CN109828018B - 一种基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器及其制备方法和检测方法 - Google Patents
一种基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器及其制备方法和检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米生物传感技术领域，具体涉及一种基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器及其制备方法和检测方法，通过吸附在MoS2/Ti3C2表面的Au NPs与末端修饰的RNA生物分子连接，构建RNA/Au NPs/MoS2/Ti3C2生物探针；本发明通过水热法合成一种新型二维纳米复合材料MoS2/Ti3C2，利用MoS2/Ti3C2高比表面积的特性，Au NPs优秀的导电性能，并且利用末端修饰的RNA生物分子具有特异性选择识别miRNA的能力，实现检测信号的放大，从而构建一种基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器；本发明可以实现对miRNA的快速、高灵敏、高特异性的检测，在肿瘤检测和分子生物学等领域将有巨大的应用潜能。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物传感技术领域，具体涉及一种基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器及其制备方法和检测方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类含有18-25个核苷酸的短链非编码RNA，通过调控基因表达，可产生包括控制细胞生长、增殖、凋亡、应激等广泛的生物学作用。近年来国内外学者研究发现来自血浆、血清、尿液及唾液中的miRNA表达水平和肿瘤的发生发展有着密不可分的关系。miRNA在特定组织及特定发育阶段表达，具有组织特异性和时序性，这就决定了miRNA将在疾病的诊断中发挥重要作用。在肿瘤早期，miRNA在体液中的丰度是极低的，且同源性较高、易被分解，这就对检测方法的灵敏度、检测性有了很高要求。
目前可以实现miRNA检测的方法有很多。诺瑟杂交(Northern blotting)是miRNA的经典检测方法，但是该方法灵敏度较低，并不适用于临床样本的高通量检测；芯片检测方法可以实现快速、高通量的检测，但是重现性和定量准确性不好；定量PCR是检测miRNA表达一种极常用的方法，是基础研究和临床应用中检测miRNA的金标准，但是临床诊断检测中，在血液中精确检测miRNA种类和含量仍是非常棘手。
近年来，纳米技术和生物传感器技术的迅速发展为实现miRNA快速、大规模、高灵敏的检测提供了新的思路。其中，基于纳米材料的电化学生物传感技术因其快速、灵敏、高特异性、低成本等优势，具有很好的研究、应用前景；但miRNA的检测灵敏度还有待提高。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器制备及检测方法。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
一种基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器，包括电化学工作站三电极系统，所述电化学工作站三电极系统的检测电极为：探针RNA/Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE；
所述探针RNA末端修饰有巯基。
优选地，电化学工作站三电极系统的辅助电极采用铂丝电极，参比电极采用Ag/AgCl电极，电解质溶液配方为含有2.5mM[Fe(CN)6]3-/4-、1M KCl的PH＝4的PBS溶液。
优选地，所述探针RNA的序列为：5’-SH-UUU UUA GUG UGA GUU CUA CCA UUG CCAAA-3’；所述的miRNA序列为：5’-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3’。
上述基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器中检测电极的制备方法，包括以下步骤：
(1)取10μL MoS2/Ti3C2悬浊液滴涂到玻碳电极表面，25℃条件下自然干燥1.5小时，制得MoS2/Ti3C2/GCE；
(2)取10μL Au NPs溶液滴涂到MoS2/Ti3C2/GCE表面，25℃条件下自然干燥1.5小时，制得Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE；
(3)取10μL浓度为1nM的末端修饰有巯基的探针RNA固定缓冲液滴涂到Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE电极表面，25℃条件下自然干燥1.5小时，用PH＝7.4的PBS缓冲液滴洗电极表面去除未吸附的探针RNA，制得探针RNA/Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE；
(4)将所述探针RNA/Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE浸入2g/L的BSA封闭溶液中，封闭1 小时。
优选地，所述玻碳电极在使用前要进行打磨处理：将玻碳电极在0.3微米的氧化铝浆中打磨至镜面，然后依次在丙酮、乙醇、去离子水中超声处理5min以去除表面残余的氧化铝颗粒。
优选地，步骤(1)所述MoS2/Ti3C2悬浊液是将MoS2/Ti3C2粉末超声30min分散在DEPC水中配成1.5g/L的悬浊液；步骤(2)所述Au NPs溶液(A 520units/mL)中金纳米颗粒的直径为5nm。
优选地，所述MoS2/Ti3C2的制备方法为：
(A)将1.98g氟化锂(LiF)分散到30mL 6M的盐酸中，然后加入3.0g的Ti3AlC2粉末；在磁力搅拌下刻蚀3天；刻蚀完后，使用水、乙醇清洗，通过离心分离，重复5次；最后，将清洗干净的黑色粉末放于烘箱中，设置温度80℃，时间10小时；
(B)将0.4-0.8g的四水合钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)和1.0-1.8g的硫脲(SC(NH2)2) 分散到24mL的去离子水中，混合液超声30分钟；然后在混合液中加入30-50mg步骤(A) 制得的Ti3C2粉末，再超声30分钟；然后将混合液转移到50mL的聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在150-250℃下加热6-18小时；冷却至室温后，使用水、乙醇清洗，通过离心分离，重复5次；最后，将产物放于烘箱中，在80℃下，烘干10小时；最终得到的黑色粉末为 Ti3C2/MoS2纳米复合物。
上述基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器的检测方法，包括以下步骤：
Ⅰ.向检测电极滴加已知浓度的目标miRNA，37℃恒温杂交反应，在电化学工作站三电极系统中采用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，根据目标miRNA标准溶液的电流变化作标准曲线，建立各浓度梯度谱线；
Ⅱ.向检测电极滴加待检测的miRNA溶液，用步骤Ⅰ相同的条件在电化学工作站三电极系统中采用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，根据步骤Ⅰ所述浓度梯度谱线计算待测液中的miRNA浓度。
优选地，所述步骤Ⅰ中，恒温杂交反应后，检测电极用pH＝7.4的PBS缓冲液滴洗电极表面去除未吸附的目标miRNA。
优选地，差分脉冲伏安法的设定参数为：初始电位：-1V；终点电位：1V；电位增量：0.004V；振幅：0.05V；脉冲宽度：0.06s；脉冲周期：0.5s。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
(1)本发明所用电极修饰材料是通过水热法合成制备的，制造工艺清晰简单，易于操作且重复性好；
(2)本发明合成的MoS2呈花状垂直分布在片层状Ti3C2的层间和表面，边缘狭窄，比表面积增大，有效为吸附金纳米粒子提供更多位点；金纳米粒子的加入有效提高了电极的导电性能，并可通过Au-S键后续吸附更多末端修饰巯基的探针RNA，放大电化学信号，提高miRNA检测灵敏度。
附图说明
图1是按实施例1制备得到的Ti3C2的扫描电镜图。
图2是按实施例1制备得到的MoS2/Ti3C2的扫描电镜图。
图3是按实施例2得到的miRNA-182各浓度梯度谱线图。
具体实施方式
实施例1：
将1.98g氟化锂(LiF)分散到30mL 6M的盐酸中，然后加入3.000g的Ti3AlC2粉末。在磁力搅拌下刻蚀3天。刻蚀完后，使用水、乙醇清洗，通过离心分离，重复5次。最后，将清洗干净的黑色粉末放于烘箱中，设置温度80℃，时间10小时；制得Ti3C2形貌如图1所示；
将0.8g的四水合钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)和1.8g的硫脲(SC(NH2)2)分散到24mL的去离子水中，混合液超声30分钟。然后在混合液中加入50mg的Ti3C2粉末，再超声30分钟。然后将混合液转移到50mL的聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在200℃下加热10小时。冷却至室温后，使用水、乙醇清洗，通过离心分离，重复5次。最后，将产物放于烘箱中，在 80℃下，烘干10小时。最终得到的黑色粉末为Ti3C2/MoS2纳米复合物；形貌如图2所示；
制得的纳米复合材料中的MoS2呈花状垂直分布在片层状Ti3C2的层间和表面，其中MoS2纳米片的厚度为100纳米左右；原位生长的MoS2与Ti3C2层结合紧密，极大地增加了MoS2的比表面积。
实施例2：
将1.98g氟化锂(LiF)分散到30mL 6M的盐酸中，然后加入3.0g的Ti3AlC2粉末；在磁力搅拌下刻蚀3天；刻蚀完后，使用水、乙醇清洗，通过离心分离，重复5次；最后，将清洗干净的黑色粉末放于烘箱中，设置温度80℃，时间10小时；
将0.4g的四水合钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)和1.0g的硫脲(SC(NH2)2)分散到24mL的去离子水中，混合液超声30分钟。然后在混合液中加入30mg步骤(A)制得的Ti3C2粉末，再超声30分钟；然后将混合液转移到50mL的聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在150℃下加热18小时；冷却至室温后，使用水、乙醇清洗，通过离心分离，重复5次。最后，将产物放于烘箱中，在80℃下，烘干10小时。最终得到的黑色粉末为Ti3C2/MoS2纳米复合物。
实施例3：
将1.98g氟化锂(LiF)分散到30mL 6M的盐酸中，然后加入3.0g的Ti3AlC2粉末；在磁力搅拌下刻蚀3天；刻蚀完后，使用水、乙醇清洗，通过离心分离，重复5次；最后，将清洗干净的黑色粉末放于烘箱中，设置温度80℃，时间10小时；
将0.6g的四水合钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)和1.4g的硫脲(SC(NH2)2)分散到24mL的去离子水中，混合液超声30分钟。然后在混合液中加入40mg步骤(A)制得的Ti3C2粉末，再超声30分钟；然后将混合液转移到50mL的聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在250℃下加热6小时；冷却至室温后，使用水、乙醇清洗，通过离心分离，重复5次。最后，将产物放于烘箱中，在80℃下，烘干10小时。最终得到的黑色粉末为Ti3C2/MoS2纳米复合物。
实施例4：
基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)玻碳电极打磨处理；将玻碳电极在0.3微米的氧化铝浆中打磨至镜面，然后依次在丙酮、乙醇、去离子水中超声处理5min以去除表面残余的氧化铝颗粒；
(2)取10μL MoS2/Ti3C2悬浊液滴涂到玻碳电极表面，25℃条件下自然干燥1.5小时；
所述MoS2/Ti3C2悬浊液是将MoS2/Ti3C2粉末超声30min分散在焦碳酸二乙酯(DEPC)水中配成1.5g/L的悬浊液；
(3)取10μL Au NPs溶液(A 520units/mL)滴涂到MoS2/Ti3C2/GCE表面，25℃条件下自然干燥1.5小时；
所述Au NPs溶液中金纳米颗粒的直径为5nm；
(4)取10μL浓度为1nM的末端修饰有巯基的探针RNA固定缓冲液滴涂到Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE电极表面，25℃条件下自然干燥1.5小时，用PH＝7.4的PBS缓冲液滴洗电极表面去除未吸附的探针RNA；
所述的末端修饰有巯基的探针RNA的序列为：5’-SH-UUU UUA GUG UGA GUU CUACCA UUG CCA AA-3’；
(5)将所述Probe/Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE浸入2g/L的BSA封闭溶液中，封闭1小时；
(6)向步骤(5)中处理过电极滴加已知浓度的miRNA182，37℃恒温杂交反应30min，用PH＝7.4的PBS缓冲液滴洗电极表面去除未吸附的miRNA182，根据标准溶液的电流变化作标准曲线，建立各浓度梯度谱线，计算待测液中的miRNA浓度，如图3所示；得到浓度计算公式：y＝296.4+10.77log(x),(y：电化学信号，x：miRNA浓度)。
对未知浓度的miRNA-182的检测信号y为145μA，则可计算出其浓度x为8.76fM。
所述的miRNA182序列为：5’-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3’；
检测通过电化学工作站三电极系统实现，工作电极采用玻碳电极，辅助电极采用铂丝电极，参比电极采用Ag/AgCl电极，电解质溶液配方为含有2.5mM[Fe(CN)6]3-/4-、1M KCl的 PH＝4的PBS溶液；电化学反应条件如下：差分脉冲伏安法(DPV)，初始电位：-1V；终点电位：1V；电位增量：0.004V；振幅：0.05V；脉冲宽度：0.06s；脉冲周期：0.5s。
所述的miRNA传感器通过实施例4中步骤1-5构建成功，其中步骤(2)旨在扩大比表面积及电极/电解质的接触面积；步骤(3)旨在放大电化学信号并降低电极表面阻抗，此外，AuNPs提供Au原子与-SH修饰的ssRNA形成Au-S键；大量研究表明ssRNA中的磷酸骨架带负电，而氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-也带负电荷，电化学信号随着ssRNA的添加而降低。由于MoS2垂直生长在层状Ti3C2的表面上，边缘表面绝对暴露使Au-S键接近饱和，即Au-S 键的接枝密度很大。大的接枝密度导致临界干厚度减小，并且随着miRNA-182的添加，dsRNA 膜的干厚度超过临界干厚度。然后，发生溶胀诱导的Au-S键断裂并且dsRNA从电极表面释放。最后，ssRNA的量随着dsRNA的释放量(即miRNA-182的添加量)而减少，电化学信号随之增加。因此，成功建立了基于MoS2/Ti3C2纳米复合材料的电化学生物传感器。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器，其特征在于，所述miRNA传感器为：MoS2/Ti3C2、Au NPs、探针RNA依次沉积在玻碳电极上；
所述探针RNA末端修饰有巯基；
所述MoS2/Ti3C2的制备方法为：
(A)将1.98g氟化锂分散到30mL 6M的盐酸中，然后加入3.0g的Ti3AlC2粉末；在磁力搅拌下刻蚀3天；洗涤、离心、烘干，制得Ti3C2粉末；
(B)将0.4-0.8g的四水合钼酸铵和1.0-1.8g的硫脲分散到24mL的去离子水中，混合液超声30分钟；然后在混合液中加入30-50mg步骤(A)制得的Ti3C2粉末，再超声30分钟；然后将混合液转移到50mL的聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在150-250℃下加热6-18小时；洗涤、离心、烘干，制得MoS2/Ti3C2纳米复合物；
所述探针RNA的序列为：5’-SH-UUU UUA GUG UGA GUU CUA CCA UUG CCA AA-3’；所述的miRNA序列为：5’-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3’。
2.如权利要求1所述的基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取MoS2/Ti3C2悬浊液滴涂到玻碳电极表面，制得MoS2/Ti3C2/GCE；
(2)取Au NPs溶液滴涂到MoS2/Ti3C2/GCE表面，制得Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE；
(3)取末端修饰有巯基的探针RNA固定缓冲液滴涂到Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE电极表面，制得探针RNA/Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE；
(4)将所述探针RNA/Au NPs/MoS2/Ti3C2/GCE浸入2g/L的BSA封闭溶液中，封闭1小时。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述玻碳电极在使用前要进行打磨处理：将玻碳电极在0.3微米的氧化铝浆中打磨至镜面，然后依次在丙酮、乙醇、去离子水中超声处理5min以去除表面残余的氧化铝颗粒。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述MoS2/Ti3C2悬浊液是将MoS2/Ti3C2粉末超声30min分散在DEPC水中配成1.5g/L的悬浊液；步骤(2)所述Au NPs溶液中金纳米颗粒的直径为5nm。
5.如权利要求1所述的基于MoS2/Ti3C2的miRNA传感器的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
Ⅰ.向检测电极滴加已知浓度的目标miRNA，37℃恒温杂交反应，在电化学工作站三电极系统中采用差分脉冲伏安法进行检测，根据目标miRNA标准溶液的电流变化作标准曲线，建立各浓度梯度谱线；
Ⅱ.向检测电极滴加待检测的miRNA溶液，用步骤Ⅰ相同的条件在电化学工作站三电极系统中采用差分脉冲伏安法进行检测，根据步骤Ⅰ所述浓度梯度谱线计算待测液中的miRNA浓度。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤Ⅰ中，恒温杂交反应后，检测电极用pH＝7.4的PBS缓冲液滴洗电极表面去除未吸附的目标miRNA。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，差分脉冲伏安法的设定参数为：初始电位：-1V；终点电位：1V；电位增量：0.004V；振幅：0.05V；脉冲宽度：0.06s；脉冲周期：0.5s。
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