CN107607525A - 负载贵金属纳米粒子的金属有机骨架及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及材料与分析化学领域，具体涉及一种负载贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料及制备方法和应用。本发明提供了负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料的制备方法，包含下述步骤：将含有有机金属配体、金属离子和一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的原料混合，然后放入反应釜或微波炉中进行反应，得到负载一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架；将负载有第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架、第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液及还原剂混合，得到金属有机骨架复合材料，所述复合材料不仅具有高比表面积、大孔隙率及表面易被功能化特点，同时具有贵金属纳米粒子的导电性及催化效应，可应用于电致化学发光体系。
Description
技术领域
本发明涉及材料与分析化学领域，具体涉及一种负载多种贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料及制备方法和应用。
背景技术
金属有机骨架材料(MOFs)是一种由无机金属中心(金属离子或金属簇)与有机配体通过自组装相互连接，形成的一类具有周期性网络结构的晶态多孔材料。MOFs综合了复合高分子和配位化合物两者的特点，兼具高孔隙率、高比表面积、孔道易调控、骨架结构多样、性能多样化等特性。对 MOFs最初的研究集中于对H2、CH4、CO2等气体的存储、吸附与分离。然而作为新的研究领域，研究者渐渐发现由于缺陷导致的配位不饱和金属以及功能性的有机配体使MOFs具有“类半导体”和“类量子点”的性质，同时 MOFs表面亦含有大量的活性位点。近来越来越多的研究集中在将MOFs与其他纳米材料结合，得到基于MOFs的复合材料，利用纳米材料和MOFs之间在晶体结构和微观形貌的匹配性和电学、光学、磁学上面的互补性等能够使MOFs复合材料进一步广泛应用。
纳米金(AuNPs)、纳米银(AgNPs)、纳米铂(PtNPs)等贵金属纳米粒子因其具有独特的电学、光学及化学性质被研究应用到催化、载体、传感、燃料电池、太阳能电池等领域。贵金属粒子之间在发生催化反应或光电反应时，两者同时存在时起到的协同作用大于单独存在时反应的效果。
受蛋白激酶调控的蛋白磷酸化在细胞信号传导、分化及衰老、新陈代谢、基因转录等生命活动中起着非常重要的作用。当蛋白激酶的活性发生异常(通常是表达过度)或者蛋白磷酸化的位点发生错误时，便会导致多种疾病的发生，比如阿兹海默症、心脏病、糖尿病等。在一些疾病的早期诊断中，蛋白激酶是重要的生物标志物，而蛋白激酶抑制剂能够抑制蛋白激酶的活性，作为药物已经被应用于一些临床疾病的治疗中。因此，快速而准确检测复杂样品中的蛋白激酶的活性及进行蛋白激酶抑制剂的筛选不仅可以在医疗领域内为药物研发、疾病早期诊断与治疗提供帮助，而且在生物学领域有助于在分子层面研究细胞内的信号传导机理。
在蛋白激酶活性分析的传感模式中，针对选择性识别磷酸化肽段或蛋白这一关键问题，最常用的方法是通过特异性识别磷酸根的蛋白质或者能够螯合磷酸根的金属离子或者金属氧化物等来实现。这种传统的“探针-磷酸识别元素-磷酸化多肽”三步式传感模式占据了蛋白激酶活性分析领域的主要地位。虽然三步式传感模式具有比较好的检测结果，但也存在操作过程比较复杂、探针修饰效率不高等缺陷。
金属Zr的UiO MOFs系列具有稳定性和生物相容性强的特点，特别是 UiO-66中的Zr-O簇能够与磷酸根进行络合，形成Zr-O-P键，可以起到识别磷酸根的作用。
中国专利(CN201610179629.6)公开了金属有机骨架UiO-66应用于光电传感器检测蛋白激酶活性，其是将氧化铟锡导电电极ITO电极进行预处理，进行烷基化，接着将肯普肽与烷基化后的电极进行偶联，得到肯普肽进行修饰的电极，接着滴加负载光响应物质的UiO-66，得到光电生物传感器，然后使用光电生物传感器检测蛋白激酶的活性，本发明是采用在金属有机骨架上负载染料物质来检测蛋白激酶的活性，其操作过程比较复杂，电极不能重复利用，且耗时更久。
但是目前还没有负载有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架及使用负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架检测蛋白激酶活性和筛选蛋白激酶抑制剂的报道。
发明内容
为此，本发明提供了一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将含有有机金属配体、金属离子和一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的原料混合，所述金属离子至少包含一种锆离子，然后放入反应釜或微波炉中进行反应，得到负载一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架；
(2)将步骤(1)负载有第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架、第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液及还原剂混合，得到负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料。
本发明提供了一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，其通过在负载有一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架中负载第二贵金属纳米粒子得到，其中，所述负载有一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架通过在有机金属配体和金属离子复合成的金属有机骨架上负载一种或两种以上第一贵金属纳米粒子得到，并且所述金属离子至少包含一种锆离子。
本发明还提供了一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，其是通过上述方法制备得到。
本发明还提供了负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料在检测蛋白激酶活性和筛选蛋白激酶抑制剂中的应用。
本发明还提供了一种检测蛋白激酶活性和筛选蛋白激酶抑制剂的电致化学发光传感器，其通过下述步骤制备得到：
(1)将导电电极与多肽进行偶联；
(2)在步骤(1)的电极上负载含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料得到电致化学发光传感器。
本发明还提供了一种检测蛋白激酶活性和筛选蛋白激酶抑制剂的电致化学发光传感器的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将导电电极与多肽进行偶联；
(2)在步骤(1)的电极上负载含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，得到电致化学发光传感器。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将含有有机金属配体、金属离子和一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的原料混合，所述金属离子至少包含一种锆离子；然后放入反应釜或微波炉中进行反应，得到负载一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架；
(2)将步骤(1)负载第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架、第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液及还原剂混合，得到负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料。
本发明提供了一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，其通过在负载有一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架中负载第二贵金属纳米粒子得到，其中，所述负载有一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架通过在有机金属配体和金属离子复合成的金属有机骨架上负载一种或两种以上第一贵金属纳米粒子得到，并且所述金属离子至少包含一种锆离子。
优选的，对于所述的制备方法或所述的复合材料，其中，所述金属有机配体选自于含氮杂环有机配体、含羧基有机配体或含氮杂环和羧基混合配体中的一种，优选的，所述含羧基有机配体为含芳香基的羧酸。
优选的，对于所述的制备方法或所述的复合材料，其中，所述金属有机配体选自于对苯二甲酸、均苯三甲酸、吡啶、咪唑或哌嗪中的一种。
优选的，对于所述的制备方法或所述的复合材料，其中，所述第一贵金属纳米粒子或者第二贵金属纳米粒子选自于纳米金、纳米铂或纳米银中的一种或两种以上。
优选的，对于所述的制备方法或所述的复合材料，其中，所述金属有机配体与金属离子的摩尔比为0.1-5：1，优选为0.8-1.1:1。
优选的，对于所述的制备方法或所述的复合材料，其中，所述金属离子选自于碱土元素或过渡元素或两性元素中的一种或两种以上。
优选的，对于所述的制备方法或所述的复合材料，其中，所述金属离子包含锆离子以及选自于Mg、Ca、Sr、Ba、Se、Cr、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、 Ni、Cu、Zn、Y、Nb、Mo、Te、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、Al、Ga、Ge、In、 Sn、Sb、Tl、Pb或Bi的一种或两种以上的离子。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在反应釜中的反应温度为100-300℃，优选为100-200℃。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在反应釜中的反应时间为5-72小时，优选为24小时。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在微波中的反应功率为500-1500W，优选为1000W。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在微波中的反应时间为6-300min，优选为10min。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述还原剂选自于硼氢化钠、硫代硫酸钠、乙醇、乙二醇、甲醛、多聚甲醛、甲酸钠、肼或柠檬酸钠中的一种。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述前驱体溶液选自于氯铂酸、氯金酸或硝酸银中的一种。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述前驱体溶液和还原剂的质量比为0.1-5：1，优选为1.6-2:1。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，将负载有第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架、第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液及还原剂混合的方法包含下述步骤：
a.将负载有第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架浸泡于第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液中24-72小时，优选为36-48小时；
b.在步骤a中加入还原剂进行反应，直到变色后停止反应，即得到负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料。
本发明提供了一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，其是通过上述任一方法制备得到。
本发明提供了一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，其在检测蛋白激酶活性及筛选蛋白激酶抑制剂中的应用。
本发明提供了一种检测蛋白激酶活性及筛选蛋白激酶抑制剂的电致化学发光传感器，其包含负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料。
优选的，对于所述的电致化学发光传感器，其通过下述方法的步骤制备得到：
(1)将导电电极与多肽进行偶联；
(2)在步骤(1)的电极上负载含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料得到电致化学发光传感器。
本发明提供了一种检测蛋白激酶活性及筛选蛋白激酶抑制剂的电致化学发光传感器的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将导电电极与多肽进行偶联；
(2)在步骤(1)的电极上负载含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，得到电致化学发光传感器。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述导电电极为石墨烯/玻碳电极。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述多肽为肯普肽。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)和步骤(2)之间还包含步骤(a):将含有蛋白激酶和ATP的缓冲溶液滴加到步骤(1)的电极上。
优选的，对于所述的制备方法，其中，所述蛋白激酶的浓度为 0.015-80UmL-1，优选为0.015-0.25UmL-1。
优选的，对于所述的制备方法，其中，所述ATP的浓度为20-100μM，优选为80μM。
优选，对于所述的制备方法，其中，所述将蛋白激酶和ATP的缓冲溶液滴加到步骤(1)的电极上得到磷酸化多肽，所述磷酸化时间为20-100min，优选为80min。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料在步骤(1)上进行孵育，孵育时间为30-120min，优选为90min。
本发明所取得的有益效果是：
1.本发明将两种或两种以上贵金属纳米粒子同时掺杂到MOF中，由于贵金属纳米粒子具有良好的导电、催化与光电活性等性质，不仅能够有效的改善MOFs本身导电能力比较差的问题，同时赋予了MOFs一定的光学、化学等特点，这些赋予了MOFs更多的功能，使其可以进一步在催化、燃料电池、太阳能电池、生物传感器、光电化学等领域有更好的发展。
2.将两种及以上贵金属纳米粒子同时掺杂进MOFs内部，得到的电学及光学、催化性能优于单种贵金属纳米粒子存在时的效果。
3.MOFs能够增加贵金属纳米粒子在MOFs内部的分散性能，同时起到的富集贵金属纳米粒子的效果。
4.由于贵金属纳米粒子具有很高的表面能，很容易聚沉或者融合，使其长期储存和应用受到了限制，而将贵金属纳米粒子掺杂到MOFs可以解决上述问题。
5.本发明合成同时负载两种或两种以上贵金属纳米粒子MOFs复合材料，其制备过程简单且快速，原材料经济易得。
附图说明
图1是电致化学发光传感器的组装及检测蛋白激酶活性机理示意图；
图2是实施例一中负载纳米金和纳米铂的金属有机配体UiO-66的复合材料的TEM表征图及EDX元素分布图；
图3是电致化学发光传感器步步组装时的发光强度变化示意图，其中，a 为玻碳电极，b为肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极，c为磷酸化肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极，d为Au&Pt@UiO-66探针/肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极，e为 Au&Pt@UiO-66探针/磷酸化肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极；
图4-1、图4-2和图4-3分别是反应条件的优化，其中，图4-1是ATP浓度的优化，图4-2是磷酸化时间的优化，图4-3是探针孵育时间的优化；
图5-1和图5-2分别是不同浓度的蛋白激酶A对应的发光强度，其中，图 5-1为蛋白激酶A在浓度为0.015-0.25UmL-1下对应的发光强度，图5-2是蛋白激酶A在浓度为0.015-80UmL-1下对应的发光强度，内插图为发光强度与蛋白激酶A浓度的线性关系曲线图；
图6是蛋白激酶A抑制剂的筛选试验，其中，a是不同浓度的鞣花酸对应的发光强度，b是不同浓度的Tyrphos-139tinAG1478对应的发光强度。
具体实施方式
图1是电致化学发光传感器的组装及检测蛋白激酶活性机理示意图，将玻碳电极打磨之后清洗烘干备用，在玻碳电极上滴加15μL的氧化石墨烯，之后将其浸入新鲜配置的10mg/mL二氯乙烷/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液中使氧化石墨烯表面的羧基活化。然后将石墨烯/玻碳电极浸入浓度为500 μM的肯普肽溶液中，在室温黑暗处反应12h，使肯普肽通过氧化石墨烯表面的羧基与肯普肽表面的氨基偶联到石墨烯/玻碳电极上，清洗之后氮气吹干得到肯普肽修饰的石墨烯/玻碳电极(肯普肽/石墨烯/玻碳电极)；用1mM的6- 氨基己酸封闭空白位点30min，然后淋洗并用N2干燥，之后将含有一系列浓度的蛋白激酶和ATP的缓冲液(50mMTris-HCl，20mM MgCl2，pH7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80min之后滴加Au&Pt@UiO-66，用缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到制备好的电致化学发光传感器。在施加一定电压的情况下，由于负载有贵金属纳米粒子的金属有机骨架的贵金属纳米粒子催化电致化学发光体系中的鲁米诺-过氧化氢发光的作用，根据发光强度的强弱反映出蛋白激酶活性的变化。
图2是实施例一中负载纳米金和纳米铂的金属有机配体UiO-66的复合材料的TEM表征图，从图中可以看出，使用透射电镜中元素分布EDX映射分析进行元素分析，证明贵金属纳米粒子金和铂已经掺杂到金属有机配体 UiO-66的复合材料中。
图3是电致化学发光传感器步步组装时的发光强度变化示意图，其中，a 为玻碳电极，b为肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极，c为磷酸化肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极，d为Au&Pt@UiO-66探针/肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极，e为 Au&Pt@UiO-66探针/磷酸化肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极；从图中可以看出，玻碳电极、肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极及磷酸化肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极的发光强度很小，将实施例一合成的负载有金和铂的UiO-66连接到肯普肽/ 氧化石墨烯/玻碳电极上时，发光强度较小，而当实施例一合成的负载有金和铂的UiO-66连接到磷酸化肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极上时，发光强度明显上升，说明所述电致化学发光传感器具有比较好的发光性能。
图4-1、图4-2和图4-3分别是反应条件的优化，其中，图4-1是ATP浓度的优化，从图4-1可以看出，发光强度随着ATP浓度的增加而加强，但当 ATP的浓度达到80μM时发光强度达到最大，随着ATP的浓度继续增加，发光强度不再变化，本实验选取ATP的浓度为80μM时进行实验；图4-2是磷酸化时间的优化，从图4-2可以看出，随着磷酸化时间的延长，发光强度逐渐增大，当磷酸化时间达到80min时达到最大，之后不再变化，本发明选择80min 的磷酸化时间；图4-3是探针孵育时间的优化，从图4-3可以看出，在90min 内随着孵育时间的延长，发光强度渐渐增大直到平衡，因此本实验选取90min 作为孵育时间。
图5-1和图5-2分别是不同浓度的蛋白激酶A对应的发光强度，其中，图 5-1为蛋白激酶A在浓度为0.015-0.25UmL-1下对应的发光强度，从图5-1可以看出，在蛋白激酶A浓度为0.015-0.25UmL-1下，随着蛋白激酶A浓度的增加，发光强度逐渐增大；图5-2是蛋白激酶A在浓度为0.015-80UmL-1下对应的发光强度，内插图为发光强度与蛋白激酶A浓度的线性关系曲线图，从图5-2 可以看出，在蛋白激酶A浓度为0.015-80UmL-1下，随着浓度的增加，发光强度逐渐增强，在浓度为60UmL-1下发光强度趋于平衡，其中，在蛋白激酶A 浓度为0.015-0.25UmL-1的范围内，光电流呈线性关系，线性方程为I＝2516× CPKA+6.69，相关系数R＝0.9962，其中，I为发光强度，c为蛋白激酶PKA的活度，求得检测限为0.009UmL-1(S/N＝3)。
图6是蛋白激酶A抑制剂的筛选试验，其中，a是不同浓度的鞣花酸对应的发光强度，b是不同浓度的TyrphostinAG1478对应的发光强度，从图a中可以看出，随着蛋白激酶A抑制剂鞣花酸的浓度的不断增大，发光强度不断地减小，而加入不同浓度的络氨酸抑制剂TyrphostinAG1478，发光强度没有明显的变化，说明本发明构建的电致化学发光传感器可以应用于蛋白激酶A抑制剂的筛选。
术语“第一贵金属纳米粒子”是指在金属有机骨架上先负载一种或两种以上的贵金属纳米粒子。
术语“第二贵金属纳米粒子”是指在负载有一种或两种以上贵金属纳米的金属有机骨架上再负载贵金属纳米粒子。
本发明提供一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料的制备方法，其是先合成负载一种或两种贵金属纳米粒子的金属有机骨架，然后再合成负载另外贵金属纳米粒子的方法，制备得到负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，然后使用制备得到的负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料构建电致化学发光传感器，用于蛋白激酶活性的分析及蛋白激酶抑制剂的筛选中。
在本发明优选的一种具体实施方式中，提供一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将含有有机金属配体、金属离子和一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的原料混合，所述金属离子至少包含一种锆离子；然后放入反应釜或微波炉中进行反应，得到负载一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架；
(2)将步骤(1)负载有第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架、第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液及还原剂混合，得到负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料。
优选的，所述金属离子包含锆离子以及选自于碱土元素为Mg、Ca、Sr、 Ba或过渡元素Se、Cr、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Y、Nb、 Mo、Te、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd等以及两性元素Al、Ga、Ge、In、Sn、Sb、 Tl、Pb、Bi等中的一种或两种以上的离子。
优选的，在步骤(1)中，所述金属有机配体与金属离子的摩尔比为0.1-5： 1。
在步骤(2)中，所述前驱体溶液和还原剂的质量比为0.1-5：1。
优选的，本发明是将一定比例的金属离子及有机配体、贵金属纳米粒子的溶液或者前驱体以及其他共反应试剂在高温下利用反应釜水热制成或者采取微波、超声等方法制成。本发明所制备得到的负载两种或两种以上贵金属纳米粒的金属有机骨架复合材料不仅具有金属有机骨架本身高比表面积、大孔隙率、表面易被功能化等特点，同时具有贵金属纳米粒子导电性以及光电效应等特点，可应用于催化、传感、太阳能电池、燃料电池及其他光电化学领域。
在本发明优选的具体实施方式中，所述共反应试剂与一种或两种贵金属纳米粒子的体积比为100-10:1，其中，所述共反应试剂为本领域技术人员所公知的共反应试剂，由于金属盐与多数有机配体为固体，同时，有机配体与金属离子配位之前需质子化，因此共反应剂多选用碱性溶剂。比如三乙胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮、氢氧化钠等。
本发明所得到的负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料可以应用到检测蛋白激酶活性及筛选蛋白激酶抑制剂中。
在本发明另一种具体实施方式中，本发明提供了一种检测蛋白激酶活性及蛋白激酶抑制剂筛选的电致化学发光传感器，其通过下述方法的步骤制备得到：
(1)将导电电极与多肽进行偶联；
(2)在步骤(1)的电极上负载含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料得到电致化学发光传感器。
在本发明另一种具体的实施方式中，本发明提供了一种检测蛋白激酶活性及蛋白激酶抑制剂筛选的电致化学发光传感器的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将导电电极与多肽进行偶联；
(2)在步骤(1)的电极上负载含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，得到电致化学发光传感器。
优选的，在步骤(1)和步骤(2)之间还包含步骤(a):将蛋白激酶和 ATP的缓冲溶液滴加到步骤(1)的电极上。
本发明合成的负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架利用其负载的贵金属具有催化鲁米诺-过氧化氢体系的发光作用，将其应用于电致化学发光体系，检测蛋白激酶活性及蛋白激酶抑制剂的筛选。
所述的蛋白激酶可以将含有丝氨酸的多肽磷酸化，优选的，所述蛋白激酶为蛋白激酶A，所述多肽为肯普肽。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例所用到的原料的信息及实验设备的信息如表1和表2 所示。
表1本发明所用到的原料的信息
| 原料 | 纯度 | 生产厂家 |
| 蛋白激酶A(PKA) | - | Sigma公司 |
| 鞣花酸(Ellagic acid) | - | Sigma公司 |
| 络氨酸抑制剂(Tyrphostin AG1478) | - | Sigma公司 |
| 肯普肽 | - | GL biochem公司 |
| ATP | - | 鼎国生物试剂公司 |
| 鲁米诺 | - | 北京化学品公司 |
| 氧化石墨烯 | - | 北京化学品公司 |
| PBS缓冲液 | - | 北京化学品公司 |
| 6-氨基己酸 | - | 北京化学品公司 |
表2本发明所用的实验设备的信息
| 设备 | 型号 | 厂家 |
| 透射电子显微镜 | Tecnai G2 F30 | 美国FEI |
| 扫描电子显微镜 | SU8000 | 日本Hitachi |
| 多功能电化学工作站 | MPI-B | 西安瑞迈分析仪器有限责任公司 |
| 玻碳电极 | - | 武汉高仕睿联科技有限公司 |
实施例一同时负载纳米金和纳米铂的金属有机骨架的制备
(1)将120mgZrCl4、96mg对苯二甲酸溶于4mL冰醋酸与32mLN,N- 二甲基甲酰胺的混合溶液中，超声混匀，后加入1mL的纳米铂溶液混合均匀。将得到的混合溶液放入45mL的聚四氟乙烯反应釜中，将反应釜放入120℃烘箱中反应24小时，自然冷却，得到负载纳米铂的UiO-66；
(2)将负载纳米铂的UiO-66浸入100mL 0.01％(w/v)氯金酸溶液中 48小时，之后将混合溶液加热至沸腾，将0.5mL 1％(w/v)柠檬酸钠溶液快速加入到沸腾的氯金酸溶液中，不断搅拌，待溶液变为紫红色后停止加热，继续搅拌至冷却，之后离心，取沉淀干燥，得到同时负载纳米金和纳米铂的 UiO-66复合材料。
将所得到的负载纳米金和纳米铂的UiO-66复合材料使用透射电子显微镜进行扫描并进行元素分析，结果如图2所示，从图2可以看出，纳米金和纳米铂掺杂到金属有机骨架UiO-66中。
实施例二负载纳米银和纳米铂的UiO-66复合材料的制备
(1)将60mg ZrCl4、2mL冰醋酸与16mL N，N’-二甲基甲酰胺的混合溶液超声混匀，继续加入48mg对苯二甲酸继续超声使其混合均匀。随后加入1mL的纳米银溶液混合均匀。将得到的混合溶液置于微波炉中，以 1000W功率，加热2min，停2min，如此间歇加热10min，离心分离后得到负载纳米银的UiO-66。
(2)按照1g H2PtCl6溶于25mL乙醇比例配置H2PtCl6乙醇溶液，取2.0mL H2PtCl6乙醇溶液加入负载有纳米银的UiO-66中，室温匀速搅拌36小时，之后按照铂和甲酸的摩尔比为1:10的比例加入甲酸钠溶液，搅拌1小时，将混合溶液置于微波炉中，以1000W功率，加热2min，停5min，如此间歇加热 30min，冷却之后抽滤并干燥，得到同时负载纳米银和纳米铂的UiO-66复合材料。
实施例三负载纳米铂、纳米银和纳米金的金属有机骨架复合材料的制备
(1)将30mg均苯三甲酸、40mg ZrCl4、0.5g十六烷基三甲基溴化铵 (CATB)溶于15mL N，N’-二甲基甲酰胺与乙醇、去离子水体积比为5:1:0.1 的混合溶液中，超声混匀，随后加入1mL的纳米铂溶液与1mL的纳米银溶液继续超声混合均匀。将得到的混合溶液放入聚四氟乙烯反应釜中，将反应釜放入200℃烘箱中反应24个小时，自然冷却，得到同时负载纳米铂与纳米银的金属有机骨架。
(2)将负载纳米铂与纳米银的金属有机骨架浸入浸入100mL 0.01％ (w/v)氯金酸溶液中48小时，之后将混合溶液加热至沸腾。将0.5mL 1％ (w/v)柠檬酸钠溶液快速加入沸腾的氯金酸溶液中，不断搅拌，待溶液变为紫红色后停止加热，继续搅拌至冷却。之后离心，取沉淀干燥，得到同时纳米铂、纳米银和纳米金的金属有机骨架复合材料。
实施例四构建基于负载纳米金和纳米铂的金属有机骨架复合材料的电致化学发光传感器应用于蛋白激酶活性的分析
1.电极的组装及肯普肽在电极上的磷酸化反应
玻碳电极打磨之后清洗烘干备用。滴加15μL的氧化石墨烯于电极表面之上，之后将其浸入新鲜配置的10mg/mL EDC/NHS溶液使氧化石墨烯表面的羧基活化，然后将石墨烯/玻碳电极浸入浓度为500μM的肯普肽溶液中，在室温黑暗处反应12h使得肯普肽通过氧化石墨烯表面的羧基与肯普肽表面的氨基偶联到石墨烯/玻碳电极上，清洗之后氮气吹干得到肯普肽修饰的石墨烯/玻碳电极(肯普肽/石墨烯/玻碳电极)；1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减少非特异性吸附，之后淋洗并用N2干燥；含有一系列浓度的 PKA和ATP的缓冲溶液(50mMTris-HCl，20mM MgCl2,pH 7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80min之后滴加Au&Pt@UiO-66，用缓冲溶液清洗，氮气吹干，得到制备好的电致化学发光传感器备用。
2.将电致化学发光传感器应用于蛋白激酶活性的分析
(1)电致化学发光传感器的组装
电致化学发光实验在多功能MPI-B电化学工作站上进行，使用三电极体系(参比电极：Ag/AgCl电极，对电极：铂丝电极，工作电极)，试验过程在恒定电压(600V)下进行，以含有100μM鲁米诺(luminol)与0.1M过氧化氢的PBS磷酸盐溶液为反应溶液。
(2)工作原理
肯普肽在蛋白激酶及ATP与金属镁离子的存在下，由于蛋白激酶的催化，其丝氨酸上的羟基会被ATP中的磷酸基取代从而发生肯普肽磷酸化。由于UiO-66存在表面缺陷能够识别磷酸根，因此，Au&Pt@UiO-66探针可直接修饰到磷酸化的多肽上实现传感界面的构建。由于Au&Pt@UiO-66中掺杂的纳米金与纳米铂有催化电致化学发光体系中的鲁米诺-过氧化氢发光的作用，因此，在施加一定电压的条件下，通过纳米金和纳米铂催化的发光强度的强弱可进一步反映出蛋白激酶活性的变化。
(3)电致化学发光传感器的光电流效应
蛋白激酶PKA能够磷酸化肯普肽，从而通过UiO-66表面的缺陷识别将探针修饰到电极上。由附图3中d可见，当肯普肽没有被蛋白激酶PKA磷酸化时，将探针滴加到肯普肽/氧化石墨烯/玻碳电极修饰电极的发光强度依旧可以忽略，这是因为没有被磷酸化的肯普肽不能识别Au&Pt@UiO-66探针，因此发光强度很弱。而肯普肽被磷酸化之后，由于UiO-66表面的缺陷对磷酸根具有络合作用， Au&Pt@UiO-66探针被修饰到电极上，负载的纳米金和纳米铂同时催化鲁米诺 -过氧化氢体系发光，使得发光信号明显的增强。
在肯普肽的磷酸化过程中，ATP提供了磷酸根的供体，在磷酸化的过程中起着重要的作用。在实验过程中，对所使用的ATP的浓度进行了优化，由附图 4-1可以看出，发光强度随着ATP的浓度增加而增强，当ATP的浓度达到80μM 时发光强度达到最大，随着ATP的浓度继续增加，发光强度不再变化，因此本实验选取ATP的浓度为80μM时进行实验。
在酶催化实验中，反应时间也很重要。由图4-2可以看出，随着磷酸化时间的延长，发光强度逐渐增大，当磷酸化时间达到80min时达到最大，之后不再变化，因为本发明选择80min的磷酸化时间。附图4-3为探针在修饰电极上的孵育时间，在90min内随着孵育时间的延长，发光强度渐渐增大直到平衡，因此选取90min为反应的孵育时间。
在对ATP的浓度、磷酸化时间和孵育时间进行优化之后，在最优化的条件下，利用构建的电致化学发光传感器对蛋白激酶PKA的活度进行了分析，如图5所示，随着蛋白激酶A浓度的增加，发光强度逐渐增大，在蛋白激酶 A浓度为0.015-0.25U/mL范围内，光电流呈线性关系，线性方程为I＝2516 ×CPKA+6.69，相关系数R＝0.9962，其中，I为发光强度，C为蛋白激酶PKA 的活度，求得检测限为0.009UmL-1(S/N＝3)。
3.将电致化学发光传感器用于蛋白激酶抑制剂的筛选
当蛋白激酶的表达发生异常(通常是过表达)的时候，能够导致多方面的问题，比如细胞的增殖和分化以及肿瘤的生长等。蛋白激酶抑制剂能够抑制蛋白激酶的活性，在疾病的治疗中起着重要的作用，本发明将构建的电致化学发光传感器应用到蛋白激酶抑制剂的筛选试验中，本发明采用蛋白激酶 A抑制剂鞣花酸和络氨酸抑制剂TyrphostinAG 1478进行筛选试验，结果图 6所示，其中a为不同浓度的鞣花酸对应的发光强度的变化，b为不同浓度的 Tyrphostin AG 1478对应的发光强度的变化，由附图6可以看出，随着蛋白激酶A抑制剂鞣花酸的浓度不断增大，发光强度不断减小，而加入不同浓度的络氨酸抑制剂Tyrphostin AG 1478时，发光强度没有明显的变化，说明构建的电致化学发光传感器可以应用于蛋白激酶A抑制剂的筛选。
综上所述，本发明采用先合成负载一种或两种贵金属纳米粒子的金属有机骨架，然后再负载另外贵金属纳米粒子的合成方法，得到负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，将负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料构建电致化学发光传感器，可用于蛋白激酶活性的分析及蛋白激酶抑制剂的筛选。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (28)
1.一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将含有有机金属配体、金属离子和一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的原料混合，所述金属离子至少包含一种锆离子；然后放入反应釜或微波炉中进行反应，得到负载一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架；
(2)将步骤(1)负载第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架、第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液及还原剂混合，得到负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料。
2.一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，其通过在负载有一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架中负载第二贵金属纳米粒子得到，其中，所述负载有一种或两种以上第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架通过在有机金属配体和金属离子复合成的金属有机骨架上负载一种或两种以上第一贵金属纳米粒子得到，并且所述金属离子至少包含一种锆离子。
3.根据权利要求1所述的制备方法或权利要求2所述的复合材料，其中，所述金属有机配体选自于含氮杂环有机配体、含羧基有机配体或含氮杂环和羧基混合配体中的一种，优选的，所述含羧基有机配体为含芳香基的羧酸。
4.根据权利要求3所述的制备方法或权利要求2所述的复合材料，其中，所述金属有机配体选自于对苯二甲酸、均苯三甲酸、吡啶、咪唑或哌嗪中的一种。
5.根据权利要求1或3所述的制备方法或权利要求2所述的复合材料，其中，所述第一贵金属纳米粒子或者所述第二贵金属纳米粒子选自于纳米金、纳米铂或纳米银中的一种或两种以上。
6.根据权利要求1或3-5任一项所述的制备方法或权利要求2所述的复合材料，其中，所述金属有机配体与金属离子的摩尔比为0.1-5：1，优选为0.8-1.1:1。
7.根据权利要求1或3-6任一项所述的制备方法或权利要求2所述的复合材料，其中，所述金属离子选自于碱土元素或过渡元素或两性元素中的一种或两种以上。
8.根据权利要求7所述的制备方法或权利要求2所述的复合材料，其中，所述金属离子包含锆离子以及选自于Mg、Ca、Sr、Ba、Se、Cr、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Y、Nb、Mo、Te、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、Al、Ga、Ge、In、Sn、Sb、Tl、Pb或Bi中的一种或两种以上的离子。
9.根据权利要求1或3-8任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在反应釜中的反应温度为100-300℃，优选为100-200℃。
10.根据权利要求1或3-9任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在反应釜中的反应时间为5-72小时，优选为24小时。
11.根据权利要求1或3-10任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在微波中的反应功率为500-1500W，优选为1000W。
12.根据权利要求1或3-11任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在微波中的反应时间为6-300min，优选为10min。
13.根据权利要求1或3-12任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述还原剂选自于硼氢化钠、硫代硫酸钠、乙醇、乙二醇、甲醛、多聚甲醛、甲酸钠、肼或柠檬酸钠中的一种。
14.根据权利要求1或3-13任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述前驱体溶液选自于氯铂酸、氯金酸或硝酸银中的一种。
15.根据权利要求1或3-14任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述前驱体溶液和还原剂的质量比为0.1-5：1，优选为1.6-2:1。
16.根据权利要求1或3-15任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，将负载有第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架、第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液及还原剂混合的方法包含下述步骤：
a.将负载有第一贵金属纳米粒子的金属有机骨架浸泡于第二贵金属纳米粒子的前驱体溶液中24-72小时，优选为36-48小时；
b.在步骤a中加入还原剂进行反应，直到变色后停止反应，即得到负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料。
17.一种负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，其通过权利要求1或3-16任一项所述的方法制备得到。
18.权利要求2或17所述的负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，其在检测蛋白激酶活性及筛选蛋白激酶抑制剂中的应用。
19.一种检测蛋白激酶活性及筛选蛋白激酶抑制剂的电致化学发光传感器，其包含权利要求2或17所述的负载两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料。
20.根据权利要求19所述的电致化学发光传感器，其通过下述方法的步骤制备得到：
(1)将导电电极与多肽进行偶联；
(2)在步骤(1)的电极上负载含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料得到电致化学发光传感器。
21.一种权利要求19或20所述的检测蛋白激酶活性及筛选蛋白激酶抑制剂的电致化学发光传感器的制备方法，其包含下述步骤：
(1)将导电电极与多肽进行偶联；
(2)在步骤(1)的电极上负载含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料，得到电致化学发光传感器。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述导电电极为石墨烯/玻碳电极。
23.根据权利要求21或22所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述多肽为肯普肽。
24.根据权利要求21-23任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1)和步骤(2)之间还包含步骤(a):将含有蛋白激酶和ATP的缓冲溶液滴加到步骤(1)的电极上。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其中，所述蛋白激酶的浓度为0.015-80UmL-1，优选为0.015-0.25UmL-1。
26.根据权利要求24或25所述的制备方法，其中，所述ATP的浓度为20-100μM，优选为80μM。
27.根据权利要求24-26任一项所述的制备方法，其中，所述将蛋白激酶和ATP的缓冲溶液滴加到步骤(1)的电极上得到磷酸化多肽，所述磷酸化时间为20-100min，优选为80min。
28.根据权利要求21-27任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述含有两种或两种以上贵金属纳米粒子的金属有机骨架复合材料在步骤(1)上进行孵育，孵育时间为30-120min，优选为90min。
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