CN105241937B - 一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备，属于材料物理化学、光电化学、生化工程和传感器领域。首先采用热分解乙酸锌，在导电玻璃（ITO）表面覆盖一层ZnO种子，再利用水相法制备ZnO纳米花‑棒立体结构。首先将探针基因固定在ZnO电极上，加入目标基因孵化一段时间，得到杂交基因的ZnO花‑棒纳米工作电极，由此制得ZnO纳米花‑棒立体结构基光电化学生物传感器，并应用于检测无标记DNA（见附图）。在氙灯照射下，通过杂交前后光电流的变化定量检测无标记DNA。

Description

一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备

技术领域

本发明涉及ZnO花-棒立体结构的制备方法，属于材料物理化学领域。

本发明涉及光电化学、生化工程和传感器，特别涉及一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备和应用，属于分析化学领域。

背景技术

近年来，随着新型光电化学活性物质和新的检测方案的出现，光电化学分析已受到越来越多的关注。光电化学分析这个化学基础上发展起来的新学科，利用光直接对电极或者界面材料的影响，伴随着光能和化学能的转化，实现响应过程电化学信号的变化。

光电化学分析实现过程主要包括光电转化和电化学两个过程，在整个过程中不仅伴随着能量的转换，同时还伴随着电荷分离、电子传递、能量转移、界面反应等。在光电转换过程中，具有光电化学活性的物质吸收光子而处于激发态，并发生电荷分离和电荷传递，形成光电压或光电流，实现光能向电能的转化，这是光电化学的核心过程。电化学过程包括电子传递和界面反应两个过程。实现分离的电子和空穴可分别向基底电极表面和电极材料与电解质溶液界面转移，并在溶液界面处发生氧化还原反应，实现能量转换，产生电信号。

光电化学分析具有许多固有优点。首先，该方法使用光源能量低，电路简单，设备消耗较低。其次，由于激发光源和检测信号分开的，可以除去一些不理想的背景信号，检测背景小且灵敏度极高。近年来，光电化学生物传感器在DNA损伤、DNA杂交和免疫检测上应用迅速增强。

目前，相关研究主要集中于通过结合大量的功能纳米材料（如：ZnO、TiO₂、Cu₂O等），量子点（如CdS、CdSe等）、石墨烯等，增强光电化学生物传感器的能力。其中，ZnO是一种重要的多功能半导体材料，具有良好的光、电性能，在光电催化、太阳能电池、传感器、纳米发电机等方面具有广阔的应用前景。与TiO₂光腐蚀相比，ZnO具有相当丰富的形态学特性和稳定性。尽管TiO₂有与ZnO相似的带隙和带边界位置，但ZnO中典型的电子传输比TiO₂高10-100倍。目前，纳米 ZnO 的光电性能最引人关注， 可应用于压电纳米发电机、气体传感器、 光电探测器、光电二级管、压敏电阻、太阳能电池、光电催化降解，但对利用纳米 ZnO纳米材料检测DNA方面的研究至今还很少。

特定DNA和RNA序列的检测对于染色体组相关性和基因表达非常重要。在未来的疾病诊断、病理预测和疾病治疗中核酸序列的敏感性分析起着至关重要的角色。已报道的DNA传感器是在DNA杂交反应的基础上检测DNA。这些基于探针DNA和转换器的DNA生物传感器将检测过程转换成可测信号。对于核酸序列的检测，目前，主要采用复杂的荧光检测技术。然而，荧光方法中DNA上需要标记的有机分子如蒽醌或荧光染料来传递光电化学信号，有机标记过程复杂耗时，可能会导致很高的背景信号，抑制DNA杂交特异识别能力，消耗较高且检测设备昂贵。电化学系统减少了对于杂交误差和非杂交探针信号排斥的需要。DNA生物传感器还具有其他优势如电子读出、容易搭建、结合微阵列芯片中的应用等。

通过无标记的DNA光电化学检测技术，结合较好光学活性的ZnO花-棒纳米材料，可实现特定基因检测的高灵敏度和快捷方便，并有望推广应用于肿瘤的早期诊断及筛选抗肿瘤新药工作中，因而本发明具有巨大的潜在应用价值和深远的意义。

本发明目的是提供一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备，用于相关基因片段超高灵敏、高特异性检测。

发明内容

本发明提出的一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备，如下：

（1）将ITO导电玻璃，依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗，在ITO电极表面，形成ZnO花-棒立体结构；

（2）将探针基因固定在ZnO电极上，加入目标基因孵化一段时间，得到杂交基因的ZnO花-棒纳米工作电极；

（3）采用步骤（2）制备的ZnO花-棒纳米工作电极，并使用铂丝电极作为对电极，氯化银电极作为参比电极，电解液为PBS磷酸盐缓冲溶液进行光电化学检测。

所述ZnO花-棒立体结构的制备如下：依次采用清洁剂、去离子水、丙酮、乙醇等对ITO玻璃进行超声清洗，然后采用旋涂法，将3~8 nM乙酸锌乙醇溶液平铺在干燥的ITO上，300~400℃煅烧20~40min，自然冷却至室温，ITO表面形成种子层。再配制含有20~30mM硝酸锌，10~15mM六亚甲基四胺，5~10mM聚乙烯亚胺以及0.2~0.5M氨水的ZnO生长溶液。将上述负载有ZnO种子层的ITO浸入到生长溶液中，在80~90℃下反应3~5h，并在400~500℃下煅烧20~40min，最终制备得到ZnO花-棒结构。

所述用于检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备：1~4μM基因F-A与3~8 mM的基因Q-A溶液按照1:1的比例混合，用pH6.0 ~8.0 PBS缓冲液稀释至一定体积，混匀，水浴加热5~10min，室温下反应15~25min，得到探针基因A。将一定量的探针基因A滴入到1*1的ZnO花-棒立体结构纳米材料上，室温反应30~50min，得到固定有探针DNA的ZnO花-棒纳米材料，记作A-ZnO/ITO。继续在固定有探针DNA的ZnO电极上滴加一定浓度的目标基因T，室温反应40~60min，PBS缓冲溶液漂洗，得到杂交的DNA-ZnO/ITO。光电化学检测是采用CHI660D型电化学工作站以及三电极系统。所制备的ZnO/ITO电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，氯化银电极作为参比电极。电解液为pH7.0 PBS缓冲溶液。在氙灯照射下，检测其光电流变化。参数如下：光源波长范围200-770nm，输出电压0V。

ZnO花-棒立体结构具有更高的电流密度，较小的电荷传输电阻以及较高的光催化活性。利用ZnO花-棒立体结构在特定DNA探针和目标序列存在下有明显的光电流变化，可以实现DNA的灵敏特异性检测。在最佳条件下，该光电化学生物传感器的检测限达到0.5pM，且具有良好的选择性。

下面结合实施例对本发明进一步描述。

附图1是ZnO花-棒立体结构SEM检测图。

附图2是ZnO花-棒立体结构的XRD检测图。

附图3是ZnO花-棒立体结构纳米材料的傅里叶变换红外光谱(FTIR)表征图。

附图4是本发明的UV-DRS检测图。

附图5是本发明的电化学生物传感器的原理示意图。

附图6是不同比例探针/目标DNA杂交后ZnO花-棒立体结构光电流信号的变化。

本发明的光电化学生物传感器包括ZnO花-棒阵列，探针基因F-A，Q-A，目标基因T。首先将互补基因F-A，Q-A杂交合成双链探针基因A。在ZnO花-棒纳米材料上中滴加一定量的探针A，花-棒结构的ZnO中存在羟基，与探针基因A碱基中的磷酸基团共价结合固定在ZnO表面。继续向固定有探针的ZnO上加入互补单链DNA，探针与目标基因T杂交。ZnO是性能优良的光敏材料，具有花-棒结构的ZnO具有较高了电子的传输速率。当光照时， ZnO将光能转化成为可量的电信号并捕获其电信号。当探针基因存在时，探针DNA化学键合固定在ZnO表面，阻碍光电子的传递，导致光电流连续减小。当目标DNA与探针DNA杂交后，杂交形成双链DNA的ZnO纳米材料，获得增强的光电流。光电化学检测方法方便灵敏，通过明光电流信号的明显变化实现DNA的高灵敏度检测。参见附图4。

上述生物传感器的制备方法

1)ZnO花-棒立体结构的制备：依次采用清洁剂、去离子水、丙酮、乙醇等对ITO玻璃进行超声清洗，然后采用旋涂法，将5nM乙酸锌乙醇溶液平铺在干燥的ITO上，300~400℃煅烧20~40min，在ITO表面形成种子层。再配制含有20~30mM硝酸锌，10~15mM六亚甲基四胺，5~10mM聚乙烯亚胺以及0.2~0.5M氨水的ZnO花-棒结构生长液。将上述负载有ZnO种子层的ITO浸入到生长液中，在80~90℃下反应3~5h，并在400~500℃下煅烧20~40min，最终制备得到ZnO花-棒结构。

2）探针基因、靶标基因：探针基因F-A：5'-GTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTGTGTGCC6A66A6G6C6CC6CC6CAGCTTCATCAACTAGTTCGTCA-3'；探针基因Q-A:5’-AACTAGTTGATGAAGCTGGACATAATAGGCACACGACATAATAGGCACAC靶标基因T：AAAGGGAGCATCGGACATGACGAACTAATTGATGAAGCTG(上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；将探针基因和靶标基因分别溶于去离子水中制成100µM的探针溶液和100µM的靶标溶液。

3）基因F-A与基因Q-A溶液按照摩尔比例1:1混合，用pH7.0 PBS缓冲液稀释至一定体积，混匀，80~90℃水浴加热5min，室温下反应15~25min，得到探针基因A。将一定量的探针基因A滴入到1*1的ZnO花-棒立体结构纳米材料上，室温反应30~50min，得到固定有探针DNA的ZnO花-棒纳米材料，记作A-ZnO/ITO。以探针基因A与目标基因T比为1：1的摩尔比例继续向固定有探针DNA的ZnO电极上滴加一定浓度的目标基因T，室温反应40~60min，PBS缓冲溶液漂洗，得到杂交的DNA-ZnO/ITO。光电化学检测是采用CHI660D型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）以及三电极系统。所制备的ZnO/ITO电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，氯化银电极作为参比电极。电解液为PBS磷酸盐缓冲溶液。在氙灯照射下，检测其光电流变化。参数如下：光源波长范围200—770nm外加电压0V。通过以上方法即可得到所需的生物传感器。

Claims (6)

1.一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：

(1)将ITO导电玻璃，依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗，在ITO电极表面，形成ZnO花-棒立体结构；

(2)将探针基因固定在ZnO电极上，加入目标基因孵化一段时间，得到固化杂交基因的ZnO花-棒纳米工作电极；

(3)采用步骤(2)制备的ZnO花-棒纳米工作电极，并使用铂丝电极作为对电极，氯化银电极作为参比电极，电解液为PBS磷酸盐缓冲溶液进行光电化学检测；

所述ZnO花-棒立体结构制备为：用匀胶机将锌盐溶液均匀涂在ITO导电玻璃表面，形成一层膜，自然干燥，重复2～4次，将干燥后的ITO导电玻璃电极置于马弗炉中，300～400℃煅烧20～40min，取出，冷却至室温，放入含有硝酸锌、六次甲基四胺和聚乙烯亚胺生长液的反应釜中，80～90℃下保温3～5h，将生长之后的电极取出干燥，再将其置于马弗炉中，400～500℃下煅烧20～40min，最终制备得到ZnO花-棒立体结构。

2.根据权利要求1所述的一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述的锌盐溶液为3～8nM乙酸锌乙醇溶液；所述的硝酸锌、六次甲基四胺和聚乙烯亚胺生长液，是将20～30mM硝酸锌、10～15mM六亚甲基四胺，5～10mM聚乙烯亚胺以及0.2～0.5M氨水用100mL超纯水溶解制得。

3.根据权利要求或2所述的一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：

所述的杂交基因的ZnO花-棒纳米工作电极制备方法为：

将一定量的探针基因A滴入到ZnO花-棒立体结构上，室温反应30～50min，得到固定有探针DNA的ZnO花-棒纳米材料，记作A-ZnO/ITO，继续在固定有探针DNA的ZnO电极上滴加一定浓度的靶标基因T，室温反应40～60min，PBS缓冲溶液漂洗，得到杂交的DNA-ZnO/ITO。

4.根据权利要求3所述的一种检测DNA的ZnO基光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：

所述探针基因A是由1～4μM基因F-A与3～8mM的基因Q-A溶液按照摩尔比例1:1混合，用pH6.0～8.0PBS缓冲液稀释至一定体积，混匀，80～90℃水浴加热5～10min，室温下反应15～25min，制得到探针基因A；所述基因序列如下：探针基因F-A：

5'-GTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTGTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTCAGCTTCATCAACTAGTTCGTCA-3'；探针基因

Q-A:5’-AACTAGTTGATGAAGCTGGACATAATAGGCACACGACATAATAGGCACAC靶标基因T：AAAGGGAGCATCGGACATGACGAACTAATTGATGAAGCTG。

5.根据权利要求1-3、任一项所述制备方法所制备获得的ZnO基光电化学生物传感器在目标DNA的检测中的应用，其特征在于：

(1)采用的电化学工作站以三电极体系进行测试，氯化银电极作为参比电极，铂丝电极，所制备的杂交基因的ZnO花-棒纳米工作电极作为工作电极，浸入10～20mL，pH6～8PBS缓冲溶液中进行测试；

(2)用时间-电流方法进行目标DNA的检测，输出电压为0V，光照时间10s，间隔时间10s，光源为200-770nm的F300氙灯，检测光电流的强弱变化。

6.根据权利要求4所述制备方法所制备获得ZnO基光电化学生物传感器用于目标DNA的检测，其特征在于：

(2)用时间-电流方法进行目标DNA的检测，输出电压为0V，光照时间10s，间隔时间10s，光源为200-770nm的F300氙灯，检测光电流的强弱变化。