CN112159653B - 一种电致化学发光试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种电致化学发光试剂及其应用，所述电致发光试剂包括纳米聚合物，所述纳米聚合物为金属有机框架MOF‑808包ABEI功能化的银纳米粒子，命名为纳米聚合物MOF‑808@Ag‑ABEI。使用本发明的电致化学发光试剂的传感器对miRNA‑21的检测具有极高的灵敏度，良好的稳定性和选择性，在临床诊断方面具有潜在的应用价值。

Description

一种电致化学发光试剂及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种电致化学发光试剂及其应用。
背景技术
癌症严重威胁着人类生命健康，目前临床上常应用病理学检查、内镜检查和影像学检查等方法对癌症进行诊断。但由于医疗水平的制约，现有的检测方法往往仅能在癌症的中晚期做出有效检测，错过了最佳治疗时间，从而导致癌症的死亡率偏高。因此，研究癌症早期诊断方法对于降低癌症死亡率具有重大意义。癌症生物标志物是一类可以在机体受到损害时产生异常化信号指标的生物分子，可以为机体提供早期预警，在癌症早期检测和评估中起着重要的作用。MicroRNA-21(miRNA-21)是一个典型的多功能miRNA，因其在血液或组织中的表达水平与乳腺癌等癌症密切相关，被认为是重要的癌症生物标志物。但是，机体中miRNA-21的含量往往较低，这对检测手段的灵敏度提出了更高要求。电致化学发光(ECL)技术作为一种有效的检测手段，因其具有灵敏度高、操作简便以及背景信号低等优点，目前已被广泛地应用于癌症生物标志物的分析。因此，构建高灵敏的ECL传感器用于miRNA-21的检测在基础研究和实际应用中具有重要意义。
ECL生物传感器的研究中，提高传感器的检测灵敏度是研究者们首要关注的热点，通常提高传感器灵敏度的主要途径是将检测信号进行放大。目前研究者们已经提出了一些信号放大的方法，比如纳米材料放大以及生物辅助放大等。生物辅助放大策略是目前应用地比较广的一种提高传感器信号的方法，它包括酶催化放大和DNA相关的一些放大方法。主要分为酶辅助的核酸信号放大策略以及无酶核酸信号放大策略。通过将少量的核酸分子转化为大量的核酸响应，无酶核酸信号放大策略已广泛应用于分析领域，以提高检测的灵敏度并降低检出限。无酶核酸信号放大策略中的催化发夹自组装(CHA)策略因其所具有的反应条件温和、操作简单等优势被广泛的用于miRNA-21的检测。此外，为进一步提高检测的灵敏度并降低检出限，基于纳米探针的信号放大策略引起了广大科研工作者的研究兴趣。利用纳米材料大的比表面积可固载大量的发光材料或共反应试剂，从而提高传感器的信号和灵敏度。共反应试剂在提高发光体信号方面起着至关重要的作用，但常用的共反应试剂往往存在催化效率受限这一问题。因此，探索更具催化效率的共反应试剂催化剂以进一步提高共反应试剂的催化能力具有一定现实意义。
发明内容
本发明提供一种能够实现对miRNA-21的高灵敏检测的电致发光试剂及其应用。
一种电致发光试剂，所述电致发光试剂包括纳米聚合物，所述纳米聚合物为由MOF-808和Ag-ABEI复合而成的纳米聚合物，命名为纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI，即金属有机框架MOF-808包ABEI功能化的银纳米粒子。
其中，所述纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI为由带正电的PDDA功能化的MOF-808纳米复合材料和带负电的Ag-ABEI通过静电作用复合而成的纳米聚合物。
其中，所述纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI中主要含有Zr、Ag、C、N和O元素。
其中，所述电致发光试剂还包括双氧水，所述双氧水是作为纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI电致发光的辅助溶剂使用，在具体使用时，可以与纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI配合使用，也可以配置在检测底液中实现电致发光检测。
本发明提供一种生物探针，所述生物探针为在DNA分子上连接有上述MOF-808@Ag-ABEI得到的探针，所述MOF-808@Ag-ABEI为由MOF-808和Ag-ABEI复合而成的纳米聚合物。所述纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI为由带正电的PDDA功能化的MOF-808纳米复合材料和带负电的Ag-ABEI通过静电作用复合而成的纳米聚合物。
所述纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI中主要含有Zr、Ag、C、N和O元素。
其中，所述生物探针为MOF-808@Ag-ABEI-HP2，所述DNA分子为HP2，所述HP2为序列2所示的DNA分子；所述生物探针MOF-808@Ag-ABEI-HP2由DNA分子HP2通过Ag-N键连接在MOF-808@Ag-ABEI上制备而成。
本发明提供一种用于检测miRNA的系统(产品)，包括生物传感器、所述的探针和检测体系，所述检测体系包括检测底液，所述检测底液为含有过氧化氢的磷酸缓冲溶液。其中，所述磷酸缓冲溶液的pH值为7.4，所述过氧化氢的含量为3mM。
采用玻碳电极(GCE，Φ＝3mm)及修饰电极为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极。
其中，所述生物传感器为MCH/HP1/AuNFs/GCE，所述MCH/HP1/AuNFs/GCE为连接有HP1并用MCH封闭表面的非特异性结合位点的金纳米花修饰的玻碳电极。
其中，检测的miRNA为miRNA-21。
下述任一种应用也应在本发明的保护范围之内：
1)所述的MOF-808@Ag-ABEI在制备电致发光试剂中的应用；
2)所述的MOF-808@Ag-ABEI和双氧水在制备电致发光试剂中的应用；
3)所述的MOF-808@Ag-ABEI在制备检测miRNA的试剂中的应用；
4)所述的MOF-808@Ag-ABEI和双氧水在制备检测miRNA的试剂中的应用；
5)所述的试剂在检测miRNA中的应用；
6)所述的探针在检测miRNA中的应用。
7)所述的系统在检测miRNA中的应用。
本发明的有意效果在于：本发明基于CHA策略构建了一个高灵敏的ECL生物传感器，实现了miRNA-21的高灵敏检测。实验结果表明该传感器对miRNA-21的检测具有极高的灵敏度，其主要原因有：首先，本工作应用MOF-808结合Ag-ABEI作为信号标签，与Ag-ABEI相比，MOF-808@Ag-ABEI具有更强的ECL信号，可以提高检测的灵敏度；其次，利用miRNA-21催化HP1与信号探针之间的CHA反应，通过miRNA-21的高效循环，捕获大量的信号探针到电极表面，实现了信号扩增，提高了检测灵敏度。所构建的传感器具有良好的稳定性和选择性，在临床诊断方面具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为ECL传感器的制备过程(A)以及信号探针(MOF@808-Ag-ABEI-HP2)的制备过程示意图(B)。
图2为MOF-808F(a)和MOF-808(b)的XRD谱图。
图3为MOF-808(A)、Ag-ABEI(B)和MOF-808@Ag-ABEI(C)的SEM图。
图4为MOF-808@Ag-ABEI(A)、Zr 3d(B)、Ag 3d(C)、C 1s(D)、O 1s(E)和N1s(F)的XPS谱图。
图5为不同核酸样品的PAGE图像：泳道M，DNA marker(25-500bp)；泳道1，HP1(1μM)；泳道2，HP2(1μM)；泳道3，HP1(1μM)和HP2(1μM)的混合核酸样品；泳道4，HP1(1μM)、miRNA-21(100nM)和HP2(1μM)反应后的核酸样品；泳道5，HP1(1μM)和HP2(1μM)共退火后的核酸样品。
图6为GCE(a1)，AuNFs/GCE(b1)，HP1/AuNFs/GCE(c1)，MCH/HP1/AuNFs/GCE(d1)在5mM K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和0.1M KCl溶液中的EIS谱图。插图：拟合使用的等效电路图(A)；传感器在CHA反应发生前(a2)和发生后(b2)所产生的ECL信号(B)。
图7为传感器孵育信号探针A获得的ECL信号-时间曲线(A)；传感器孵育信号探针B获得的ECL信号-时间曲线(B)。
图8为传感器对信号探针中不同浓度MOF-808的ECL响应-时间曲线(A)；传感器所产生的ECL信号与MOF-808浓度的关系图(B)；传感器对不同浓度H2O2的ECL响应-时间曲线(C)；传感器所产生的ECL信号与H2O2浓度的关系图(D)。
图9为当miRNA-21的浓度从低到高依次为：100aM，500aM，5fM，50fM，500fM，5pM，50pM以及500pM时传感器所产生的ECL信号-时间曲线(A)；ECL信号与miRNA-21浓度对数的校正曲线(B)。
图10为传感器依次孵育空白miRNA缓冲溶液、miRNA-141、miRNA-155、miRNA-182-5p、miRNA-21以及上述四种miRNA的混合物所获得的ECL信号。
图11为传感器连续扫描20圈所获得的ECL响应-时间曲线(A)；所制备的5支电极对50pM的miRNA-21产生的ECL响应(B)。
具体实施方式
1.材料及试剂
本工作中所使用的DNA单链由上海生工生物工程有限公司提供(中国，上海)，所使用的miRNA链购买于宝生物工程(大连)有限公司(中国，大连)。本工作中所使用的核苷酸序列见表1，所使用的实验试剂见表2，实验用水均为二次蒸馏水(电阻率≥18MΩcm-1)，人体血清样本由东北师范大学附属医院提供。
表1本工作中所用的核苷酸序列
表2本工作中所用实验试剂的相关参数
本工作中所使用的缓冲溶液如下所示：
(1)1×Tris-EDTA缓冲溶液(1×TE，pH＝8.0)：含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA。
(2)DNA缓冲溶液(pH＝8.0)：含有10mM Tris-HCl，1mM EDTA，15mM MgCl2和200mMNaCl。
(3)miRNA缓冲溶液(pH＝8.0)：含有10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM MgCl2和200mM NaCl。
(4)0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)：含有0.1M KCl，0.1M Na2HPO4和0.1MKH2PO4。
实验装置
本工作的电化学测试均采用三电极体系：玻碳电极(GCE，Φ＝3mm)及修饰电极为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极。详细的仪器使用型号及相关参数见表3。
表3本工作中所用仪器的相关参数
实施例1实验材料的制备与处理
1.DNA及miRNA样品的预处理
(1)DNA样品的预处理
首先将HP1和HP2的冻干粉复溶于1×TE缓冲溶液，定量后稀释至终浓度100μM。然后，用DNA缓冲溶液将DNA样品稀释至所需浓度。最后将相应的DNA链加热至95℃保持5min，然后以0.1℃min-1的速度自然冷却至25℃使DNA样品形成稳定的发夹结构。
(2)miRNA样品的预处理
类似于DNA样品的预处理过程，miRNA的冻干粉首先复溶于1×TE缓冲溶液，然后用miRNA缓冲溶液将miRNA样品稀释至所需浓度。
2.材料制备
(1)MOF-808的制备
MOF-808的制备:首先将233mg的ZrCl4和70.6mg的H3BTC放入20mL的玻璃小瓶中，然后向其中加入5.6mL的甲酸和10mL的DMF，超声溶解，随后放入烘箱中并于135℃下反应48h。反应后，将得到的白色沉淀分别用DMF和乙醇洗涤两次，索氏提取12h后得到MOF-808F。
接下来，取50mg上述制备的MOF-808F材料于玻璃小瓶中，然后加入1mL的浓盐酸和11mL的DMF，将玻璃小瓶移入到烘箱并于80℃下反应24h。冷却至室温后，将所得产物用DMF和乙醇洗涤两次，索氏提取12h后即得到MOF-808。
通过X射线衍射(XRD)表征MOF-808F和MOF-808的晶体结构。结果如图2所示，MOF-808F(曲线a)与MOF-808(曲线b)的XRD谱图中出现的主要衍射峰与文献报道的主要衍射峰位置一致，说明MOF-808F和MOF-808被成功合成。
(2)Ag-ABEI的制备
Ag-ABEI复合物的合成参考文献。首先将2mLAgNO3(10mM)加入到含有5mL二次蒸馏水和9mL乙醇的溶液中。然后，将1mLABEI(20mM)快速加入到上述混合溶液中。在室温、避光的条件下反应12h后，即得Ag-ABEI纳米复合物。最后，将所得到的Ag-ABEI复合物用二次蒸馏水和乙醇交替洗涤三次，分散于3mL二次蒸馏水中(Ag-ABEI浓度为6.67mM)，于4℃下冷藏备用。
(3)MOF-808@Ag-ABEI的制备
首先，取3mg的MOF-808溶解在1mL的PDDA(1％)溶液中，搅拌12h使其表面带上正电荷。随后，离心去除未反应的PDDA，用二次蒸馏水洗涤三次后分散于1mL二次蒸馏水中，得到PDDA功能化的MOF-808材料。接下来，取50μL上述PDDA功能化的MOF-808材料，加入50μL的Ag-ABEI，室温下搅拌12h即可得到编号为1的MOF-808@Ag-ABEI纳米复合物，产物中MOF-808的浓度为1.5mg/mL。按照上述方法，取MOF-808的量分别为4mg，5mg，6mg，7mg和8mg，分别制备得到编号为2-6的MOF-808@Ag-ABEI纳米复合物，产物中MOF-808的浓度分别为2mg mL-1，2.5mg mL-1，3mgmL-1，3.5mg mL-1和4mg mL-1。其对应关系如表4所示。
表4.不同产物中的MOF-808的浓度
编号 MOF-808的用量 产物中MOF-808的浓度
1 3mg 1.5mgmL-1
2 4mg 2mgmL-1
3 5mg 2.5mgmL-1
4 6mg 3mgmL-1
5 7mg 3.5mgmL-1
6 8mg 4mgmL-1
通过扫描电子显微镜(SEM)对步骤(1)所制备的MOF-808、步骤(2)所制备的Ag-ABEI和步骤(3)所制备的MOF-808@Ag-ABEI纳米复合物的形貌进行研究。图3(A)为MOF-808的SEM图；图3(B)为Ag-ABEI的SEM图、图3(C)为MOF-808@Ag-ABEI纳米复合物的SEM图。从图3(A)中可以看出，步骤(1)中合成的MOF-808具有良好的分散性，其粒径约为50nm。从图3(B)中可以看出步骤(2)合成的Ag-ABEI是纳米球状形貌。从图3(C)中可以观察到，通过静电吸附作用，步骤(3)中MOF-808可以与Ag-ABEI结合生成球簇状的MOF-808@Ag-ABEI复合物。
利用X-射线电子能谱(XPS)来表征MOF-808@Ag-ABEI复合物的元素组成。如图4(A)所示，MOF-808@Ag-ABEI复合物的XPS分析全谱图可以清楚的显示该复合物含有Zr、Ag、C、N和O元素。图4(B)中位于181.95eV和184.25eV处的特征峰分别代表Zr 3d5/2和Zr 3d3/2。图4(C)中位于367.95eV和374.15eV处的特征峰分别代表Ag 3d5/2和Ag 3d3/2，这证明了银纳米粒子的生成。图4(D、E和F)中位于284.7eV、531.97eV和400.84eV处的特征峰分别代表C1s、O1s以及N1s的特征峰。因此，得出结论MOF-808@Ag-ABEI复合物的制备是成功的。
3.信号探针的制备
3.1信号探针A(Ag-ABEI-HP2信号探针)的制备
取50μL步骤2中制备的Ag-ABEI用二次蒸馏水离心洗涤三次，并分散于200μL二次蒸馏水中。接下来，取40μL已退火的HP2(2μM)缓慢加入到上述200μL溶液中，4℃下反应12h后，即得信号探针A(Ag-ABEI-HP2信号探针)。用二次蒸馏水洗涤三次后分散于200μL二次蒸馏水中，4℃下冷藏备用。
3.2信号探针B(MOF-808@Ag-ABEI-HP2信号探针)的制备
3.2.1信号探针B1的制备
取100μL步骤2中制备的1号MOF-808@Ag-ABEI用二次蒸馏水离心洗涤三次，并分散于200μL二次蒸馏水中。接下来，取40μL退火的HP2(2μM)缓慢加入到上述200μL溶液中，于4℃下反应12h后，即得信号探针B1。用二次蒸馏水洗涤三次后分散于200μL二次蒸馏水中，4℃下冷藏备用。探针中MOF-808的浓度为0.75mg mL-1。
3.2.2信号探针B2的制备
将步骤3.2.1中的1号MOF-808@Ag-ABEI替换为2号MOF-808@Ag-ABEI，其他方法不变，得到信号探针B2。探针中MOF-808的浓度为1mg mL-1。
3.2.3信号探针B3的制备
将步骤3.2.1中的将1号MOF-808@Ag-ABEI替换为3号MOF-808@Ag-ABEI，其他方法不变，得到信号探针B3。探针中MOF-808的浓度为1.25mg mL-1。
3.2.4信号探针B4的制备
将步骤3.2.1中的将1号MOF-808@Ag-ABEI替换为4号MOF-808@Ag-ABEI，其他方法不变，得到信号探针B4。探针中MOF-808的浓度为1.5mg mL-1。
3.2.5信号探针B5的制备
将步骤3.2.1中的将1号MOF-808@Ag-ABEI替换为5号MOF-808@Ag-ABEI，其他方法不变，得到信号探针B5。探针中MOF-808的浓度为1.75mg mL-1。
3.2.6信号探针B6的制备
将步骤3.2.1中的将1号MOF-808@Ag-ABEI替换为6号MOF-808@Ag-ABEI，其他方法不变，得到信号探针B6。探针中MOF-808的浓度为2mgmL-1。
4.ECL生物传感器的构建
首先，使用氧化铝抛光粉打磨GCE，冲洗干净后，依次在硝酸溶液(浓硝酸与二次蒸馏水体积比为1:1)、无水乙醇和二次蒸馏水中超声清洗，吹干后得到干净的GCE。然后，将处理过的干净GCE浸泡于2mL 1％的HAuCl4溶液中，在-0.2V的恒电位下电沉积30s获得金纳米花(AuNFs)修饰的玻碳电极(AuNFs/GCE)。接下来，将10μL HP1(1μM)溶液滴加至AuNFs/GCE表面并于4℃下孵育12h，用二次蒸馏水淌洗电极后得到HP1/AuNFs/GCE。最后，滴加10μLMCH(1mM)于上述电极表面并在室温下孵育40min以封闭电极表面的非特异性结合位点，用二次蒸馏水淌洗电极后得到MCH/HP1/AuNFs/GCE。
CHA反应的可行性分析
采用PAGE实验对CHA反应进行可行性分析。如图5所示，在泳道1和泳道2中可以分别观察到一条单条带，分别代表退火后的HP1和HP2。当把退过火的HP1和HP2混合后，在泳道3中仍然可以观察到HP1和HP2的条带，并且没有观察到新条带的产生，这说明当HP1和HP2各自为发夹结构时，不能自发进行杂交反应。值得注意的是，当把100nM miRNA-21加入到HP1与HP2的混合溶液中，可以在泳道4中观察到一条新的杂交带，并且此杂交带的位置与泳道5中杂交带的位置一致。以上实验结果表明在miRNA-21的作用下，CHA过程可以成功执行。
传感器的电化学表征
首先，在含有5mM K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和0.1M KCl的混合溶液中采用电化学阻抗(EIS)方法表征传感器的构建过程。EIS曲线中半圆的直径反映了电子转移阻抗值(Rct)的大小，理论上半圆直径越大，阻抗值越大。如图6(A)所示，由裸的玻碳电极得到的阻抗曲线中半圆的直径较小，表明其阻抗值较小(曲线a1)。当玻碳电极沉积金后，在所得到的阻抗曲线中几乎观察不到半圆直径，表明其阻抗值减小，这是由于纳米金增加了电极的导电性促进了电子传递(曲线b1)。当在修饰电极上继续固载HP1后，可以观察到所得EIS曲线中半圆直径变大，表明阻抗值变大，这是由于HP1中带负电的磷酸骨架会阻碍电子传递(曲线c1)。当用MCH封闭修饰电极上的非特异性结合位点后，所得EIS曲线中半圆直径明显变大，表明其阻抗值进一步增加，这是由于MCH可以阻碍电子传递(曲线d1)。
进一步，在含有3mM H2O2的2mL PBS(0.1M，pH 7.4)中探究CHA反应在电极上的执行情况。如图6(B)所示，在CHA反应进行前，传感器几乎不产生ECL信号(曲线a2)。当把10μLmiRNA-21(5pM)和10μL MOF-808@Ag-ABEI-HP2溶液滴加到修饰电极(MCH/HP1/AuNFs/GCE)上并于25℃下孵育2h后，随着CHA反应的结束，大量的信号标签MOF-808@Ag-ABEI被固载到电极表面，得到极高的ECL信号(曲线b2)。以上实验结果表面CHA反应可以在电极表面成功执行。
实施例2不同信号探针的性能比较
为了验证MOF-808的存在对ECL信号的增强作用，取10μLmiRNA-21(50pM)和10μL信号探针A；滴加到修饰电极(MCH/HP1/AuNFs/GCE)表面并于25℃下孵育2h。用二次蒸馏水淌洗电极后，测试所制备电极的ECL响应。取10μLmiRNA-21(50pM)和10μL信号探针B4；滴加到修饰电极(MCH/HP1/AuNFs/GCE)表面并于25℃下孵育2h。用二次蒸馏水淌洗电极后，测试所制备电极的ECL响应。上述反应在测试液为含有3mM H2O2的2mL PBS(0.1M，pH＝7.4)中进行测试。
测试结果如图7所示，其中图7(A)表示孵育信号探针A的传感器获得的ECL信号值为1900a.u.；图7(B)表示孵育信号探针B4的传感器获得的ECL信号值为12120a.u.。即孵育信号探针B4的传感器获得的ECL信号值约为孵育信号探针A的传感器获得的ECL信号的6倍。这说明MOF-808的存在可以极大地增强ABEI-H2O2体系的ECL发光。这很可能归因于以下两个方面：首先，MOF-808可以结合更多的Ag-ABEI，从而获得增强的ECL信号。其次，MOF-808能够极大地促进H2O2分解产生O2 ·-和OH·，进而与ABEI反应产生极强的ECL信号。
实施例3实验条件的优化
1.信号探针中MOF-808的浓度对传感器性能的影响
1.1取10μL miRNA-21(50pM)和10μL信号探针B1滴加到修饰电极(MCH/HP1/AuNFs/GCE)表面并于25℃下孵育2h。用二次蒸馏水淌洗电极后，测试所制备电极的ECL响应。上述反应在测试液为含有3mM H2O2的2mL PBS(0.1M，pH＝7.4)中进行测试。
1.2将步骤1.1中的信号探针B1替换为信号探针B2，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
1.3将步骤1.1中的信号探针B1替换为信号探针B3，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
1.4将步骤1.1中的信号探针B1替换为信号探针B4，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
1.5将步骤1.1中的信号探针B1替换为信号探针B5，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
1.6将步骤1.1中的信号探针B1替换为信号探针B6，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
结果如图8(A，B)所示，当信号探针中MOF-808的浓度从0.75mg mL-1增加至1.5mgmL-1时(分别对应信号探针B1-信号探针B2)，随着MOF-808浓度的增加，ECL强度也逐渐增强。当MOF-808浓度大于1.5mg mL-1时，随着MOF-808浓度的增加，ECL强度基本保持不变。
2.过氧化氢浓度对传感器性能的影响
2.1首先，取10μLmiRNA-21(50pM)和10μL信号探针B4(MOF-808的浓度为1.5mg mL-1)滴加到修饰电极(MCH/HP1/AuNFs/GCE)表面并于25℃下孵育2h。用二次蒸馏水淌洗电极后，于含有浓度为1mM的过氧化氢的测试底液中，测试所制备电极的ECL响应。
2.2将步骤2.1中的测试底液中的过氧化氢的浓度更改为1.5mM，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
2.3将步骤2.1中的测试底液中的过氧化氢的浓度更改为2mM，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
2.4将步骤2.1中的测试底液中的过氧化氢的浓度更改为2.5mM，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
2.5将步骤2.1中的测试底液中的过氧化氢的浓度更改为3mM，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
2.6将步骤2.1中的测试底液中的过氧化氢的浓度更改为3.5mM，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
2.7将步骤2.1中的测试底液中的过氧化氢的浓度更改为4mM，其他步骤不变，测试所制备电极的ECL响应。
结果如图8(C，D)所示，当H2O2浓度为1mM至3mM的范围内，随着H2O2浓度的增加，ECL信号也逐渐增强。当H2O2的浓度大于3mM时，随着H2O2浓度的增加，ECL信号强度几乎不变。综上所述，在后续的实验中选择MOF-808的浓度为1.5mg mL-1，H2O2的浓度为3mM用于miRNA-21的检测。
实施例4传感器对miRNA-21的检测
1.利用制备的传感器对目标物miRNA-21进行定量分析。首先，将miRNA-21用miRNA缓冲溶液稀释成不同浓度。然后，取10μL浓度为100aM的miRNA-21和10μLMOF-808@Ag-ABEI-HP2信号探针B4滴加到修饰电极(MCH/HP1/AuNFs/GCE)表面并于25℃下孵育2h。用二次蒸馏水淌洗电极后，测试所制备电极的ECL响应。测试液：含有3mM H2O2的2mLPBS(0.1M，pH＝7.4)中进行测试。
2.将步骤1中的miRNA-21浓度由100aM替换为500aM，保持其他条件不变，，测试所制备电极的ECL响应。
3.将步骤1中的miRNA-21浓度由100aM替换为5fM，保持其他条件不变，，测试所制备电极的ECL响应。
4.将步骤1中的miRNA-21浓度由100aM替换为50fM，保持其他条件不变，，测试所制备电极的ECL响应。
5.将步骤1中的miRNA-21浓度由100aM替换为500fM，保持其他条件不变，，测试所制备电极的ECL响应。
6.将步骤1中的miRNA-21浓度由100aM替换为5pM，保持其他条件不变，，测试所制备电极的ECL响应。
7.将步骤1中的miRNA-21浓度由100aM替换为50pM，保持其他条件不变，，测试所制备电极的ECL响应。
8.将步骤1中的miRNA-21浓度由100aM替换为500pM，保持其他条件不变，，测试所制备电极的ECL响应。
结果如图9所示，图9(A)表示在miRNA-21浓度为100aM至500pM范围内，ECL信号随miRNA-21浓度的增加而增强，且ECL强度与miRNA-21浓度的对数之间存在良好的线性关系，线性方程为I＝1673.60lg c+8713.44(I代表ECL强度，c代表miRNA-21浓度)，相关系数R2为0.997(图9(B))。计算得检出限为30.08aM。此外，如表4所示，与其他检测miRNA-21的工作相比，本工作中所构建的传感器具有较宽的线性范围和较低的检出限。
表4本工作所构建的传感器与其他检测miRNA-21的传感器的性能对比
Fluorescence：荧光；Electrochemistry：电化学
实施例5传感器的选择性
1.取10μL 500pM的miRNA-141以及10μL信号探针B4滴加到修饰电极(MCH/HP1/AuNFs/GCE)表面并于25℃下孵育2h。用二次蒸馏水淌洗电极后，测试所制备电极的ECL响应。测试液：含有3mM H2O2的2mLPBS(0.1M，pH＝7.4)中进行测试。
2.将步骤1中的10μL 500pM的miRNA-141替换为10μL 500pM的miRNA-155，保持其他条件不变，测试所制备电极的ECL响应。
3.将步骤1中的10μL 500pM的miRNA-141替换为10μL 500pM的miRNA-182-5p，保持其他条件不变，测试所制备电极的ECL响应。
4.将步骤1中的10μL 500pM的miRNA-141替换为10μL 50pM的miRNA-21，保持其他条件不变，测试所制备电极的ECL响应。
5.将步骤1中的10μL 500pM的miRNA-141替换为10μL混合溶液，所述混合溶液中miRNA-141、miRNA-155和miRNA-182-5p的浓度为500pM，miRNA-21的浓度为50pM，保持其他条件不变，测试所制备电极的ECL响应。
结果如图10所示，孵育空白样品的传感器所获得的ECL信号与单独孵育miRNA-141、miRNA-155和miRNA-185p的传感器所获得的ECL信号相比相差不多。而孵育了50pMmiRNA-21的传感器所获得的ECL信号明显增加，且其值与孵育上述四种miRNA的混合物所测量得到的信号值相差不多。以上实验结果表明所构建的miRNA-21传感器具有良好的选择性。
实施例6传感器的稳定性和重现性
将传感器连续扫描20圈以探究所构建传感器的稳定性。首先取10μLmiRNA-21(50fM)和10μL MOF-808@Ag-ABEI-HP2信号探针滴加到修饰电极(MCH/HP1/AuNFs/GCE)表面并于25℃下孵育2h。用二次蒸馏水淌洗电极后，连续扫描20圈所制备电极的ECL响应。测试液：含有3mM H2O2的2mLPBS(0.1M，pH＝7.4)中进行测试。探针浓度为1.5mg mL-1。
如图11(A)所示，传感器呈现出稳定的ECL信号，计算得到其相对标准偏差(RSD)为0.74％。接下来，当miRNA-21的浓度为50pM时，采用相同的实验方法制备五支电极对50pM的miRNA-21进行测试以探究传感器的重现性。如图11(B)所示，所得ECL信号的RSD值为0.52％。以上实验结果表明，所构建的传感器具有优异的稳定性和重现性。
实施例7传感器的应用
为了研究所构建的传感器在实际人血清样品中检测miRNA-21的可行性，首先将人体血清样品用miRNA缓冲溶液稀释50倍。接下来，通过标准加入法，用稀释了50倍未裂解外泌体的人血清溶液配制不同浓度的miRNA-21样品。然后用所构建的传感器检测相应的ECL信号，再根据标准曲线计算出浓度，该计算得到的浓度与标准浓度之间的比值即为回收率。如表5所示，所得回收率介于96.21％-100.68％之间。上述实验结果表明所构建的传感器有望应用于人实际血清样品中miRNA-21的检测。
表5传感器在人血清样品中的加标回收实验得到的相关参数
本发明基于CHA策略构建了一个高灵敏的ECL生物传感器，实现了miRNA-21的高灵敏检测。实验结果表明该传感器对miRNA-21的检测具有极高的灵敏度，其主要原因有：首先，本工作应用MOF-808结合Ag-ABEI作为信号标签，与Ag-ABEI相比，MOF-808@Ag-ABEI具有更强的ECL信号，可以提高检测的灵敏度。其次，利用miRNA-21催化HP1与信号探针之间的CHA反应，通过miRNA-21的高效循环，捕获大量的信号探针到电极表面，实现了信号扩增，提高了检测灵敏度。所构建的传感器具有良好的稳定性和选择性，在临床诊断方面具有潜在的应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 东北师范大学
<120> 一种电致化学发光试剂及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttcaaca tcagtctgat aagctaccat gtgtagatag cttatcagac tctactca 58
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttttttaagc tatctacaca tggtagctta tcagactcca tgtgtaga 48
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 6
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24

Claims (9)

1.一种电致发光试剂，其特征在于，所述电致发光试剂包括纳米聚合物，所述纳米聚合物为由MOF-808和Ag-ABEI复合而成的纳米聚合物，命名为纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI；所述纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI为由带正电的PDDA功能化的MOF-808纳米复合材料和带负电的Ag-ABEI通过静电作用复合而成的纳米聚合物。
2.根据权利要求1所述的电致发光试剂，其特征在于，所述纳米聚合物MOF-808@Ag-ABEI中含有Zr、Ag、C、N和O元素。
3.根据权利要求1-2任一所述的电致发光试剂，其特征在于，所述电致发光试剂还包括双氧水。
4.一种生物探针，其特征在于，所述生物探针为在DNA分子上连接有权利要求1-3任一所述MOF-808@Ag-ABEI得到的探针。
5.根据权利要求4所述的生物探针，其特征在于，所述生物探针为MOF-808@Ag-ABEI-HP2，所述DNA分子为HP2，所述HP2为SH-ttttttaagctatctacacatggtagcttatcagactccatgtgtaga，5’-3’。
6.一种用于检测miRNA的系统，其特征在于，包括生物传感器、权利要求4或5所述的探针和检测体系，所述检测体系包括检测底液，所述检测底液为含有过氧化氢的磷酸缓冲溶液。
7.根据权利要求6所述的用于检测miRNA的系统，其特征在于，所述生物传感器为MCH/HP1/AuNFs/GCE，所述MCH/HP1/AuNFs/GCE为连接有HP1并用MCH封闭表面的非特异性结合位点的金纳米花修饰的玻碳电极，所述HP1为SH-TTT TTC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TACCAT GTG TAG ATA GCT TAT CAG ACT CTA CTC A，5’-3’。
8.根据权利要求6或7所述的用于检测miRNA的系统，其特征在于，检测的miRNA为miRNA21，所述miRNA21为UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A，5’-3’。
9.下述任一种应用：
1)权利要求1-2任一中所述的MOF-808@Ag-ABEI在制备电致发光试剂中的应用；
2)权利要求1-2任一中所述的MOF-808@Ag-ABEI和双氧水在制备电致发光试剂中的应用；
3)权利要求1-2任一中所述的MOF-808@Ag-ABEI在制备检测miRNA的试剂中的应用；
4)权利要求1-2任一中所述的MOF-808@Ag-ABEI和双氧水在制备检测miRNA的试剂中的应用；
5)权利要求1-3任一所述的试剂在检测miRNA中的应用；
6)权利要求4-5任一所述的探针在检测miRNA中的应用；
7)权利要求6-8任一所述的系统在检测miRNA中的应用。
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