10.89 9.67 8.78 8.23 4.84
RSD(％) 0.73 1.00 1.66 1.73 2.45 2.54 2.95
由表2可知：本实施例中，经计算RSD＝2.95％，重复性良好。
综合本实施例实验结果：采用本发明的还原性糖链的靶板衍生化方法处理后的还原性糖链样品，在后续的MALDI-TOF-MS分析中，还原性糖链溶液的质量浓度变化128倍范围内，即范围在3.42mg/mL～0.03mg/mL范围内，都具有非常好的线性，证明了本发明的糖链靶板衍生化和MALDI-TOF-MS分析方法的检测范围广范；样品在10天内检测RSD＝2.95％，结果差别很小，证明了该方法具有非常好的稳定性；重复实验RSD在3％以内，反应了本方法具有很好的重复性、可靠性。
实施例4：以鸡蛋白蛋白的N-糖链为例考察经靶板衍生化后的样品的MALDI-TOF- MS分析的检测限
本发明中自制糖链均采用标准糖蛋白N-糖链的制备方法，以下以鸡蛋白蛋白为例，对该通用方法进行说明，以下对于RNase B的N-糖链和羊乳总蛋白N-糖链的制备均采用相同方法。
本发明采用的是PNGase F酶法制备N-糖链，其步骤如下，以及蛋白蛋白为例：
(1)酶解：2mg鸡蛋白蛋白溶于540μL的超纯水中，加60μL蛋白变性液(0.5g SDS和0.62g DTT溶于10mL蒸馏水中)，100℃下加热10min，冷却至室温，加60μL磷酸盐缓冲液(1.90g磷酸钠溶于10mL水中，用磷酸调至pH＝7.5)和60μL 10％NP-40(乙基苯基聚乙二醇用水稀释10倍后使用)，然后加入2.00μL PNGase F酶(500unit/μL)，37℃保温解离24小时后，冷冻保存，以待纯化。
(2)纯化：将酶解得到的样品离心，依次用C18固相萃取小柱和石墨碳固相萃取小柱对解离的样品进行纯化。C18固相萃取小柱纯化，纯化过程如下：10mL乙腈(CH3CN)活化柱子，10mL超纯水平衡柱子，吸取上清液滴加于柱子内，20mL超纯水洗样品；接水洗脱样。样品经C18纯化后，紧接着用石墨碳固相小柱纯化，其过程如下：10mL乙腈(CH3CN)活化柱子，10.00mL超纯水平衡柱子，上样，用25.00mL双蒸水洗除杂，水洗液不收集，然后用25％乙腈水溶液4mL洗脱，接样，将收集得到的纯化后的样品常温旋干，于–21℃冷冻保存，用于后续的衍生化检测分析。
鸡蛋白蛋白2.00mg经PNGase F酶解得到的N-糖链，纯化后浓缩，溶于200μL超纯水中，配制成不同的浓度的溶液即：0.30mg/mL、30.00μg/mL和3.00μg/mL，然后别取0.5μL按照实施例2的靶板衍生化方法进行衍生化处理，衍生化后的样品按照实施例1的方法进行MALDI-TOF-MS分析，实验结果如图4所示。
由图4可知：当糖链样品量在最低检测限0.15μg～1.5μg时，仍可以检测到全部糖链，当样品用量为0.15ng时可以检测到其中的大多数糖链，糖链浓度降低至0.003mg/mL仍可以进行准确检测。本方法的检测限范围为0.15ng～1.5ng。
因此，本发明的靶板衍生化和MALDI-TOF-MS分析方法具有非常高的灵敏度，糖链样品用量只需n mol～p mol级别就可以进行检测。
实施例5：以乳糖、鸡蛋白蛋白和RNase B中的N-糖链为例考察靶板衍生化后的样 品的MALDI-TOF-MS分析的灵敏度
按照实施例4中的标准糖蛋白N-糖链制备方法制备鸡蛋白蛋白N-糖链和RNase BN-糖链。
以乳糖、鸡蛋白蛋白N-糖链和RNase B N-糖链为例，以环糊精作为内标，采用内标法对靶板衍生化后的样品的MALDI-TOF-MS分析方法的灵敏度进行比对分析。以衍生化后糖腙与环糊精的相对丰度比与衍生化前糖链与环糊精的丰度比的比值作为评价指标。
对三种N-糖链样品按照实施例2的靶板衍生化方法进行衍生化处理，衍生化后的样品按照实施例1的方法进行MALDI-TOF-MS分析。
经计算，采用内标法定量法对乳糖、生物来源的鸡蛋白蛋白N-糖链和RNase B N-糖链的衍生化灵敏度进行了比较分析，结果如图5所示。
由图5可知：乳糖、生物来源的鸡蛋白蛋白N-糖链和RNase B N-糖链的MALDI-TOF-MS质谱检测灵敏度分别提高了22.92倍、10.20倍和9.17倍。
通过以上实施例1～5证明了本发明的靶板衍生化方法，衍生化后的样品MALDI-TOF-MS分析方法，在应用于中性糖链的分析时，具有衍生化效率高、高效、简便、快捷，检测范围广范，具有非常好的线性、稳定性、重复性、可靠性。
以下选取含有酸性糖链的样品对本方法的适用范围进行验证。
实施例6：对羊乳总蛋白N-糖链进行靶板衍生化后MALDI-TOF-MS分析
以生物来源的羊乳总蛋白N-糖链为样品对方法进行验证：
取冷冻存放的两种乳汁样品，于室温下溶解(可以用自来水冲洗)取样品10mL，加入1倍体积的双蒸水，混匀后，4℃放置1小时，然后2200g离心30min，静置除去上层脂层；再离心30min除脂，加入2倍体积的–20℃乙醇于除脂后的乳汁样品中，充分搅拌均匀后4℃放置4小时，然后16000g、4℃离心1小时，取上清，浓缩至干燥，得寡糖样品，取沉淀加水溶解，透析、冻干，为总蛋白样品，冷冻保存备用。
羊乳总蛋白N-糖链的释放、纯化采用实施例4中的标准糖蛋白N-糖链制备方法制备羊乳总蛋白N-糖链：酶解10mg羊乳总蛋白样品。
对N-糖链样品按照实施例2的靶板衍生化方法进行衍生化处理，衍生化后的样品按照实施例1的方法进行MALDI-TOF-MS分析，区别仅在于，本实施例采用线性模式检测，得到MALDI-TOF-MS质谱图如图6(b)所示。
同时对N-糖链样品按照相同实验条件直接进行MALDI-TOF-MS分析，对二者进行对比，靶板衍生化前MALDI-TOF-MS质谱图见图6中(a)。
由图6可知：羊乳总蛋白N-糖链按照本发明的靶板衍生化方法进行衍生化处理后MALDI-TOF-MS分析，相比于直接进行MALDI-TOF-MS分析，多检测到11条糖链(较浅色)，新检测到6条酸性糖。
并且对于酸性糖链，没有发现唾液酸的丢失，说明本方法能同时实现对酸性糖和中性糖的检测分析，且可以有效防止含有唾液酸的样品降解，对于酸性糖链的分析具有较高灵敏度。
综上所述，本发明的还原性糖链的靶板衍生化方法，以吉拉德T试剂为衍生化试剂，因其结构中带有肼基和正电荷中心(季铵盐)，因此无论是对于中性糖链还是酸性糖链，在衍生化后的质谱检测中均只形成正离子态的分子离子，也就是说，对中性糖，链和酸性糖链均可以在正离子模式下进行检测，不需要切换，通用性强，更加简捷、高效。
在衍生化过程中，pH条件为近中性的弱酸性，室温下反应，不需要加热，对于带有不稳定功能基团，本发明的衍生化条件可以有效抑制或防止样品降解，经验证尤其是可以减少或抑制唾液酸的降解，对于酸性糖链的分析也具有较高灵敏度。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种还原性糖链的靶板衍生化方法，其包括以下步骤：
(1)试剂配制
配置基质DHB溶液，将还原性糖链样品溶于水中得到还原性糖链溶液，将吉拉德试剂T溶解于甲醇、乙酸和水的混合溶剂中得到酸性的吉拉德试剂T溶液，在靶板点样时，取样量相同的情况下，吉拉德试剂T溶液与还原性糖链溶液的质量浓度比大于3.9：1；
(2)点样
分别取基质DHB溶液、还原性糖链溶液、吉拉德试剂T溶液，依次点在MALDI-TOF-MS仪器靶板的同一点上；
(3)干燥
点样后的靶板在室温下放置，直至样品点完全干燥。
2.根据权利要求1所述的还原性糖链的靶板衍生化方法，其特征在于，还原性糖链溶液的质量浓度范围是3.42mg/mL～0.003mg/mL。
3.根据权利要求1所述的还原性糖链的靶板衍生化方法，其特征在于，在靶板点样时，取样量相同的情况下，所述吉拉德试剂T溶液与还原性糖链溶液的摩尔浓度比为10：1～1：1。
4.根据权利要求1所述的还原性糖链的靶板衍生化方法，其特征在于，在取样量相同的情况下，所述吉拉德试剂T溶液与还原性糖链溶液的摩尔浓度比大于8：1。
5.根据权利要求1所述的还原性糖链的靶板衍生化方法，其特征在于，用于溶解吉拉德试剂T的甲醇、乙酸和水的混合溶剂，其中，甲醇和水体积比为1：6～1：8时，在混合溶剂中添加10％～30％(v/v)的乙酸，至混合溶剂的pH＝3～6。
6.根据权利要求1所述的还原性糖链的靶板衍生化方法，其特征在于，
用于溶解还原性糖链的水是超纯水或双蒸水；
用于溶解基质DHB的溶剂是体积比为CH3CN：0.1％的TFA水溶液＝1：1的混合溶剂，基质DHB溶液的浓度为20.00mg/mL。
7.经权利要求1～5任一项的靶板衍生化方法得到的靶板点样样品的MALDI-TOF-MS分析方法，其特征在于，采用的检测模式为反射模式或线性模式；
设定平滑滤过器宽度为30chans；
设定基线滤过器宽度为90chans。
8.根据权利要求6所述的MALDI-TOF-MS分析方法，其特征在于，还设定以下检测参数：
分子量范围为500～10000(m/z)；
工作系统为氮气激光355nm；
频率为40.0Hz；
加速电压为20kv；
压力为1×10-6Torr；
激光在每个靶点上2个不同位置照射累计1000次；
能量为90mV～105mV。
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