CN110849867A - 基于双发夹结构的电致发光传感器及其构建方法、用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于双发夹结构的电致发光传感器及其构建方法、用途，构建方法如下：S1将DNA链加热后冷却至室温；S2制备CdS:Mn QDs；S3制备CdS:Mn‑HP2信号探针；S4制备纳米金；S5获得纳米金‑HP3信号探针；S6打磨玻碳电极；S7用金纳米颗粒修饰玻碳电极；S8固载HP1；S9用巯基己醇封闭玻碳电极上的非特异性结合位点；S10孵育miRNA‑21和CdS:Mn‑HP2；S11孵育MUC1‑aptamer复合物和纳米金‑HP3；S12组装电致发光传感器；本发明能检测两种不同种类的生物标志物，且检出限低、检测线性范围广，电致发光传感器的稳定性和重现性良好，检测结果准确性高。

Description

基于双发夹结构的电致发光传感器及其构建方法、用途
技术领域
本发明属于电致发光传感器技术领域，特别是涉及一种基于双发夹结构的电致发光传感器及其构建方法、用途。
背景技术
DNA、miRNA、蛋白、酶以及相关代谢分子作为能够客观评价生物生长过程、病理过程的重要生物学标志物，对相关生物标志物实现高灵敏检测具有重要的理论意义及实际价值，目前大多数技术仅能实现对单一生物标志物的高灵敏检测，但由于生物活动过程的复杂性，对单一生物标志物的检测会限制人们对生物活动检测的效率以及准确性，且不同种类的生物标志物对生物活动过程的调控往往具有多样性，导致对同一种类的多种生物标志物的检测出现假阳性信号的可能性较高，因此研究一种可同时检测两种不同种类生物标志物的电致发光传感器具有重要意义。
电化学发光技术(ECL)通过对反应体系施加一定的电压引起电化学反应，使电极表面的发光物质生成不稳定的激发态，发光物质从激发态回到稳定的基态时以光的形式释放能量产生化学发光；电化学发光技术结合了发光分析和电化学分析技术的特点，能够同时检测发光强度和电流，具有灵敏度高、可控性强、检测范围宽、响应迅速等优点，电化学发光方法作为一种高效、灵敏的新型分析方法，满足对生物标志物高灵敏检测的现实需求，近年来电化学发光技术被广泛应用于生物标志物的检测中，为进一步提高电化学发光对生物标志物检测的灵敏性，将一些核酸分子放大方法应用到电化学发光生物传感器中。
核酸分子放大方法包括环介导等温放大策略、链置换策略、催化发夹自组装策略以及杂交链式反应策略，其中催化发夹自组装策略因不需要任何酶的参与就能实现线性目标物的循环放大，成为近几年广泛应用的经济又高效的信号放大技术之一。
催化发夹自组装策略的基本原理如下：首先根据目标物的序列信息设计HP1和HP2，当目标物存在时，HP1能够被目标物打开形成目标物-HP1的双链结构；双链结构中没有与目标物互补的部分可以与HP2上的支点结合，而由于HP1和HP2的作用力更强，可以形成HP1-HP2的双链DNA结构，此时目标物就会被置换下来变成游离的状态，进入到下一个打开HP1的过程，以此不断循环，实现对目标物的高灵敏检测；然而，由于HP1上往往只有一个发夹结构，其相应的也只能被一个目标物分子所打开，因此限制了催化发夹自组装技术在多目标物检测领域的应用。
现有技术中存在的主要问题是：1.单一生物标志物的检测会限制检测的效率和准确性，同一种类多种生物标志物的检测出现假阳性信号的可能性较高，因此在一定程度上限制了基于生物标志物实现病情检测的临床应用；2.在传统的催化发夹自组装策略中，HP1的单发夹结构限制了催化发夹自组装技术在多目标检测领域的应用。
因此亟需设计一种新颖的双发夹结构的DNA探针来克服现有催化发夹自组装技术不能实现多目标物检测的问题，同时通过引入两种目标物作为催化发夹自组装过程的催化核酸分子，实现了对两种不同种类生物标志物的高灵敏检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于双发夹结构的电致发光传感器构建方法，通过在HP1上催化两种发夹结构自组装过程，实现同时对两种不同种类生物标志物的高灵敏检测，提高了生物标志物的检测效率。
本发明的目的还在于提供一种基于双发夹结构的电致发光传感器，能够检测两种不同种类的生物标志物，且检测限低，线性范围更广。
本发明的目的还在于提供一种基于双发夹结构的电致发光传感器的用途，以实现对不同种类生物标志物的高灵敏检测，通过对生物活动中两种不同种类生物标志物进行检测，能更为准确的判断生物的活动进程，检测效率更高，应用范围更广。
本发明所采用的技术方案是，基于双发夹结构的电致发光传感器构建方法，包括以下步骤：
S1，将HP1、HP2、HP3和aptamer探针的DNA链加热至95℃保持5min，然后自然冷却至室温；
S2，将四水合硝酸镉和四水合乙酸锰溶解于超纯水中，搅拌、加热至70℃后加入九水合硫化钠，将混合溶液置于70℃下回流3h获得反应物，使用乙醇和超纯水依次离心洗涤反应物，得到CdS:Mn QDs；
S3，将500μL CdS:Mn QDs与10μL摩尔浓度为2mmol/L的三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐溶液混合后，在混合液中缓慢加入HP2，得到CdS:Mn-HP2信号探针，其中三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐与HP2的物质的量之比为100：1；
S4，在搅拌过程中将0.6mL摩尔浓度为0.1mol/L的硼氢化钠加入20mL摩尔浓度0.25mmol/L的氯金酸溶液中，待溶液变为橘红色即获得纳米金；
S5，在500μL纳米金中依次加入50μL摩尔浓度为2μmol/L的HP3和5μL摩尔浓度为0.1mol/L的巯基己醇溶液，将混合溶液置于4℃下反应2h，得到纳米金-HP3信号探针；
S6，分别使用粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝抛光粉依次打磨玻碳电极2min，每次打磨结束后使用二次蒸馏水冲洗玻碳电极，将经打磨的玻碳电极依次在硝酸溶液、无水乙醇和去离子水中超声波处理2min，得到干净的玻碳电极；
S7，将干燥的玻碳电极浸泡于2mL质量百分数为1％的氯金酸溶液中，在-0.2V的恒电位下电沉积30s获得纳米金颗粒修饰的玻碳电极-AuNPs/GCE；
S8，在AuNPs/GCE表面滴涂10μL摩尔浓度为1μmol/L的HP1孵育12h；
S9，在固载HP1的AuNPs/GCE表面修饰10μL摩尔浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液；
S10，在巯基己醇溶液修饰的玻碳电极表面滴加10μL miRNA-21和10μL CdS:Mn-HP2的混合溶液孵育70min；
S11，在电极表面滴加10μL MUC1-aptamer复合物和10μL纳米金-HP3的混合溶液孵育90min得到工作电极；
S12，将工作电极、对电极铂丝、参比电极银/氯化银电极和电解质溶液组装成电致发光传感器，电解质溶液为摩尔浓度0.1mol/L、pH＝8.0的磷酸缓冲溶液，电解质溶液中含有摩尔浓度为0.05mol/L的过硫酸钾。
进一步的，所述HP1选自以下序列：SH-TTT TTC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TACCAT GTG TAG ATA GCT TAT CAG ACT TCA GCT GGA TAC CCT GGC CAC ACG AGT ATC CAGCTG A，HP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述HP2选自以下序列：SH-TTT TTT AAG CTA TCT ACA CAT GGT AGC TTA TCAGAC TCC ATG TGT AGA，HP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述HP3选自以下序列：TCA GCT GGA TAC TCG TGT GGC CAG GGT ATC CCA CGAGTA TCC TTT TT-SH，HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述aptamer探针的序列如下：TCG TGT GGC CAG GGT ATC CAG CTG AGC AGT TGATCC TTT GGA TAC CCT GG，aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述步骤2中九水合硫化钠与四水合硝酸镉的质量比为3.64：1，CdS:MnQDs中Mn2+的掺杂浓度为0.0547mmol/L。
基于双发夹结构的电致发光传感器对miRNE-21的检出限为10.8amol/L，线性范围为20amol/L～50pmol/L，miRNA-21的摩尔浓度cmiRNA-21与电致发光强度I的线性方程为I＝1055.86lgcmiRNA-21+7685.79，R2＝0.996；
所述电致发光传感器对MUC1的检出限为0.40fg/mL，线性范围为1fg/mL～10ng/mL，MUC1的质量浓度cMUC1与电致发光强度I的线性方程为I＝2523.09–995.70lgcMUC1，R2＝0.998。
基于双发夹结构的电致发光传感器在检测生物标志物miRNA-21和MUC1方面的用途。
本发明的有益效果是：1、本发明通过引入两种生物标志物作为催化发夹自组装过程的催化核酸分子，实现对两种不同种生物标志物miRNA-21和MUC1的高灵敏检测，检测效率更高；2、使用本发明对生物活动中的两种标志物进行检测，能更为转却、高效的判断生物活动的进程，应用范围广、实际应用价值高；3、本发明对生物标志物miRNA-21和MUC1具有较宽的线性响应范围和较低的检出限；4、本发明的检测结果之间相对标准偏差较小，具有良好的稳定性和重现性，检测结果准确性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例的工作流程图。
图2：A是CdS:Mn QDs的透射电子显微镜图像，B是纳米金的透射电子显微镜图像，C是纳米金的粒径分布图像，D是CdS:Mn QDs与纳米金之间能量共振转移图像。
图3：A是催化双发夹自组装过程的第一个循环过程的凝胶电泳表征图像，B是催化双发夹自组装过程的第二个循环过程的凝胶电泳表征图像。
图4：A是电致发光传感器构建过程的电化学表征图像，B是电致发光传感器工作的电化学发光表征图像。
图5：A是电致发光传感器对不同浓度的miRNA-21检测的电化学发光信号趋势图像，B是电致发光传感器对不同浓度的miRNA-21检测的电化学发光信号与其浓度对数值之间的线性关系曲线，C是电致发光传感器对不同浓度的MUC1检测的电化学发光信号趋势图像，D是电致发光传感器对不同浓度的MUC1检测的电化学发光信号与其浓度对数值之间的线性关系曲线。
图6：A是miRNA-141、miRNA-155和miRNA-182-5P对miRNA-21检测的影响曲线图，B是甲胎蛋白、癌胚抗原和慢肌肌钙蛋白对MUC1检测的影响曲线图。
图7：A是电致发光传感器用于miRNA-21以及MUC1检测的稳定性图像，B是电致发光传感器对miRNA-21进行六次平行实验的响应信号图像。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
基于双发夹结构的电致发光传感器构建方法，具体包括以下步骤：
S1，将HP1、HP2、HP3和aptamer探针的DNA链加热至95℃保持5min，然后自然冷却至室温，使DNA链形成稳定的发夹结构，HP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，HP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，aptamer的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
S2，将四水合硝酸镉和四水合乙酸锰溶解于超纯水中，搅拌、加热至70℃后加入九水合硫化钠形成混合液，将混合液置于70℃下回流3h得到反应液，使用乙醇和超纯水依次离心洗涤反应液得到CdS:Mn QDs；
九水合硫化钠与四水合硝酸镉的质量比为3.64：1，Mn2+作为掺杂物质，通过掺杂到CdS:Mn QDs的禁带间引入中间能级进行光响应，CdS:Mn QDs中Mn2+的掺杂浓度为0.0547mmol/L；
S3，将500μL CdS:Mn QDs与10μL摩尔浓度为2mmol/L的三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐溶液混合后，在混合液中缓慢加入HP2，得到CdS:Mn-HP2信号探针，其中三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐用于打开HP2的DNA链上所修饰巯基的二硫键，三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐与HP2的物质的量之比为100：1；
S4，在搅拌过程中将0.6mL摩尔浓度为0.1mol/L的硼氢化钠加入20mL摩尔浓度0.25mmol/L的氯金酸溶液中，溶液混合后变成橘红色即为纳米金；
在纳米金的制备过程中硼氢化钠作为还原剂还原氯金酸得到纳米金颗粒，硼氢化钠的用量过少不能将金完全还原，硼氢化钠用量过多则会造成还原剂的浪费；
S5，在500μL纳米金中依次加入50μL摩尔浓度为2μmol/L的HP3和5μL摩尔浓度为0.1mol/L的巯基己醇溶液，将混合溶液置于4℃下反应2h，得到纳米金-HP3信号探针；
S6，分别使用粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝抛光粉依次打磨玻碳电极2min，每次打磨结束后使用二次蒸馏水冲洗玻碳电极GCE，将经打磨的玻碳电极依次在硝酸溶液、无水乙醇和去离子水中超声波处理2min，得到干净的玻碳电极；
S7，将干燥的玻碳电极浸泡于2mL质量百分数为1％的氯金酸溶液中，在-0.2V的恒电位下电沉积30s获得纳米金颗粒修饰的玻碳电极-AuNPs/GCE；
S8，在AuNPs/GCE表面滴涂10μL摩尔浓度为1μmol/L的HP1孵育12h，使HP1通过Au-S键固载在AuNPs/GCE表面；
S9，在固载HP1的AuNPs/GCE表面修饰10μL摩尔浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液，以封闭AuNPs/GCE表面的非特异性结合位点；
S10，在巯基己醇溶液修饰的玻碳电极表面滴加10μL miRNA-21和10μL CdS:Mn-HP2的混合溶液孵育70min；
S11，在电极表面滴加10μL MUC1-aptamer复合物和10μL纳米金-HP3的混合溶液孵育90min得到工作电极；
S12，将工作电极、对电极铂丝、参比电极银/氯化银电极和电解质溶液组装成电致发光传感器，电解质溶液为摩尔浓度0.1mol/L、pH＝8.0的磷酸缓冲溶液，电解质溶液中含有摩尔浓度为0.05mol/L的过硫酸钾，电致发光传感器的扫描电位为-1.6V～0.2V、扫描速率为0.1V/s、光电倍增管高压为800V。
参照图1，本发明实施例在固载有HP1的玻碳电极表面修饰CdS:Mn-HP2和待检测miRNA-21的混合溶液，在电致发光传感器工作过程中待检测的miRNA-21能够打开玻碳电极上的HP1探针，然后CdS:Mn-HP2通过链置换反应将miRNA-21置换下来，每当一个miRNA-21被置换下来就有一个CdS:Mn-HP2探针被结合到HP1上，被置换下来的miRNA-21继续参与循环将发光物质CdS:Mn QDs固载到电极表面，通过检测CdS:Mn QDs的发光强弱即可获得miRNA-21的含量；miRNA-21可以循环参与到工作过程中，使根据发光强弱检测得到的miRNA-21含量不准确，为解决上述问题本发明实施例通过合理设置孵育在玻碳电极表面的miRNA-21和CdS:Mn-HP2探针的该体积比和孵育时间，使待检测的miRNA-21均能参与循环，且循环次数为1，使最终根据发光强度得到的miRNA-21含量更加准确。
本发明实施例在上述修饰电极上继续修饰MUC1-aptamer复合物和AuNPs-HP3的混合溶液，在检测过程中目标蛋白MUC1存在时，aptamer发夹结构被MUC1打开形成一个MUC1-aptamer复合物，同时aptamer暴露出一段DNA序列，这段暴露的DNA序列可以打开HP1探针，然后AuNPs-HP3通过链置换反应将MUC1-aptamer置换下来，被置换下来的MUC1-aptamer继续参与循环，最终使得AuNPs被固载到电极表面，由于AuNPs能够淬灭CdS:Mn QDs的发光，使得CdS:Mn QDs发光强度减弱，最后根据发光信号强度的下降量获得MUC1的量；本发明实施例通过合理设置MUC1-aptamer复合物和AuNPs-HP3的体积比和孵育时间，使待检测的MUC1-aptamer复合物均能参与一次上述循环，根据发光强度下降量即可获得待检测MUC1的准确含量。
本发明实施例所用探针的核苷酸序列如表1所示：
表1 本发明实施例所用核苷酸序列
MiRNA-21的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，MiRNA-141的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，MiRNA-155的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，MiRNA-182-5p所示的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明实施例制备的电致发光传感器能够检测miRNA-21和MUC1的混合物，由于检测MUC1蛋白是在淬灭检测miRNA-21的发光强度的基础上进行的，所以在检测混合物时要先检测miRNA-21的含量后检测MUC1的含量，并且要保证检测miRNA-21的发光强度要达到最强，即就是miRNA-21的检测浓度为线性范围的上限值50pmol/L，若miRNA-21的摩尔浓度偏大则需要稀释混合溶液，若是miRNA-21的摩尔浓度偏小，则需要富集混合液中miRNA-21的摩尔浓度为50pmol/L。
一、材料表征
使用透射电子显微镜对制备的CdS:Mn QDs和纳米金的形态进行表征，检测结果如图2A和图2B所示，CdS:Mn QDs和纳米金均呈现球状，CdS:Mn QDs的粒径约为5nm，纳米金的粒径分布如图2C所示，主要分布在2.63～6.73nm之间，平均粒径为4.79nm；使用紫外吸收光谱和电化学发光光谱研究CdS:Mn QDs和纳米金的能量转移行为，研究结果如图2D所示，纳米金在波长570nm处出现最大吸收峰，CdS:Mn QDs的最大发射波长为590nm，CdS:Mn QDs的发光光谱与纳米金的吸收光谱有较大的光谱重叠区，说明CdS:Mn QDs与纳米金之间具有发生能量转移的潜力。
二、凝胶电泳表征
通过凝胶电泳分析验证两个催化发夹自组装过程是否成功执行，如图3A所示，HP1、HP2、aptamer和HP3在泳道1～4的不同位置分别显示出条带，当把HP1、HP2、aptamer和HP3混合后在泳道5中没有观察到新的条带产生，说明这四种发夹探针不会自发进行杂交，将HP1、HP2和miRNA-21在常温下反应30min后，在泳道6中观察到有新的条带产生，将HP1和HP2共退火后在泳道7中生成新的条带，泳道7中的条带与泳道6中的条带位置一致，说明在miRNA-21的作用下，HP1和HP2能形成HP1-HP2复合物。
参照图3B其中泳道a是HP1和HP2共退火的电泳结果，泳道b是HP1和aptamer共退火的电泳结果，泳道c是HP1和HP3共退火的电泳结果，泳道d是HP1、HP2和aptamer共退火的电泳结果，泳道e是HP1、HP2和HP3共退火的电泳结果，通过对比泳道a、b、d的条带位置可知，在泳道d顶部形成新的条带，即形成了HP1-HP2-aptamer三元复合物，通过对比泳道a、c、e的条带位置可知，在泳道e顶部形成新的条带，即形成了HP1-HP2-HP3三元复合物。
凝胶电泳表征结果证明两个催化发夹自组装过程的构建与DNA设计相吻合，该催化发夹自组装过程是成功的。
三、电化学表征
在含有5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的磷酸缓冲溶液中，采用电化学阻抗谱法表征工作电极的修饰过程，电压设置为220mV、频率设置为10-2～10-6Hz，电化学阻抗曲线中，电子转移阻抗Ret用于描述工作电极界面性质，Ret值的大小与EIS曲线中圆弧直径大小相一致，如图4A所示，裸露玻碳电极具有极低的阻抗值约为252Ω如曲线a1所示；纳米金修饰玻碳电极后玻碳电极的阻抗值减小到111Ω如曲线b1所示，这是由于纳米金增加了玻碳电极的比表面积且能够促进电子传递；将HP1固载到玻碳电极上后，由于HP1中带负电的磷酸骨架会阻碍电子传递，使得玻碳电极的阻抗值增加到708Ω如曲线c1所示；在玻碳电极表面修饰miRNA-21和CdS:Mn-HP2混合溶液后，由于HP2及固载的CdS:Mn QDs均会阻碍电子传递，使玻碳电极的阻抗增加到1636Ω如曲线d1所示；在玻碳电极上修饰MUC1-aptamer复合物和纳米金-HP3溶液后，带负电的HP3阻碍了电子传递，使玻碳电极的电阻值增加到3001Ω如曲线e1所示，基于上述修饰过程中玻碳电极的电阻值变化，可以证明本发明实施例的电致发光传感器制备成功，根据电致发光传感器的发光强度检测相应生物标志物的量是可行的。
在含有过硫酸钾的2mL磷酸缓冲液中检验本发明实施例的两个催化发夹自组装过程能否实现双目标物的检测，其中过硫酸钾的摩尔浓度为0.05mol/L，磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.1mol/L、pH＝8.0，参照图4B当玻碳电极上孵育有HP1时，电致发光传感器几乎没有电致发光信号如曲线a2所示，当玻碳电极上孵育miRNA-21和CdS:Mn-HP2混合溶液后，由于第一个催化发夹自组装过程的完成，导致大量发光材料CdS:Mn QDs固载在玻碳电极上，电致发光传感器具有较高的电致发光信号如曲线b2所示，当MUC1-aptamer复合物和纳米金-HP3溶液孵育到玻碳电极上后，第二个催化发夹自组装过程完成，大量的纳米金固载在玻碳电极上，纳米金与CdS:Mn QDs的距离较近时，CdS:Mn QDs的发光被纳米金淬灭，导致电致发光传感器的电致发光信号下降如曲线c2所示；电致发光信号的变化过程证明本发明实施例的两个催化发夹自组装过程能检测双目标物。
四、使用电致发光传感器检测目标物miRNA-21和MUC1
根据本发明实施例的步骤制备电致发光传感器，使用该电致发光传感器对目标物miRNA-21和MUC1进行定量分析，检测分析过程中电致发光信号的变化情况。
试验1：检测目标物miRNA-21的摩尔浓度从20amol/L增加到50pmol/L时电致发光传感器的电致发光信号变化情况，如图5A所示，电致发光传感器的发光信号强度随miRNA-21摩尔浓度的增加呈递增趋势如曲线a3～h3，且电致发光信号的强度与miRNA-21摩尔浓度的对数有极强的相关性如图5B所示，线性方程为I＝1055.86lgcmiRNA-21+7685.79，R2＝0.996，其中I为电致发光信号强度，cmiRNA-21为待检测miRNA-21的摩尔浓度，miRNA-21的检出限为10.80amol/L(S/N＝3)。
试验2：检测目标物MUC1的质量浓度从1fg/mL变化到10ng/mL时，电致发光传感器的电致发光信号变化情况，如图5C所示，电致发光传感器的发光信号强度随MUC1孵育浓度的增加呈递减趋势如曲线a4～h4所示，电致发光强度与MUC1孵育浓度的对数呈线性相关，线性相关曲线如图5D所示，相关方程为I＝2523.09–995.70lgcMUC1，R2＝0.998，I为电致发光信号强度，cMUC1为待检测MUC1的质量浓度，MUC1的检出限为0.40fg/mL。
将本发明实施例电致发光传感器对目标物miRNA-21、MUC1的检出限与现有技术的检出限进行比较，比较结果如表2所示，本发明实施例具有较宽的线性响应范围和较低的检出限。
表2 与其他检测miRNA-21和MUC1的工作比较
Figure BDA0002306536270000101
表2中电化学发光1构建了一个双向的DNA步行机器，由两个不同的miRNAs诱导DNA步行机器前后运动，结合能量转移构建ECL生物传感器；电化学发光2通过结合距离调控的ECL淬灭/增强效应及DNA分子齿轮能动性实现使用一种ECL试剂灵敏检测多种miRNA；电化学反应3通过将Ru(bpy)2(mcpbpy)2+固定在Zr6团簇上合成介孔发光性能化金属-有机骨架(Ru-PCN-777)，基于邻近诱导的分子内DNA链置换利用Ru-PCN-777构建ECL免疫传感器；电化学发光4是利用蛋白-适配体结合物驱动的三维DNA纳米机器信号探针构建的ECL生物传感器。
五、电致发光传感器的特异性试验
特异性是衡量电致发光传感器的一个重要参数，根据本发明的步骤制备电致发光传感器，对两个检测目标物分别选择了三种干扰物质代替目标物进行实验，根据检测过程中所产生的电致发光信号强度变化情况，对电致发光传感器的特异性进行评价。
配置摩尔浓度均为500pmol/L的miRNA-141、miRNA-155和miRNA-182-5p溶液，配置摩尔浓度为50pmol/L的miRNA-21溶液和不含蛋白的空白对照溶液，分别使用各溶液孵育玻碳电极，进而组装成电致发光传感器，各电致发光传感器工作时的电致发光信号强度如图6A所示，空白对照组的电致发光信号强度与单独孵育miRNA-141、miRNA-155或miRNA-182-5p时电致发光传感器的发光信号强度相差不大，孵育了miRNA-21的电致发光传感器的发光信号强度大幅度增加，且值与孵育了各溶液混合溶液的电致发光传感器的发光信号强度相近，说明本发明实施例制备的电致发光传感器对miRNA-21检测具有良好的选择性，其他干扰物质的存在不会影响miRNA-21检测结果的准确性。
配置质量浓度为100ng/mL的甲胎蛋白、癌胚抗原、慢肌肌钙蛋白溶液，质量浓度为1ng/mL的MUC1溶液，不含蛋白的空白对照溶液和各溶液的混合溶液，使用各溶液孵育玻碳电极，进而组装成电致发光传感器，利用制备的电致发光传感器检测MUC1蛋白，统计实验各组电致发光信号的强度如图6B所示，空白对照组和甲胎蛋白、癌胚抗原、慢肌肌钙蛋白组电致发光强度都很高且数值相近，MUC1组和待测溶液的混合实验组电致发光信号强度大幅度降低，这两组的数据接近，说明电致发光传感器对MUC1蛋白具有良好的选择性，其他干扰物质的存在不会影响MUC1蛋白检测结果的准确性。
六、电致发光传感器的稳定性与重现性
使用本发明实施例制备的电致发光传感器分别检测摩尔浓度为20amol/L、5fmol/L、500fmol/L的miRNA-21，连续扫描三圈，如图7A曲线a～c所示各检测结果之间的相对标准偏差为5.22％、3.57％和0.77％；使用本发明实施例制备的电致发光传感器分别检测质量浓度为1pg/mL、100pg/mL、10ng/mL的MUC1蛋白，连续扫描三圈，如图7A曲线d～f所示各检测结果之间的相对标准偏差为2.96％、3.07％和1.77％，说明电致发光传感器具有很好的稳定性。
使用本发明实施例制备的电致发光传感器孵育摩尔浓度为50amol/L的miRNA-21，进行六次平行试验检测电致发光信号的强度，检测结果如图7B所示，各组实验检测结果之间的相对标准差为4.10％，说明本发明电致发光传感器具有良好的重现性。
七、电致发光传感器的实际应用
为进一步研究电致发光传感器的实际应用价值，通过标准加入法检查电致发光传感器的回收率，利用稀释了50倍的血清溶液配置不同浓度miRNA-21和MUC1蛋白的样品溶液，用电致发光传感器检测不同样品溶液的电致发光信号强度，然后根据标准曲线计算出各样品溶液的检测浓度，检测浓度与样品初始溶度的比值即为回收率，检测结果如表3所示，各检测组的回收率均介于95.50％～104.96％之间，相对标准偏差为1.41～4.06，说明电致发光传感器对miRNA-21和MUC1的检测具有很好的准确度。
表3 生物传感器在血清样品中的应用
Figure BDA0002306536270000121
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北师范大学
<120> 基于双发夹结构的电致发光传感器及其构建方法、用途
<130> 2019.12.5
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
tttttcaaca tcagtctgat aagctaccat gtgtagatag cttatcagac ttcagctgga 60
taccctggcc acacgagtat ccagctga 88
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
ttttttaagc tatctacaca tggtagctta tcagactcca tgtgtaga 48
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tcgtgtggcc agggtatcca gctgagcagt tgatcctttg gataccctgg 50
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
tcagctggat actcgtgtgg ccagggtatc ccacgagtat ccttttt 47
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 8
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24

Claims (5)

1.基于双发夹结构的电致发光传感器构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将HP1、HP2、HP3和aptamer探针的DNA链加热至95℃保持5min，然后自然冷却至室温；
S2，将四水合硝酸镉和四水合乙酸锰溶解于超纯水中，搅拌、加热至70℃后加入九水合硫化钠，将混合溶液置于70℃下回流3h获得反应物，使用乙醇和超纯水依次离心洗涤反应物，得到CdS:Mn QDs；
S3，将500μL CdS:Mn QDs与10μL摩尔浓度为2mmol/L的三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐溶液混合后，在混合液中缓慢加入HP2，得到CdS:Mn-HP2信号探针，其中三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐与HP2的物质的量之比为100：1；
S4，在搅拌过程中将0.6mL摩尔浓度为0.1mol/L的硼氢化钠加入20mL摩尔浓度0.25mmol/L的氯金酸溶液中，待溶液变为橘红色即获得纳米金；
S5，在500μL纳米金中依次加入50μL摩尔浓度为2μmol/L的HP3和5μL摩尔浓度为0.1mol/L的巯基己醇溶液，将混合溶液置于4℃下反应2h，得到纳米金-HP3信号探针；
S6，分别使用粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝抛光粉依次打磨玻碳电极2min，每次打磨结束后使用二次蒸馏水冲洗玻碳电极，将经打磨的玻碳电极依次在硝酸溶液、无水乙醇和去离子水中超声波处理2min，得到干净的玻碳电极；
S7，将干燥的玻碳电极浸泡于2mL质量百分数为1％的氯金酸溶液中，在-0.2V的恒电位下电沉积30s获得纳米金颗粒修饰的玻碳电极-AuNPs/GCE；
S8，在AuNPs/GCE表面滴涂10μL摩尔浓度为1μmol/L的HP1孵育12h；
S9，在固载HP1的AuNPs/GCE表面修饰10μL摩尔浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液；
S10，在巯基己醇溶液修饰的玻碳电极表面滴加10μL miRNA-21和10μL CdS:Mn-HP2的混合溶液孵育70min；
S11，在电极表面滴加10μL MUC1-aptamer复合物和10μL纳米金-HP3的混合溶液孵育90min得到工作电极；
S12，将工作电极、对电极铂丝、参比电极银/氯化银电极和电解质溶液组装成电致发光传感器，电解质溶液为摩尔浓度0.1mol/L、pH＝8.0的磷酸缓冲溶液，电解质溶液中含有摩尔浓度为0.05mol/L的过硫酸钾。
2.根据权利要求1所述的基于双发夹结构的电致发光传感器构建方法，其特征在于，所述HP1选自以下序列：SH-TTT TTC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TAC CAT GTG TAG ATA GCTTAT CAG ACT TCA GCT GGA TAC CCT GGC CAC ACG AGT ATC CAG CTG A，HP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述HP2选自以下序列：SH-TTT TTT AAG CTA TCT ACA CAT GGT AGC TTA TCA GACTCC ATG TGT AGA，HP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述HP3选自以下序列：TCA GCT GGA TAC TCG TGT GGC CAG GGT ATC CCA CGA GTATCC TTT TT-SH，HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述aptamer探针的序列如下：TCG TGT GGC CAG GGT ATC CAG CTG AGC AGT TGA TCCTTT GGA TAC CCT GG，aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的基于双发夹结构的电致发光传感器构建方法，其特征在于，所述步骤2中九水合硫化钠与四水合硝酸镉的质量比为3.64：1，CdS:Mn QDs中Mn2+的掺杂浓度为0.0547mmol/L。
4.采用权利要求1～3任一项所述的基于双发夹结构的电致发光传感器构建方法构建的电致发光传感器，其特征在于，所述电致发光传感器对miRNE-21的检出限为10.8amol/L，线性范围为20amol/L～50pmol/L，miRNA-21的摩尔浓度cmiRNA-21与电致发光强度I的线性方程为I＝1055.86lgcmiRNA-21+7685.79，R2＝0.996；
所述电致发光传感器对MUC1的检出限为0.40fg/mL，线性范围为1fg/mL～10ng/mL，MUC1的质量浓度cMUC1与电致发光强度I的线性方程为I＝2523.09–995.70lgcMUC1，R2＝0.998。
5.如权利要求4所述的基于双发夹结构的电致发光传感器在检测生物标志物miRNA-21和MUC1方面的用途。
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