CN111272848B - 一种检测miRNA159c的高灵敏光电化学生物传感器及其制备和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测miRNA159c的高灵敏光电化学生物传感器及其制备和检测方法，该传感器是在FTO导电玻璃电极的表面固定有Ti3C2：CdS纳米复合材料作为光电材料，在纳米复合材料上通过硫‑镉键固定有可与目标miRNA159c链发生链杂交的DNA链。本发明光电化学传感器实现了对目标miRNA159c的特异性检测，且操作简单、灵敏度高、稳定性强。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种检测miRNA159c的高灵敏光电化学生物传感器及其制备和检测方法。
背景技术
微小RNA(MicroRNA，简写为miRNA)是在真核生物中发现的一种内源性非编码RNA，miRNA的表达与多种人类癌细胞的生长有关。据报道，大约有50％的带注释的miRNA位于基因组中与癌症相关的脆弱位点和基因组区域。乳腺癌(BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一。Andrew R Chin等在人血清中发现植物miRNA159c，其在血清中的丰度与乳腺癌的发生和发展呈负相关，并首次证明了植物miRNA可以影响BC细胞的生长(Andrew R Chin1,6,MirandaY Fong1,George Somlo2,Jun Wu3,Piotr Swiderski4,Xiwei Wu5,Shizhen Emily Wang1,Cross-kingdom inhibition of breast cancer growth by plant miR159,CellResearch 26(2016))。因此，高灵敏的检测人血清中miRNA159c的含量具有重要意义。
光电化学生物分析是一种新兴的生物分析技术，它是利用光在被分析物、光活性物质和电极之间的光诱导电子转移过程实现的。提高光电化学生物传感器灵敏度的途径，一方面是开发高光电效率材料，另一方面是使用信号传导或者放大模式。现有的光电材料或薄膜在实际应用的过程中仍存在诸多不足之处，例如光电转换效率不高、稳定性差、重复性不好等。这些问题直接极大的限制了光电化学传感器性能的进一步提升。所以，对新型光电材料的探索仍然是必需的。
就材料而言，Ti3C2由于其优异的性能已成为研究的热点。Ti3C2各种应用的成功实施很大程度上取决于其出色的电子传导性、丰富的裸露金属位点和众多亲水功能。Ti3C2具有高的光稳定性和吸收系数，因为它在可见光吸收方面具有合适的能隙，并且在许多电解质中都具有良好的稳定性，被认为是最有前途的光吸收材料之一。硫化镉(CdS)量子点在可见光范围内具有很好的光电特性，随着尺度的降低，更表现出不同于其块体和薄膜材料的光学、电学特性。CdS QDs的量子尺寸效应使得CdS的能级改变、能隙变宽。
本发明发现，将Ti3C2和CdS QDs放大结合作为一种新的光电材料，可以有效地抑制光生电子-空穴对的重组，并扩展了其光捕获能力，从而实现高的光电转换。基于其所构建的传感器具有很高的灵敏度和出色的稳定性，这表明新型PEC传感器在检测miRNA方面具有很大的可行性，有望在乳腺癌的临床监测中应用。目前，在光电化学研究中关于Ti3C2的报道还很少，基于Ti3C2：CdS纳米复合材料检测miRNA159c的光电化学生物传感器还尚无报道。
发明内容
为了解决上述现有技术所存在的不足之处，本发明提供了一种基于Ti3C2：CdS纳米复合材料检测miRNA159c的高灵敏度光电化学生物传感器，以期可以以高光电化学电流、高灵敏度、高稳定性的光电化学生物传感器实现对miRNA159c特异性的简单、迅速检测。
本发明为实现发明目的，采用如下技术方案：
本发明首先公开了一种检测miRNA159c的高灵敏光电化学生物传感器，其特点在于：所述光电化学生物传感器是在FTO导电玻璃电极的表面固定有Ti3C2：CdS纳米复合材料作为光电材料，在所述Ti3C2：CdS纳米复合材料上通过硫-镉键固定有可与目标miRNA159c链发生链杂交的DNA链；所述Ti3C2：CdS纳米复合材料是以Ti3C2纳米片为基体，在Ti3C2纳米片表面均匀负载有CdS量子点。
本发明通过所述高灵敏光电化学生物传感器检测miRNA159c的原理为：在所述光电化学生物传感器表面滴加待测miRNA159c样品并孵育，使DNA链与待测miRNA159c样品完全杂交；然后再滴加TMPyP作为光敏剂并孵育，以增强光电流，获得待测传感器电极；对所述待测传感器电极进行光电化学测试，获得待测miRNA159c样品的光电流强度，利用光电流强度与miRNA159c样品浓度的标准关系曲线，判断待测miRNA159c样品的浓度。
进一步地，所述DNA链序列为5'-SH-TGGAGCTCCCTTCAATCCAAT-3'。
进一步地，所述Ti3C2：CdS纳米复合材料是由Ti3C2纳米片和CdS量子点在去离子水中，通过超声反应，从而获得。
本发明所述高灵敏光电化学生物传感器的制备方法为：
步骤1、将FTO导电玻璃(0.5cm×0.9cm)依次用去离子水和乙醇超声清洗，然后在60℃条件下干燥过夜，获得干净的FTO导电玻璃电极；
步骤2、将5mg Ti3C2纳米片分散在5mL去离子水中，超声30分钟，再加入325μL的CdS量子点分散液，继续超声2～3小时，获得Ti3C2：CdS纳米复合材料的分散液；
步骤3、将30μL Ti3C2：CdS纳米复合材料的分散液均匀滴在干净的FTO导电玻璃电极表面，室温下静置干燥8～10小时，然后用离子水漂洗、N2吹干，再滴加5μL浓度为1×10- 6mol·L-1的壳聚糖的水溶液，室温干燥1小时，再用离子水漂洗、N2吹干，即完成纳米复合材料的固定；
步骤4、将30μL浓度为2×10-6mol·L-1的DNA溶液(通过TE缓冲溶液配置)滴加到电极表面，4℃下孵育12小时，然后用TE缓冲溶液轻轻冲洗、N2吹干，再滴加20～30μL巯基乙醇并4℃静置1小时，再次用TE缓冲溶液冲洗电极并N2吹干，即完成高灵敏光电化学生物传感器的制作。
进一步地，所述Ti3C2纳米片的制备方法为：将1.5g LiF和20mL 9M HCl溶液混合均匀，并反应至LiF完全溶解，然后加入0.5g Ti3AlC2，35℃反应24h；所得反应液依次通过去离子水和无水乙醇离心洗涤，向离心产物中添加100mL去离子水并超声1小时，然后再次离心，所得产物在60℃烘箱中干燥12小时，即获得Ti3C2纳米片；离心转速为5,000r·min-1。
进一步地，所述CdS量子点的制备方法为：将172μL 3-巯基丙酸添加到40mL20mol·L-1CdCl2溶液中，用NaOH调节至pH＝11，通氮气30分钟；然后加入40mL 20mmol·L-1硫代乙酰胺，加热至80℃，反应2小时；反应结束后室温冷却，添加无水乙醇沉降离心，即获得CdS量子点；将所得CdS量子点分散至8mL去离子水中，获得CdS量子点分散液。
本发明还公开了利用所述高灵敏光电化学生物传感器检测miRNA159c的方法，其特点在于：
将30μL待测miRNA159c样品滴加到传感器电极表面，在4℃下孵育105分钟，使DNA链与待测miRNA159c样品完全杂交；然后再滴加20μL浓度为20～25μmol·L-1的TMPyP水溶液，室温孵育3小时，获得待测传感器电极；
将所述待测传感器电极置于含0.1mol/L抗坏血酸的0.1mol·L-1、pH＝7.4的PBS缓冲溶液中进行光电化学测试，获得待测miRNA159c样品的光电流强度，利用光电流强度与miRNA159c样品浓度的标准关系曲线，判断待测miRNA159c样品的浓度。
进一步地，所述标准关系曲线是通过对以浓度分别1.0×10-13mol·L-1、1.0×10- 12mol·L-1、1.0×10-11mol·L-1、1.0×10-10mol·L-1、1.0×10-9mol·L-1、1.0×10-8mol·L-1、1.0×10-7mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1的miRNA159c标准样品所制备的待测传感器电极进行光电化学的测试，获得各浓度标准样品所对应的光电流强度，然后以miRNA159c标准样品的浓度的对数值为横坐标、以光电流强度为纵坐标进行拟合获得。
各浓度miRNA159c标准样品所对应的光电流强度如图1所示，标准关系曲线如图2所示，所得标准关系曲线为I＝0.98371gc+17.923，相关系数为R2＝0.9997。检测结果表明，当miRNA159c样品浓度在1.0×10-13mol·L-1-1.0×10-6mol·L-1浓度范围内，光电流强度随着miRNA159c样品浓度的增大而增大，与浓度成线性关系，检测限达到33fmol·L-1。
进一步地，所述光电化学测试，是以待测电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl为参比电极组成的三电极体系，电化学工作站配备有波长为200-1100nm的氙灯作为光源，无外加电压，并且每20秒执行一次明暗电流交错，用CHI660D型电化学工作站记录光电流情况。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明通过光电化学生物传感器实现了对目标miRNA159c的检测，该方法操作简单、灵敏度高、稳定性好。
2、本发明对目标miRNA159c的检测所需样品量少，检测成本低，没有大量的手动操作以及复杂的处理问题；
3、本发明基体纳米材料Ti3C2具有高的光稳定性和吸收系数，Ti3C2与CdS QDs复合使用制备光电化学生物传感器，具有高的光电转换，且稳定性好、生物相容性好。
附图说明
图1为不同浓度的miRNA159c标准样品的光电流响应，图中a～h各线条从下到上所对应浓度分别为1.0×10-13mol·L-1、1.0×10-12mol·L-1、1.0×10-11mol·L-1、1.0×10- 10mol·L-1、1.0×10-9mol·L-1、1.0×10-8mol·L-1、1.0×10-7mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1。
图2为本发明所获得的光电流强度与miRNA159c样品浓度的标准关系曲线。
图3为本发明所得Ti3C2纳米片的透射电子显微镜(TEM)表征结果。
图4为本发明所得Ti3C2：CdS纳米复合材料的透射电子显微镜(TEM)表征结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。以下内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
下述实施例所用Ti3C2纳米片的制备方法为：将1.5g LiF和20mL 9M HCl溶液混合均匀，并反应至LiF完全溶解，然后加入0.5g Ti3AlC2，35℃反应24h；所得反应液依次通过去离子水和无水乙醇离心洗涤，向离心产物中添加100mL去离子水并超声1小时，然后再次离心，所得产物在60℃烘箱中干燥12小时，即获得Ti3C2纳米片；
下述实施例所用CdS量子点的制备方法为：将172μL 3-巯基丙酸添加到40mL20mol·L-1CdCl2溶液中，用NaOH调节至pH＝11，通氮气30分钟；然后加入40mL 20mmol·L-1硫代乙酰胺，加热至80℃，反应2小时；反应结束后室温冷却，添加无水乙醇沉降离心，即获得CdS量子点；将所得CdS量子点分散至8mL去离子水中，获得CdS量子点分散液。
下述实施例所用可与目标miRNA159c链发生链杂交的DNA链序列为5'-SH-TGGAGCTCCCTTCAATCCAAT-3'，购买自上海生工生物工程有限公司。
下述实施例所用miRNA159c样品购买自上海生工生物工程有限公司。
实施例1
本实施例中检测miRNA159c的光电化学生物传感器的制备过程如下：
步骤1、将FTO导电玻璃依次用去离子水和乙醇超声清洗，然后在60℃条件下干燥过夜，获得干净的FTO导电玻璃电极(0.5cm×0.9cm)；
步骤2、将5mg Ti3C2纳米片分散在5mL去离子水中，超声30分钟，再加入325μL的CdS量子点分散液，继续超声2小时，获得Ti3C2：CdS纳米复合材料的分散液；
步骤3、将30μL Ti3C2：CdS纳米复合材料的分散液均匀滴在干净的FTO导电玻璃电极表面，室温下静置干燥8小时，然后用离子水漂洗、N2吹干，再滴加5μL浓度为1×10-6mol·L-1的壳聚糖的水溶液，室温干燥1小时，再用离子水漂洗、N2吹干，即完成纳米复合材料的固定；
步骤4、将30μL浓度为2×10-6mol·L-1的DNA溶液(通过TE缓冲溶液配置)滴加到电极表面，4℃下孵育12小时，然后用TE缓冲溶液轻轻冲洗、N2吹干，再滴加20μL巯基乙醇并4℃静置1小时，再次冲洗电极并N2吹干，即完成高灵敏光电化学生物传感器的制作。
利用上述高灵敏光电化学生物传感器检测miRNA159c的方法为：
将30μL待测miRNA159c样品滴加到传感器电极表面，在4℃下孵育105分钟，使DNA链与待测miRNA159c样品完全杂交；然后再滴加20μL浓度为20μmol·L-1的TMPyP水溶液，室温孵育3小时，获得待测传感器电极；
将待测传感器电极置于含0.1mol/L抗坏血酸的0.1mol·L-1、pH＝7.4的PBS缓冲溶液中进行光电化学测试，获得待测miRNA159c样品的光电流强度，利用光电流强度与miRNA159c样品浓度的标准关系曲线，判断待测miRNA159c样品的浓度。
为验证本实施例方法的准确性，选取已知浓度分别为1.0×10-13mol·L-1、1.0×10-12mol·L-1、1.0×10-11mol·L-1、1.0×10-10mol·L-1、1.0×10-9mol·L-1、1.0×10-8mol·L-1、1.0×10-7mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1的miRNA159c标准样品，利用本实施例的光电化学生物传感器按照上述方法分别进行检测，计算各个样品的浓度分别为1.10×10-13mol·L-1、1.08×10-12mol·L-1、0.98×10-11mol·L-1、1.21×10-10mol·L-1、0.96×10-9mol·L-1、1.01×10-8mol·L-1、0.97×10-7mol·L-1、1.01×10-6mol·L-1。从数据分析可以看出，所制备的光电化学生物传感器对目标miRNA159c具有操作简单、灵敏度高、稳定性强的特异性检测。
实施例2
本实施例传感器的制备过程同实施例1，区别仅在于步骤2中“再加入325μL的CdS量子点分散液，继续超声2小时”改为继续超声3小时。经测试，本实施例所得光电化学生物感器与实施例1所得光电化学生物传感器的形貌与性质类似，通过对相同miRNA159c样品的检测，得到与实施例1相似的检测结果。
实施例3
本实施例传感器的制备过程同实施例1，区别仅在于步骤3中“室温下静置干燥8小时“改为室温下静置干燥10小时。经测试，本实施例所得光电化学生物感器与实施例1所得光电化学生物传感器的形貌与性质类似，通过对相同miRNA159c样品的检测，得到与实施例1相似的检测结果。
实施例4
本实施例传感器的制备过程同实施例1，区别仅在于步骤4中“20μL巯基乙醇”改为30μL巯基乙醇。经测试，本实施例所得光电化学生物感器与实施例1所得光电化学生物传感器的形貌与性质类似，通过对相同miRNA159c样品的检测，得到与实施例1相似的检测结果。
实施例5
本实施例传感器的制备过程同实施例1，区别仅在于检测时所用TMPyP水溶液的浓度为25μmol·L-1。经测试，本实施例所得光电化学生物感器与实施例1所得光电化学生物传感器的形貌与性质类似，通过对相同miRNA159c样品的检测，得到与实施例1相似的检测结果。
Claims (8)
1.一种检测miRNA159c的高灵敏光电化学生物传感器，其特征在于：所述光电化学生物传感器是在FTO导电玻璃电极的表面固定有Ti3C2：CdS纳米复合材料作为光电材料，在所述Ti3C2：CdS纳米复合材料上通过硫-镉键固定有可与目标miRNA159c链发生链杂交的DNA链；
所述Ti3C2：CdS纳米复合材料是以Ti3C2纳米片为基体，在Ti3C2纳米片表面均匀负载有CdS量子点。
2.根据权利要求1所述的高灵敏光电化学生物传感器，其特征在于：在所述光电化学生物传感器表面滴加待测miRNA159c样品并孵育，使DNA链与待测miRNA159c样品完全杂交；然后再滴加TMPyP作为光敏剂并孵育，以增强光电流，获得待测传感器电极；
对所述待测传感器电极进行光电化学测试，获得待测miRNA159c样品的光电流强度，利用光电流强度与miRNA159c样品浓度的标准关系曲线，判断待测miRNA159c样品的浓度。
3.根据权利要求1所述的高灵敏光电化学生物传感器，其特征在于：所述DNA链序列为5'-SH-TGGAGCTCCCTTCAATCCAAT-3'。
4.根据权利要求1所述的高灵敏光电化学生物传感器，其特征在于：所述Ti3C2：CdS纳米复合材料是由Ti3C2纳米片和CdS量子点在去离子水中，通过超声反应，从而获得。
5.一种权利要求1～4中任意一项所述高灵敏光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将FTO导电玻璃依次用去离子水和乙醇超声清洗，然后在60℃条件下干燥过夜，获得干净的FTO导电玻璃电极；
步骤2、将5mg Ti3C2纳米片分散在5mL去离子水中，超声30分钟，再加入325μL的CdS量子点分散液，继续超声2～3小时，获得Ti3C2：CdS纳米复合材料的分散液；
步骤3、将30μL Ti3C2：CdS纳米复合材料的分散液均匀滴在干净的FTO导电玻璃电极表面，室温下静置干燥8～10小时，然后用离子水漂洗、N2吹干，再滴加5μL浓度为1×10-6mol·L-1的壳聚糖的水溶液，室温干燥1小时，再用离子水漂洗、N2吹干，即完成纳米复合材料的固定；
步骤4、将30μL浓度为2×10-6mol·L-1的DNA溶液滴加到电极表面，4℃下孵育12小时，然后用TE缓冲溶液冲洗、N2吹干；再滴加20～30μL巯基乙醇并4℃静置1小时，再次用TE缓冲溶液冲洗、N2吹干，即完成高灵敏光电化学生物传感器的制作。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
所述Ti3C2纳米片的制备方法为：将1.5g LiF和20mL 9M HCl溶液混合均匀，并反应至LiF完全溶解，然后加入0.5g Ti3AlC2，35℃反应24h；所得反应液依次通过去离子水和无水乙醇离心洗涤，向离心产物中添加100mL去离子水并超声1小时，然后再次离心，所得产物在60℃烘箱中干燥12小时，即获得Ti3C2纳米片；
所述CdS量子点的制备方法为：将172μL 3-巯基丙酸添加到40mL 20mol·L-1CdCl2溶液中，用NaOH调节至pH＝11，通氮气30分钟；然后加入40mL 20mmol·L-1硫代乙酰胺，加热至80℃，反应2小时；反应结束后室温冷却，添加无水乙醇沉降离心，即获得CdS量子点；将所得CdS量子点分散至8mL去离子水中，获得CdS量子点分散液。
7.一种利用权利要求1～4中任意一项所述高灵敏光电化学生物传感器检测miRNA159c的方法，其特征在于：
将30μL待测miRNA159c样品滴加到传感器电极表面，在4℃下孵育105分钟，使DNA链与待测miRNA159c样品完全杂交；然后再滴加20μL浓度为20～25μmol·L-1的TMPyP水溶液，室温孵育3小时，获得待测传感器电极；
将所述待测传感器电极进行光电化学测试，获得待测miRNA159c样品的光电流强度，利用光电流强度与miRNA159c样品浓度的标准关系曲线，判断待测miRNA159c样品的浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述标准关系曲线是通过对以浓度分别1.0×10-13mol·L-1、1.0×10-12mol·L-1、1.0×10-11mol·L-1、1.0×10-10mol·L-1、1.0×10-9mol·L-1、1.0×10-8mol·L-1、1.0×10-7mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1的miRNA159c标准样品所制备的待测传感器电极进行光电化学的测试，获得各浓度标准样品所对应的光电流强度，然后以miRNA159c标准样品的浓度的对数值为横坐标、以光电流强度为纵坐标进行拟合获得。
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