CN110487867B - T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法 - Google Patents

T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，包括步骤：首先设计巯基化单链DNA探针a、探针b和5’端修饰氨基的探针c，探针a通过金‑巯键固定于金电极表面；探针a 5’端的羟基可被T4多聚核苷酸激酶催化磷酸化，DNA探针a接着与探针b、探针c杂交，探针c的3’端与探针a的5’端的磷酸基团在T4 DNA连接酶作用下发生连接反应；再进行加热变性处理，探针c仍然保留在电极表面，探针c末端的氨基可进一步捕获银纳米颗粒，最后通过检测银纳米颗粒的溶出伏安信号得到T4多聚核苷酸激酶的定量检测结果。本发明具有灵敏度高，选择性好，快速以及成本低的特点，检测限为0.01U/mL。

Description

T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法
技术领域
本发明涉及T4多聚核苷酸激酶检测领域，特别涉及一种T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法。
背景技术
激酶是一类将高能供体分子中的磷酸基团催化转移到特定目标底物的酶，这类酶与DNA复制、DNA重组、DNA修复等正常的细胞生理活动密切相关。激酶的异常表达会导致布伦氏症候群，沃纳综合征，色素沉着综合征等多种人类疾病。T4多聚核苷酸激酶是激酶家族中的重要成员，它能够催化ATP的γ位磷酸转移到寡核苷酸链或核酸的5’羟基末端。T4多聚核苷酸激酶在细胞内DNA代谢，尤其是DNA损伤修复中发挥着重要作用。因此，发展T4多聚核苷酸激酶的检测技术有助于为生物学研究及临床诊断提供有力的工具。传统的检测T4多聚核苷酸激酶活性的方法有放射性同位素32P标记法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和放射自显影法。但是这些方法或是实验步骤繁琐耗时并需要特殊的设备，或选择性和灵敏度不高，或需要同位素标记对人体有害，因此限制了这些方法的广泛应用。发展新型简单方便且灵敏度高的分析方法十分必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，包括以下步骤：首先设计巯基化单链DNA探针a、探针b和5’端修饰氨基的探针c，探针a通过金-巯键固定于金电极表面；反应体系中存在T4多聚核苷酸激酶时，探针a 5’端的羟基被T4多聚核苷酸激酶催化磷酸化，DNA探针a接着与探针b、探针c杂交，探针c的3’端与探针a的5’端的磷酸基团在T4DNA连接酶作用下发生连接反应，从而形成一条完整的DNA链；再进行加热变性处理，探针c仍然保留在电极表面，探针c末端的氨基可进一步捕获银纳米颗粒，最后通过检测银纳米颗粒的溶出伏安信号得到T4多聚核苷酸激酶的定量检测结果。
优选的是，所述银纳米颗粒的制备方法具体包括：首先制备浓度为0.25mM的硝酸银溶液与柠檬酸钠溶液；接着制备浓度为10mM的硼氢化钠溶液；然后将100mL硝酸银/柠檬酸钠溶液与3mL硼氢化钠溶液混合，在常温下搅拌反应；30分钟后，停止搅拌，混合反应液在黑暗中放置过夜；最后离心纯化制得银纳米颗粒，离心转速为12000g、时间为30分钟。
优选的是，其中，将探针a修饰于金电极表面的步骤具体包括：首先将金电极进行预处理，然后将预处理后的金电极浸泡入探针a溶液中反应10小时，用纯水冲洗干净后在将其浸泡入巯基己醇中反应30分钟，得到修饰有探针a的金电极。
优选的是，金电极进行预处理的步骤包括：将金电极浸泡在水虎鱼溶液中5分钟，然后利用P5000的砂纸进行打磨，随后将金电极依次在1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝砂浆中打磨至镜面光滑；然后将金电极依次放入乙醇及纯水中各超声5分钟；再将金电极在0.5MH2SO4中进行电化学清洗，最后用氮气吹干。
优选的是，用探针a修饰的金电极进行T4多聚核苷酸激酶定量检测的步骤具体包括：配置一系列标准浓度的T4多聚核苷酸激酶溶液，将制得的探针a修饰的金电极放入含有3mM ATP的上述T4多聚核苷酸激酶溶液，在37℃下反应1小时；接着，金电极用纯水清洗后，浸泡入探针b与探针c的混合溶液中；随后，将金电极与10U mL-1T4DNA连接酶进行反应，在22℃下反应1小时后，将金电极加热到95℃，持续5min，然后快速冷却至室温；再将金电极与银纳米颗粒反应20分钟后，进行电化学测试。
优选的是，其中，电化学测试使用三电极系统：银/氯化银参比电极，铂丝对电极，金工作电极；线性伏安扫描法的电解质为0.1M KCl，扫描速率为0.1V/s。
优选的是，所述探针a序列为：
5’-GCAAGAATTTCGACATGGCGTG-SH-3’；
所述探针b序列为：5’-CACGCCATGTCGAAATTCTTGCGTGCCTAT-3’；
所述探针c序列为：5’-NH2-TTTATAGGCAC-3’。
本发明的有益效果是：本发明用于检测T4多聚核苷酸激酶，具有灵敏度高，选择性好，快速以及成本低的特点，检测限为0.01U/mL；通过设计连接酶反应将磷酸化反应转化为银纳米颗粒溶出伏安信号的检测，可以实现T4多聚核苷酸激酶的生物传感的应用。
附图说明
图1为本发明的T4多聚核苷酸激酶的电化学检测示意图；
图2为本发明的一种实施例中不同浓度T4多聚核苷酸激酶存在条件下得到的线性伏安扫描曲线；
图3为本发明的一种实施例中ADP、硫酸铵对T4多聚核苷酸激酶的抑制效果图；
图4为本发明的一种实施例中的电化学检测的选择性验证图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例的一种T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，包括以下步骤：首先设计巯基化单链DNA探针a、探针b和5’端修饰氨基的探针c，探针a通过金-巯键固定于金电极表面；反应体系中存在T4多聚核苷酸激酶时，探针a5’端的羟基可以被T4多聚核苷酸激酶催化磷酸化，DNA探针a接着与探针b、探针c杂交，探针c的3’端可以与探针a的5’端的磷酸基团在T4DNA连接酶作用下发生连接反应，从而形成一条完整的DNA链；进行加热变性处理后，探针c仍然能保留在电极表面，探针c末端的氨基可以进一步捕获银纳米颗粒，最后通过检测银纳米颗粒的溶出伏安信号可得到T4多聚核苷酸激酶的定量检测结果。本方法用于检测T4多聚核苷酸激酶，具有灵敏度高，选择性好，快速以及成本低的特点，检测限为0.01U/mL，并能有效用于抑制剂的筛选；通过设计连接酶反应将磷酸化反应转化为银纳米颗粒溶出伏安信号的检测，可以实现T4多聚核苷酸激酶的生物传感的应用。
参照图1为本发明的T4多聚核苷酸激酶的电化学检测示意图，图中上半部分为体系中无T4PNK(T4多聚核苷酸激酶)的情况；其中，ligase(连接酶)具体为T4DNA连接酶。
参照图2，图2(A)，为不同浓度T4多聚核苷酸激酶存在条件下(0.1,0.2,0.5,1,2,5,10,20,50，100U mL-1,从上到下)得到的线性伏安扫描曲线。图2(B)为相应的校准曲线，内嵌图为线性区间。由图可知，随着T4多聚核苷酸激酶浓度的升高，线性伏安曲线的电流峰明显增大，证明吸附的银纳米颗粒量的增多，这是由于激酶催化的磷酸化反应辅助的连接反应使更多的氨基化DNA连接在电极表面。图2(B)为峰电流与T4多聚核苷酸激酶浓度的定量关系，线性范围为0.1到20U mL-1，线性方程为y＝24.009+20.245x，检测限为0.01U mL-1。
参照图3，图3(A)与图3(B)分别为ADP、硫酸铵对T4多聚核苷酸激酶的抑制效果图，图4为电化学检测的选择性验证图。由图3可知，ADP、硫酸铵对T4多聚核苷酸激酶有显著的抑制效应，随着这两种抑制剂浓度的提高，峰电流数值越来越低，证明T4多聚核苷酸激酶受抑制程度的增高。此外，参照图4，通过引入BSA等潜在干扰物进行测试，实验结果表明，BSA等物质的存在几乎不会产生银纳米颗粒的电流峰，验证了本发明的方法良好的选择性。
以下提供一种具体的实施例，以对本发明做进一步说明。
实施例1
1)DNA探针设计：
探针a序列为：5’-GCAAGAATTTCGACATGGCGTG-SH-3’；
探针b序列为：5’-CACGCCATGTCGAAATTCTTGCGTGCCTAT-3’；
探针c序列为：5’-NH2-TTTATAGGCAC-3’。
2)制备直径5nm左右的银纳米颗粒：首先制备浓度为0.25mM的硝酸银溶液与柠檬酸钠溶液；接着制备浓度为10mM的硼氢化钠溶液；然后将100mL硝酸银/柠檬酸钠溶液与3mL硼氢化钠溶液混合，在常温下搅拌反应；30分钟后，停止搅拌，混合反应液在黑暗中放置过夜；黄色的银纳米颗粒利用离心的方法进行纯化，转速为12000g，时间为30分钟。
3)将探针a修饰于金电极表面
金电极预处理：将金电极浸泡在水虎鱼溶液(98％H2SO4:30％H2O2＝3:1)中5分钟，然后利用P5000的砂纸进行打磨，随后将金电极依次在1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝砂浆中打磨至镜面光滑；然后将金电极依次放入乙醇及纯水中各超声5分钟；再将金电极在0.5MH2SO4中进行电化学清洗，最后用氮气吹干。然后将预处理后的金电极浸泡入探针a溶液中反应10小时，用纯水冲洗干净后在将其浸泡入巯基己醇中反应30分钟，得到修饰有探针a的金电极。
4)进行T4多聚核苷酸激酶定量检测：配置一系列标准浓度的T4多聚核苷酸激酶溶液，将制得的探针a修饰的金电极放入含有3mM ATP的上述T4多聚核苷酸激酶溶液，在37℃下反应1小时；接着，金电极用纯水清洗后，浸泡入探针b与探针c的混合溶液中；随后，将金电极与10U mL-1T4DNA连接酶进行反应，在22℃下反应1小时后，将金电极加热到95℃，持续5min，然后快速冷却至室温；再将金电极与银纳米颗粒反应20分钟后，进行电化学测试。
其中，电化学实验采用CHI660D电化学工作站进行测量，使用三电极系统：银/氯化银参比电极，铂丝对电极，金工作电极；线性伏安扫描法的电解质为0.1M KCl，扫描速率为0.1V/s。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
发明名称： T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法
所述探针a序列为：5’-GCAAGAATTTCGACATGGCGTG-SH-3’；
所述探针b序列为：5’-CACGCCATGTCGAAATTCTTGCGTGCCTAT-3’；
所述探针c序列为：5’-NH2-TTTATAGGCAC-3’。

Claims (6)

1.一种T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：首先设计巯基化单链DNA探针a、探针b和5’端修饰氨基的探针c，探针a通过金-巯键固定于金电极表面；反应体系中存在T4多聚核苷酸激酶时，探针a 5’端的羟基被T4多聚核苷酸激酶催化磷酸化，DNA探针a接着与探针b、探针c杂交，探针c的3’端与探针a的5’端的磷酸基团在T4 DNA连接酶作用下发生连接反应，从而形成一条完整的DNA链；再进行加热变性处理，探针c仍然保留在电极表面，探针c末端的氨基可进一步捕获银纳米颗粒，最后通过检测银纳米颗粒的溶出伏安信号得到T4多聚核苷酸激酶的定量检测结果；
所述探针a序列为：5’-GCAAGAATTTCGACATGGCGTG-SH-3’；
所述探针b序列为：5’-CACGCCATGTCGAAATTCTTGCGTGCCTAT-3’；
所述探针c序列为：5’-NH2-TTTATAGGCAC-3’。
2.根据权利要求1所述的T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，其特征在于，所述银纳米颗粒的制备方法具体包括：首先制备浓度为0.25 mM的硝酸银溶液与柠檬酸钠溶液；接着制备浓度为10 mM的硼氢化钠溶液；然后将100 mL硝酸银/柠檬酸钠溶液与3 mL硼氢化钠溶液混合，在常温下搅拌反应；30分钟后，停止搅拌，混合反应液在黑暗中放置过夜；最后离心纯化制得银纳米颗粒，离心转速为12000g、时间为30分钟。
3.根据权利要求2所述的T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，其特征在于，其中，将探针a修饰于金电极表面的步骤具体包括：首先将金电极进行预处理，然后将预处理后的金电极浸泡入探针a溶液中反应10小时，用纯水冲洗干净后再将其浸泡入巯基己醇中反应30分钟，得到修饰有探针a的金电极。
4.根据权利要求3所述的T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，其特征在于，金电极进行预处理的步骤包括：将金电极浸泡在水虎鱼溶液中5分钟，然后利用P5000的砂纸进行打磨，随后将金电极依次在1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝砂浆中打磨至镜面光滑；然后将金电极依次放入乙醇及纯水中各超声5分钟；再将金电极在0.5 M H2SO4中进行电化学清洗，最后用氮气吹干。
5.根据权利要求4所述的T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，其特征在于，用探针a修饰的金电极进行T4多聚核苷酸激酶定量检测的步骤具体包括：配置一系列标准浓度的T4多聚核苷酸激酶溶液，将制得的探针a修饰的金电极放入含有3 mM ATP的上述T4多聚核苷酸激酶溶液，在37°C下反应1小时；接着，金电极用纯水清洗后，浸泡入探针b与探针c的混合溶液中；随后，将金电极与10U mL-1 T4 DNA连接酶进行反应，在22°C下反应1小时后，将金电极加热到95°C，持续5min，然后快速冷却至室温；再将金电极与银纳米颗粒反应20分钟后，进行电化学测试。
6.根据权利要求5所述的T4多聚核苷酸激酶的定量检测方法，其特征在于，其中，电化学测试使用三电极系统：银/氯化银参比电极，铂丝对电极，金工作电极；线性伏安扫描法的电解质为0.1 M KCl，扫描速率为0.1 V/s。
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