CN109307664B - 一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,属于分析化学技术领域和食品安全技术领域。本发明的荧光检测探针是通过将金属离子(包括锌离子、镁离子、铜离子)保护DNA、特异性DNA以及底物DNA与金纳米棒以及上转换纳米粒子相结合得到的;本发明的荧光检测探针能够同时检测活细胞内三种金属离子(包括锌离子、镁离子、铜离子),且检测特异性强、灵敏度高、准确度高(检测活细胞内锌离子时,最低检测限为1.2μM/106cells、准确度为99%;检测活细胞内镁离子时,最低检测限为8.25μM/106cells、准确度为99%;检测活细胞内铜离子时,最低检测限为0.91μM/106cells、准确度为99%),对细胞伤害小(将本发明的荧光检测探针与活细胞孵育24h,对活细胞的损伤仅有8%)。
Description
技术领域
本发明涉及一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,属于分析化学技术领域和食品安全技术领域。
背景技术
生物体中,金属离子普遍参与各种生理过程,例如,镁离子是有关神经肌肉酶的激活剂,同时,也参与细胞增殖和凋亡过程;锌离子水平增高与阿尔兹海默症有关;铜离子在线粒体呼吸链中发挥着重要作用。
因此,金属离子对于维持机体的动态平衡有着十分重要的意义。
事实上,生物体是一个系统,各种组分(包括金属离子)均在在生物体中协同发挥作用,生物体的各种疾病也是与其体内的多个指标(包括金属离子指标)相关。
因此,若能同时对活细胞内多种金属离子进行检测就变得十分有意义。
然而,现有的大多数检测金属离子的方法只能同时检测一种金属离子,并且,现有的大多数检测金属离子的方法均存在前处理复杂、耗时、成本高、操作复杂的缺陷。
例如,通过ICP-MS的方法检测镁离子,用此方法检测细胞内的镁离子时,除了需要大量的细胞样品外,还有极其复杂的前处理;还有,通过一些化学发光荧光探针和金属离子配位鳌合的方法检测金属离子,由于大多数化学探针是针对一类离子,用此方法检测细胞内的金属离子时,特异性很差。
因此,发展出一种能同时检测活细胞中多种金属离子,且具有操作简单、耗时短等优势的金属离子传感器具有巨大的应用前景。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针。此荧光检测探针是通过将金属离子(包括锌离子、镁离子、铜离子)保护DNA、特异性DNA以及底物DNA与金纳米棒以及上转换纳米粒子相结合得到的;此荧光检测探针能够同时检测活细胞内三种金属离子(包括锌离子、镁离子、铜离子),且检测特异性强、灵敏度高、准确度高(检测活细胞内锌离子时,最低检测限为1.2μM/106cells、准确度为99%;检测活细胞内镁离子时,最低检测限为8.25μM/106cells、准确度为99%;检测活细胞内铜离子时,最低检测限为0.91μM/106cells、准确度为99%),对细胞伤害小(将本发明的荧光检测探针与活细胞孵育24h,对活细胞的损伤仅有8%)。
本发明的技术方案如下:
本发明提供了一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,所述荧光检测探针的制备方法为将铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合后进行反应,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A离心弃上清后,用十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB溶液)进行分散,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分别与巯基化的DNA1和DNA2混合后进行孵育,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物(AuNRs@Pt-DNA1)溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物(AuNRs@Pt-DNA2)溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B;将AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合并进行反应,反应结束后,先离心弃上清,再用CTAB溶液进行分散,最后将分散得到的重悬液与巯基化的DNA4混合并进行反应,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B;将上转换纳米粒子(UCNPs)溶液与Tris-HCl缓冲液混合后,将混合得到的混合液A与巯基化的DNA7混合并进行孵育,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A;将修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A离心并过滤后,在得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲液,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B混合后,将混合得到的混合液B与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8混合并进行孵育,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液A;将荧光检测探针溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液;
所述DNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1;
所述DNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO.2;
所述DNA3的核苷酸序列为SEQ ID NO.3;
所述DNA4的核苷酸序列为SEQ ID NO.4;
所述DNA5的核苷酸序列为SEQ ID NO.5;
所述DNA6的核苷酸序列为SEQ ID NO.6;
所述DNA7的核苷酸序列为SEQ ID NO.7;
所述DNA8的核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
所述金纳米棒的制备方法如下:
(1)先于28℃下取5mL的预先配置的浓度为0.5mM的三水合四氯金酸加入到5mL的浓度为0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中,此时,溶液颜色由无色变成黄色,然后向上述混合体系中加入0.6mL的新配制的浓度为0.01mM的硼氢化钠溶液快速搅拌2分钟,溶液颜色即由黄色变为茶色,得到种子液;
(2)将(1)得到的种子液放入30℃的水浴锅中静置反应30分钟,使未完全参与晶种合成的硼氢化钠消耗殆尽,得到合成完毕的种子液;
(3)将1.4g的CTAB和0.2468g的油酸钠加入到50mL、50℃的超纯水中搅拌溶解,待完全溶解后,得到溶液A;
(4)将溶液A放入30℃的水浴锅中进行冷却,待溶液A冷却至30℃时,在溶液A中加入3.6mL的浓度为4mM的硝酸银溶液,搅拌使其分散均匀,待分散均匀后,得到溶液B;
(5)将溶液B放置在30℃的水浴锅中静置15分钟后,在溶液B中加入50mL的浓度为1mM的三水合四氯金酸,于700rpm搅拌90min,90min后溶液变为无色,此时,再在溶液B中加入300μL浓盐酸使其的PH值降至3以下,继续于400rpm搅拌15min,15min后,得到溶液C;
(6)向溶液C中边剧烈搅拌边加入现配的0.25mL的浓度为0.064M的维生素C,共搅拌30s,得到溶液D;
(7)在溶液D中加入80μL(2)中得到的种子液,均匀搅拌30s后,放入30℃生长12h,得到金纳米棒溶液;
(8)将金纳米棒溶液经过7000rpm离心10分钟,弃上清,得到长径比约为3.0金纳米棒。
(具体可参考公开号为CN102127542A的专利申请)
所述铂包裹的金纳米棒的制备方法如下:
(1)将金纳米棒重悬在等体积的超纯水中,得到金纳米棒重悬液;
(2)取一只用王水泡过的50mL的锥形瓶,用超纯水清洗干净,烘干后加入5mL的0.5mM的碘化钠溶液后,再加入29mL的超纯水和10mL的0.05M的CTAB溶液,得到溶液A;
(3)将5mL金纳米棒重悬液加入溶液A中,搅拌均匀,得到溶液B;
(4)在溶液B中加入现配500μL的0.2mM的硝酸银和500μL的0.1M的维生素C,搅拌均匀后,用保鲜膜盖住锥形瓶瓶口放入70℃的水浴锅中,反应60min,得到溶液C;
(5)在溶液C中加入480μL的0.1M的盐酸和440μL的2mM的氯铂酸溶液,搅拌均匀后,用保鲜膜盖住锥形瓶瓶口放如70℃的水浴锅中反应4h,4h后在7000rpm下离心10min结束反应,得到铂包裹的金纳米棒。
(具体可参考文献:Au@Pt nanostructures:a novel photothermal conversionagent for cancer therapy)
所述上转换纳米粒子(UCNP)的制备方法如下:
(1)取一只三颈烧瓶,将0.8mmol的六水合三氯化钆、0.18mmol的六水合三氯化镱和0.02mmol的六水合氯化铒溶解于14mL油酸和16mL十八烯的混合溶液中,在氮气的保护中将溶液加热至150℃,充分搅拌混匀,得到溶液A;
(2)将2.5mmol NaOH、4mmol NH4F溶解于10mL甲醇溶液中,然后缓慢滴加入溶液A中进行反应,待反应冷却至室温后,得到溶液B;
(3)将溶液B在100℃真空环境中搅拌10min以去除多余的甲醇后,在氮气保护下加热至320℃反应1h,反应后将反应液冷却至室温,得到溶液C;
(4)将溶液C用乙醇洗涤后于8500rpm下离心15min,得到上转换纳米粒子(NaGdF4:Yb,Er粒子);
(5)将10mg NaGdF4:Yb,Er粒子反复洗涤重复3次后,溶解于10mL四氢呋喃中,得到溶液D;
(6)将100mg马来酰亚胺-PEG-磷酸盐配体加入溶液D中,搅拌过夜,得到PEG包裹的NaGdF4:Yb,Er粒子;
(7)将PEG包裹的NaGdF4:Yb,Er粒子用环己烷洗涤三次后在室温真空环境中干燥,得到粒径约为15nm的NaGdF4:Yb,Er粒子。
(具体可参考文献:Magnetic/upconversion fluorescent NaGdF4:Yb,Ernanoparticle-based dual-modal molecular probes for imaging tiny tumors invivo)
在本发明的一种实施方式中,所述荧光检测探针的制备方法为将铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合并混合均匀,于25~37℃下反应6~12h,反应结束后,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A离心弃上清后,用与上清同体积的十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB溶液)进行分散,分散均匀后,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分别与巯基化的DNA1和DNA2混合并混合均匀,于25~37℃下孵育6~12h,孵育结束后,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物(AuNRs@Pt-DNA1)溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物(AuNRs@Pt-DNA2)溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A离心弃上清后,用与上清同体积的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B;将AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合并混合均匀,于25~37℃下反应6~12h,反应结束后,离心去上清,用与上清同体积的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,将分散得到的重悬液与巯基化的DNA4混合并混合均匀,于25~37℃下反应6~12h,反应结束后,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A离心去上清后,用与上清同体积的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B;将上转换纳米粒子(UCNPs)溶液与Tris-HCl缓冲液混合,混合均匀后,将混合得到的混合液A与巯基化的DNA7混合并混合均匀,于25~37℃下孵育6~12h,孵育结束后,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A;将修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A离心并过滤,用Tris-HCl缓冲液定容至与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A同体积,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B混合,混合均匀后,将混合得到的混合液B与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8混合并混合均匀,于25~37℃下孵育6~12h,孵育结束后,于摇床上避光振荡0.5~3h,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液A;将荧光检测探针溶液A离心,以去除多余的DNA以及未形成组装结构的AuNRs@Pt二聚体、上转换纳米粒子,弃上清,用与上清同体积的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液。
在本发明的一种实施方式中,所述荧光检测探针的制备方法为将铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合并混合均匀,于37℃下反应10h,反应结束后,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A离心弃上清后,用与上清同体积的十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB溶液)进行分散,分散均匀后,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分别与巯基化的DNA1和DNA2混合并混合均匀,于37℃下孵育12h,孵育结束后,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物(AuNRs@Pt-DNA1)溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物(AuNRs@Pt-DNA2)溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A离心弃上清后,用与上清同体积的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B;将AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合并混合均匀,于30℃下反应8h,反应结束后,离心去上清,用与上清同体积的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,将分散得到的重悬液与巯基化的DNA4混合并混合均匀,于30℃下反应12h,反应结束后,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A离心去上清后,用与上清同体积的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B;将上转换纳米粒子(UCNPs)溶液与Tris-HCl缓冲液混合,混合均匀后,将混合得到的混合液A与巯基化的DNA7混合并混合均匀,于37℃下孵育12h,孵育结束后,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A;将修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A离心并过滤,用Tris-HCl缓冲液定容至与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A同体积,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B混合,混合均匀后,将混合得到的混合液B与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8混合并混合均匀,于37℃下孵育8h,孵育结束后,于摇床上避光振荡12h,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液A;将荧光检测探针溶液A离心,以去除多余的DNA以及未形成组装结构的AuNRs@Pt二聚体、上转换纳米粒子,弃上清,用与上清同体积的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液。
在本发明的一种实施方式中,所述铂包裹的金纳米棒溶液的浓度为1nmol/L。
在本发明的一种实施方式中,所述巯基聚乙二醇溶液的分子量为5000。
在本发明的一种实施方式中,所述铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合的摩尔比为10~200:1。
在本发明的一种实施方式中,所述铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合的摩尔比为120:1。
在本发明的一种实施方式中,所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为5mmol/L。
在本发明的一种实施方式中,所述金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA1混合的摩尔比为200~500:1。
在本发明的一种实施方式中,所述金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA1混合的摩尔比为400:1。
在本发明的一种实施方式中,所述金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA2混合的摩尔比为200~500:1。
在本发明的一种实施方式中,所述金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA2混合的摩尔比为400:1。
在本发明的一种实施方式中,所述AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
在本发明的一种实施方式中,所述AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为1:1。
在本发明的一种实施方式中,所述重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
在本发明的一种实施方式中,所述重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为400:1。
在本发明的一种实施方式中,上转换纳米粒子(UCNPs)溶液的浓度为0.1nmol/L。
在本发明的一种实施方式中,所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4、浓度为10mmol/L。
在本发明的一种实施方式中,所述上转换纳米粒子(UCNPs)溶液与Tris-HCl缓冲液混合的体积比为0.5~2:1。
在本发明的一种实施方式中,所述上转换纳米粒子(UCNPs)溶液与Tris-HCl缓冲液混合的体积比为1:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液A与巯基化的DNA7混合的摩尔比为50~200:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液A与巯基化的DNA7混合的摩尔比为100:1。
在本发明的一种实施方式中,所述修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B混合的体积比为1:0.5~2。
在本发明的一种实施方式中,所述修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B混合的体积比为5:6。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液B与荧光基因修饰的DNA3混合的摩尔比为50~200:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液B与荧光基因修饰的DNA3混合的摩尔比为100:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液B与DNA5混合的摩尔比为50~200:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液B与DNA5混合的摩尔比为100:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液B与荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6混合的摩尔比为50~200:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液B与荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6混合的摩尔比为100:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液B与DNA8混合的摩尔比为50~200:1。
在本发明的一种实施方式中,所述混合液B与DNA8混合的摩尔比为100:1。
在本发明的一种实施方式中,所述荧光检测探针的制备方法如下:
(1)将浓度为1nmol/L的铂包裹的金纳米棒溶液与分子量为5000的巯基聚乙二醇溶液按摩尔比120:1混合并混合均匀,于37℃下反应10h,反应结束后,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A;
(2)将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A于7000rpm离心10分钟,离心三次,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB溶液)进行分散,分散均匀后,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B;
(3)将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分别与巯基化的DNA1和DNA2按摩尔比400:1混合并混合均匀,于37℃下孵育12h,孵育结束后,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物(AuNRs@Pt-DNA1)溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物(AuNRs@Pt-DNA2)溶液A;
(4)将金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A分别于7000rpm离心10分钟,离心三次,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mM的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B;
(5)将AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B按体积比1:1混合并混合均匀,于30℃下反应8h,反应结束后,于5000rpm离心10分钟,离心三次,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mmol/L的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,将分散得到的重悬液与巯基化的DNA4按摩尔比400:1混合并混合均匀,于30℃下反应12h,反应结束后,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A;
(6)将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A于5000rpm离心10分钟,离心三次,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mmol/L的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B;
(7)将浓度为0.1nmol/L的上转换纳米粒子(UCNPs)溶液与PH 7.4的浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液按体积比1:1混合,混合均匀后,将混合得到的混合液A与巯基化的DNA7按摩尔比100:1混合并混合均匀,于37℃下孵育12h,孵育结束后,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A;
(8)将修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A于9000rpm离心10分钟后进行超滤,用PH 7.4的浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液定容至与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A同体积,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B;
(9)将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B按体积比5:6混合,混合均匀后,将混合得到的混合液B与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8按摩尔比100:1混合并混合均匀,于37℃下孵育8h,孵育结束后,于摇床上避光振荡12h,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液A;
(10)将荧光检测探针溶液A于5000rpm离心10分钟,离心三次,以去除多余的DNA以及未形成组装结构的AuNRs@Pt二聚体、上转换纳米粒子,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mmol/L的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液。
本发明提供了上述一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针在检测金属离子方面的应用。
有益效果:
(1)本发明的荧光检测探针可同时检测三种活细胞内的金属离子,原理如下:
①锌离子:将金纳米棒以及上转化纳米粒子之间的序列为三段式,首先,锌离子保护序列(DNA1)通过巯基连接在一条金纳米棒上,锌离子特异性DNA酶(DNA2)通过巯基连接在另一条金纳米棒上,两条棒通过部分碱基序列形成双螺旋(通过设计杂交的长度和碱基的种类计算出来此双螺旋的解螺旋温度大约在55℃),同时,锌离子底物链(DNA3)结合在锌离子特异性DNA酶(DNA2)的非活性部位形成双螺旋(通过设计核酸的种类和长度计算出此双螺旋在60℃不解螺旋),因此,当探针进入细胞,通过光照,探针迅速升温,当温度达到60℃时,锌离子保护序列(DNA1)脱离锌离子特异性DNA酶(DNA2),金纳米棒二聚体解散,同时,锌离子底物链(DNA3)与锌离子特异性DNA酶(DNA2)可以结合,酶链的活性中心形成,因而,当存在锌离子时,锌离子与酶活性中心结合,激活酶切割底物链,切割的带有Cy5荧光的锌离子底物链(DNA3)在30℃条件下即可与酶链解离,从而荧光恢复;
②镁离子:同时在卫星状组装体中,AuNRs@Pt二聚体的外端,连接了巯基化的镁/铜离子特异性的DNA酶(DNA4),酶的两个活性中心通过碱基互补被另外两条DNA链所掩盖(DNA5与DNA8,解链温度在50℃),在镁离子检测中,当探针进入细胞后,通过光照,材料吸收光迅速升温,使得保护序列(DNA5)从酶链上脱落,而镁离子底物链(DNA6)由于解链温度在60℃,可以结合在酶链上,从而能使得镁离子活性位点暴露,细胞中的镁离子与活性中心结合,剪切镁离子底物链,荧光小片段在细胞培养环境中会自发脱落下来,从而荧光恢复;
③铜离子:同时在卫星状组装体中,AuNRs@Pt二聚体的外端,连接了巯基化的镁/铜离子特异性的DNA酶(DNA4),酶的两个活性中心通过碱基互补被另外两条DNA链所掩盖(DNA5与DNA8,解链温度在50℃),在铜离子检测中,巯基化的DNA(DNA7)修饰在UCNPs的表面,可以和酶链部分结合,当探针进入细胞后,通过光照,材料吸收光迅速升温,使得保护序列(DNA8)从酶链上脱落,而铜离子底物链(DNA7)由于解链温度在60℃,可以完全结合在酶链上,从而使酶被激活,活性中心形成,细胞中的铜离子与活性中心结合,剪切铜离子底物链,带有上转换纳米粒子的小片段在细胞培养环境中会自发脱落下来,从而荧光恢复;
(2)本发明的荧光检测探针检测活细胞内金属离子(锌离子、镁离子、铜离子)的特异性强、灵敏度高、准确度高,检测活细胞内锌离子时,最低检测限为每106个细胞中含有1.2μM、准确度为99%;检测活细胞内镁离子时,最低检测限为8.25μM/106cells、准确度为99%;检测活细胞内铜离子时,最低检测限为0.91μM/106cells、准确度为99%;
(3)本发明的荧光检测探针检测对活细胞的损伤小,将本发明的荧光检测探针与活细胞孵育24h,对活细胞的损伤仅有8%。
附图说明
图1:TAMRA的荧光光谱图;
图2:Cy5的荧光光谱图;
图3:980nm激发下的上转换纳米粒子的激发光谱图;
图4:本发明金属离子荧光探针的透射电镜图;
图5:本发明金属离子荧光探针的紫外光谱图;
图6:本发明金属离子荧光探针的粒径分析结果;
图7:本发明金属离子荧光探针的荧光光谱图;
图8:本发明金属离子荧光探针对缓冲体系中三种金属离子的同时检测荧光光谱图;
图9:本发明金属离子荧光探针对缓冲体系中三种金属离子的同时检测特异性荧光光谱图(980纳米激发下的荧光光谱图);
图10:本发明金属离子荧光探针对缓冲体系中三种金属离子的同时检测特异性荧光光谱图(542纳米激发下的荧光光谱图);
图11:本发明金属离子荧光探针对缓冲体系中三种金属离子的同时检测特异性荧光光谱图(638纳米激发下的荧光光谱图);
图12:本发明金属离子荧光探针应用于细胞检测时,探针浓度优化的细胞活性图;
图13:本发明金属离子荧光探针应用于细胞检测时,探针进细胞时间优化细胞活性图;
图14:本发明金属离子荧光探针应用于细胞检测时,探针进细胞时间的优化的激光共聚焦图;
图15:本发明金属离子荧光探针应用于细胞检测时,探针进细胞时间优化荧光光谱图(980纳米激发下的荧光光谱图);
图16:本发明金属离子荧光探针应用于细胞检测时,探针进细胞时间优化荧光光谱图(542纳米激发下的荧光光谱图);
图17:本发明金属离子荧光探针应用于细胞检测时,探针进细胞时间优化荧光光谱图(638纳米激发下的荧光光谱图);
图18:本发明金属离子荧光检测探针对活细胞中Zn2+、Mg2+、Cu2+三种离子实时原位定量分析的激光共聚焦成像结果;
图19:本发明金属离子荧光检测探针对活细胞中Zn2+、Mg2+、Cu2+三种离子实时原位定量分析的荧光光谱;
图20:本发明金属离子荧光检测探针对活细胞中Zn2+检测的标准曲线;
图21:本发明金属离子荧光检测探针对活细胞中Mg2+检测的标准曲线;
图22:本发明金属离子荧光检测探针对活细胞中Cu2+检测的标准曲线;
图23:本发明金属离子荧光检测探针应用于细胞检测时,外加不同浓度镁离子的细胞活性图;
图24:本发明金属离子荧光检测探针应用于细胞检测时,外加不同浓度锌离子的细胞活性图;
图25:本发明金属离子荧光检测探针应用于细胞检测时,外加不同浓度铜离子的细胞活性图;
图26:本发明金属离子荧光检测探针对不同细胞的通用性评价激光共聚焦图;
图27:本发明金属离子荧光检测探针对不同细胞的通用性评价荧光光谱(980纳米激发下的荧光光谱图);
图28:本发明金属离子荧光检测探针对不同细胞的通用性评价荧光光谱(542纳米激发下的荧光光谱图);
图29:本发明金属离子荧光检测探针对不同细胞的通用性评价荧光光谱(638纳米激发下的荧光光谱图)。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的DNA1、DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7以及DNA8均购自上海生工公司;NG108、HeLa以及PCS-460-010细胞购自China Center for Type CultureCollection公司。
下述实施例中涉及的金纳米棒的制备方法如下:
具体步骤如下:
(1)先于28℃下取5mL的预先配置的浓度为0.5mM的三水合四氯金酸加入到5mL的浓度为0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液中,此时,溶液颜色由无色变成黄色,然后向上述混合体系中加入0.6mL的新配制的浓度为0.01mM的硼氢化钠溶液快速搅拌2分钟,溶液颜色即由黄色变为茶色,得到种子液;
(2)将(1)得到的种子液放入30℃的水浴锅中静置反应30分钟,使未完全参与晶种合成的硼氢化钠消耗殆尽(此消耗一是硼氢化钠进一步还原体系中未完全反应的金离子而被消耗,二是在静置反应过程中硼氢化钠由于水解导致其含量进一步降低),得到合成完毕的种子液(合成完毕的种子液要在合成完成后4小时内进行下一步反应);
(3)将1.4g的CTAB和0.2468g的油酸钠加入到50mL、50℃的超纯水中搅拌溶解,待完全溶解后,得到溶液A;
(4)将溶液A放入30℃的水浴锅中进行冷却,待溶液A冷却至30℃时,在溶液A中加入3.6mL的浓度为4mM的硝酸银溶液,搅拌使其分散均匀,待分散均匀后,得到溶液B;
(5)将溶液B放置在30℃的水浴锅中静置15分钟后,在溶液B中加入50mL的浓度为1mM的三水合四氯金酸,于700rpm搅拌90min,90min后溶液变为无色,此时,再在溶液B中加入300μL浓盐酸使其的PH值降至3以下,继续于400rpm搅拌15min,15min后,得到溶液C;
(6)向溶液C中边剧烈搅拌边加入现配的0.25mL的浓度为0.064M的维生素C,共搅拌30s,得到溶液D;
(7)在溶液D中加入80μL(2)中得到的种子液,均匀搅拌30s后,放入30℃生长12h,得到金纳米棒溶液;
(8)将金纳米棒溶液经过7000rpm离心10分钟,弃上清,得到长径比约为3.0金纳米棒。
(具体可参考公开号为CN102127542A的专利申请)
下述实施例中涉及的铂包裹的金纳米棒的制备方法如下:
具体步骤如下:
(1)将金纳米棒重悬在等体积的超纯水中,得到金纳米棒重悬液;
(2)取一只用王水泡过的50mL的锥形瓶,用超纯水清洗干净,烘干后加入5mL的0.5mM的碘化钠溶液后,再加入29mL的超纯水和10mL的0.05M的CTAB溶液,得到溶液A;
(3)将5mL金纳米棒重悬液加入溶液A中,搅拌均匀,得到溶液B;
(4)在溶液B中加入现配500μL的0.2mM的硝酸银和500μL的0.1M的维生素C,搅拌均匀后,用保鲜膜盖住锥形瓶瓶口放入70℃的水浴锅中,反应60min,得到溶液C;
(5)在溶液C中加入480μL的0.1M的盐酸和440μL的2mM的氯铂酸溶液,搅拌均匀后,用保鲜膜盖住锥形瓶瓶口放如70℃的水浴锅中反应4h,4h后在7000rpm下离心10min结束反应,得到铂包裹的金纳米棒(铂包裹的金纳米棒可存放于室温)。
(具体可参考文献:Au@Pt nanostructures:a novel photothermal conversionagent for cancer therapy)
下述实施例中涉及的上转换纳米粒子(UCNPs)的制备方法如下(水热法):
具体步骤如下:
(1)取一只三颈烧瓶,将0.8mmol的六水合三氯化钆、0.18mmol的六水合三氯化镱和0.02mmol的六水合氯化铒溶解于14mL油酸和16mL十八烯的混合溶液中,在氮气的保护中将溶液加热至150℃,充分搅拌混匀,得到溶液A;
(2)将2.5mmol NaOH、4mmol NH4F溶解于10mL甲醇溶液中,然后缓慢滴加入溶液A中进行反应,待反应冷却至室温后,得到溶液B;
(3)将溶液B在100℃真空环境中搅拌10min以去除多余的甲醇后,在氮气保护下加热至320℃反应1h,反应后将反应液冷却至室温,得到溶液C;
(4)将溶液C用乙醇洗涤后于8500rpm下离心15min,得到上转换纳米粒子(NaGdF4:Yb,Er粒子);
(5)将10mg NaGdF4:Yb,Er粒子反复洗涤重复3次后,溶解于10mL四氢呋喃中,得到溶液D;
(6)将100mg马来酰亚胺-PEG-磷酸盐配体加入溶液D中,搅拌过夜,得到PEG包裹的NaGdF4:Yb,Er粒子;
(7)将PEG包裹的NaGdF4:Yb,Er粒子用环己烷洗涤三次后在室温真空环境中干燥,得到粒径约为15nm的NaGdF4:Yb,Er粒子(上转换纳米粒子需存放在4℃的环境中)。
(具体可参考文献:Magnetic/upconversion fluorescent NaGdF4:Yb,Ernanoparticle-based dual-modal molecular probes for imaging tiny tumors invivo)
实施例1:铂包裹的金纳米棒和上转换纳米粒子的表面核酸功能化
具体步骤如下:
(1)将浓度为1nM的铂包裹的金纳米棒溶液与分子量为5000的巯基聚乙二醇溶液按摩尔比120:1混合并混合均匀,于37℃下反应10h,反应结束后,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A;
(2)将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A于7000rpm离心10分钟,离心三次,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mM的十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB溶液)进行分散,分散均匀后,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B(金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B需存放在30℃的环境中);
(3)将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分别与巯基化的DNA1和DNA2(DNA1和DNA2的核苷酸序列见表1)按摩尔比400:1混合并混合均匀,于37℃下孵育12h,孵育结束后,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物(AuNRs@Pt-DNA1)溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物(AuNRs@Pt-DNA2)溶液A;
(4)将金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A分别于7000rpm离心10分钟,离心三次,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mM的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B(AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B需存放在30℃的环境中);
(5)将AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B按体积比1:1混合并混合均匀,于30℃下反应8h,反应结束后,于5000rpm离心10分钟,离心三次,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mM的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,将分散得到的重悬液与巯基化的DNA4(DNA4的核苷酸序列见表1)按摩尔比400:1混合并混合均匀,于30℃下反应12h,反应结束后,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A;
(6)将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A于5000rpm离心10分钟,离心三次,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mM的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B(AuNRs@Pt二聚体溶液B需存放在30℃的环境中);
(7)将浓度为0.1nmol/L的上转换纳米粒子(UCNPs)溶液与PH 7.4的浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液按体积比1:1混合,混合均匀后,将混合得到的混合液与巯基化的DNA7(DNA7的核苷酸序列见表1)按摩尔比100:1混合并混合均匀,于37℃下孵育12h,孵育结束后,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A;
(8)将修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A于9000rpm离心10分钟后进行超滤,用PH 7.4的浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液定容至与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A同体积,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B(修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B于25℃下存放);
(9)将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B按体积比5:6混合,混合均匀后,将混合得到的混合液与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8(DNA3、DNA5、DNA6和DNA8的核苷酸序列见表1)按摩尔比100:1混合并混合均匀,于37℃下孵育8h,孵育结束后,于摇床上避光振荡12h,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液A;
(10)将荧光检测探针溶液A于5000rpm离心10分钟,离心三次,以去除多余的DNA以及未形成组装结构的AuNRs@Pt二聚体、上转换纳米粒子,弃上清,用与上清同体积的浓度为5mM的CTAB溶液进行分散,分散均匀后,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液(可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液需存放在30℃的环境中)。
表1 DNA及其末端修饰
其中,r为切割位点。
实施例2:荧光检测探针的表征
具体步骤如下:
采用透射电镜(加速电压为200keV)对铂包裹的金纳米棒二聚体和上转换纳米粒子构建金属离子荧光检测探针进行表征,同时,通过紫外光谱仪、圆二色谱仪、荧光光谱仪、激光动态光散射仪对实施例1构建的荧光检测探针进行表征。
表征结果如图1-7,由图1-3可知,上转换纳米粒子的发射峰在542纳米,Cy5的发射峰在680纳米,TAMRA的发射峰在580纳米;由图4可知,卫星状组装体荧光探针已成功构建;由图5可知,卫星状组装体荧光探针组装体形成后,其紫外可见光光谱发生了很明显的红移;从图6可知,卫星状组装体荧光探针的粒径与单体相比发生了明显的变化;由图7可知,组装后,染料和荧光材料的荧光被金棒包铂所淬灭,证明了卫星状组装体荧光探针的成功组装。
实施例3:金属离子荧光检测探针体外检测标准曲线的建立和特异性的评价
1、标准曲线的建立
具体步骤如下:
(1)将实施例1得到的荧光检测探针溶液取一定体积分装多支小管分装(确保每支小管的体积能够满足仪器的需求量)后,在小管中加入一定体积的Cu2+,Mg2+,Zn2+标准溶液,使得Mg2+,Zn2+终浓度分别为101、102、103、104、105nM,Cu2+终浓度为5、10、50、100、500nM,得到不同浓度的三种金属离子与荧光检测探针的混合溶液;
(2)将混合溶液避光放入50℃烘箱孵育30分钟,完成孵育后,于5000rpm下离心10分钟,取上清;
(3)将上清分别于548nm、640nm和980nm激发光下照射,获得荧光检测探针中TAMRA、Cy5和上转换纳米粒子的发光强度光谱图(如图8,随着锌镁铜三种离子浓度的提高,荧光值也相应增强)。
2、特异性的评价
具体步骤如下:
(1)将实施例1得到的荧光检测探针溶液取一定体积分装多支小管分装(确保每支小管的体积能够满足仪器的需求量)后,在小管中加入浓度为10mM的Co2+,Mn2+,Cd2+,Ca2+,Pb2+,Cr2+,Ni+,Na+,Al3+,Hg2+标准溶液,混合均匀,得到不同金属离子与荧光检测探针的混合溶液;
(2)将混合溶液避光放入50℃烘箱孵育30分钟,完成孵育后,于5000rpm下离心10分钟,取上清;
(3)将上清分别于548nm、640nm和980nm激发光下照射,获得荧光检测探针中TAMRA、Cy5和上转换纳米粒子的发光强度光谱图并将上清在543nm、578nm和680nm波长下测量荧光检测探针中TAMRA、Cy5和上转换纳米粒子的发光强度值。
将(3)中的检测结果与1中结果进行比较(比较结果见图9-11)。
由图9-11可知,该探针只有在存在锌离子镁离子和铜离子存在时才会有响应,因此,该探针具有很好的特异性。
实施例4:荧光检测探针浓度对细胞活性的影响
具体步骤如下:
(1)将HeLa细胞培养在培养瓶中(培养瓶中培养基为10mL含有10%的FBS以及6mL的双抗的1640基础培养基),于含有5%的二氧化碳的培养箱中贴壁增殖,待细胞长满培养皿底部90%后,用胰酶消解细胞后,2000rpm下离心3分钟,收集细胞沉淀;
(2)用6mL完全培养基(含有10%的FBS以及6mL的双抗的1640基础培养基)重悬细胞,然后将细胞转移到96孔板中,每孔200μL的细胞,培养6h后,加入一定量的实施例1中的荧光检测探针,使得终浓度分别为0、0.5、1、2、5、20nM;
(3)将实施例1中的荧光检测探针与细胞孵育12h后,将培养基倒掉,用DPBS洗三次,洗完后,再加入200μL的DPBS,然后每孔加入10μL的CCK-8,孵育4h后,测量450nm处的吸光值,计算细胞活性(检测结果见图12)。
由图12可知,实施例1中的荧光检测探针浓度为5nM时对细胞基本没有毒性。
实施例5:荧光检测探针孵育时间对细胞活性的影响
具体步骤如下:
(1)将HeLa细胞培养在培养瓶中(培养瓶中培养基为10mL含有10%的FBS以及6mL的双抗的1640基础培养基),于含有5%的二氧化碳的培养箱中贴壁增殖,待细胞长满培养皿底部90%后,用胰酶消解细胞后,2000rpm下离心3分钟,收集细胞沉淀;
(2)用6mL完全培养基(含有10%的FBS以及6mL的双抗的1640基础培养基)重悬细胞,然后将细胞转移到96孔板中,每孔200μL的细胞,培养6h使细胞贴壁后,加入一定量的实施例1中的荧光检测探针,使得终浓度为5nM;
(3)将实施例1中的荧光检测探针与细胞分别孵育48h、24h、16h、8h、4h、0h后,将培养基倒掉,用DPBS洗三次,洗完后,再加入200μL的DPBS,然后每孔加入10μL的CCK-8,孵育4h后,测量450nm处的吸光值,计算细胞活性(检测结果见图13-14)。
由图13-14可知,荧光检测探针孵育时间为8h时细胞活性最高,因此,将8h作为最佳孵育时。
实施例6:时间对荧光检测探针检测结果的影响
具体步骤如下:
(1)将HeLa细胞培养在培养瓶中(培养瓶中培养基为10mL含有10%的FBS、6mL的双抗、100μM的锌离子、100μM的镁离子以及1μM的铜离子的1640基础培养基的1640基础培养基),于含有5%的二氧化碳的培养箱中贴壁增殖12h后,用胰酶消解细胞后,2000rpm下离心3分钟,收集细胞沉淀;
(2)然后将细胞转移到6孔板中,每孔1mL的细胞悬液,培养6h使细胞贴壁后,在细胞悬液中加入一定量的实施例1中的荧光检测探针,使得终浓度为5nM;
(3)将实施例1中的荧光检测探针与细胞分别孵育48h、24h、16h、8h、4h、0h后,将培养基倒掉,用DPBS洗三次,洗完后,加入固定液(铺满底部即可)于980nm,542nm和638nm的激光器下观察细胞的发光强度(检测结果见图15-17)。
由图15-17所示,时间为8h时,荧光检测探针进入细胞的量最多,因此,将8h作为最佳孵育时。
实施例7:荧光检测探针对活细胞中三种金属离子实时原位定量分析及通用性评价
具体步骤如下:
(1)将HeLa细胞培养在培养瓶中(培养瓶中培养基为10mL含有10%的FBS以及6mL的双抗的1640基础培养基);
(2)将培养瓶中的HeLa细胞用胰酶消解后分装到6个激光共聚焦小皿中,每皿加入500μL胰酶消解后的HeLa细胞培养液,放入培养箱培养24h使细胞贴壁;
(3)24h后,用移液枪吸去培养基,并在小皿中加入不同浓度的CuSO4(使得6个小皿中CuSO4终浓度分别为0、10、50、100、200、500nM)、MgSO4(使得6个小皿中MgSO4终浓度分别为0、102、103、104、2×104、4×104nM)、ZnSO4(使得6个小皿中ZnSO4终浓度分别为0、102、103、104、2×104、4×104nM)与细胞共培养12h;
(4)12h后,用DPBS洗培养液三次,再加入实施例1中含有终浓度为5nM的荧光检测探针的细胞培养基于细胞小皿中共孵育8h;
(5)8h后,用DPBS洗掉培养基和探针,洗三次后,加入一定量固定液(覆盖细胞小皿底部即可),使用激光共聚焦显微镜(激光波长分别为546nm,640nm以及980nm)观察细胞内的上转换发光强度,同时收集每个激光共聚焦小皿的细胞,使用荧光光谱仪以获取细胞内的荧光光谱图(检测结果见图18-25)。
如图18所示,随着外加离子浓度的不断提高,细胞的发光强度也在变亮,同时收集细胞测量三种离子的荧光光谱;如图19所示,随着离子浓度的增加,荧光强度也在变强;三种离子在细胞中的线性关系如图20,图21,图22所示,都表现出对活细胞内三种离子的良好线性。
经过检测限公式1计算,可知,实施例1中荧光检测探针对活细胞内金属离子的最低检测限分别为:
锌离子:每106个细胞中的锌离子含量为1.2μM;
镁离子:每106个细胞中的镁离子含量为8.25μM;
铜离子:每106个细胞中的铜离子含量为0.91μM。
因此,该探针不仅对三种离子的灵敏度高,且是第一次应用于活细胞内三种金属离子的同时检测;
公式1如下:
其中,LOD为最低检测限,Cblack为空白样品(即离子浓度为0时)对应的荧光强度,SD为标准差,a为标准曲线的斜率,b为标准曲线的截距。
实施例8:荧光检测探针对不同细胞的通用性评价
具体步骤如下:
(1)分别将NG108、HeLa以及PCS-460-010细胞培养在培养瓶中(培养瓶中培养基为10mL含有10%的FBS以及6mL的双抗的1640基础培养基);
(2)分别将培养瓶中的NG108、HeLa以及PCS-460-010细胞用胰酶消解后分装到3×3个激光共聚焦小皿中,每皿加入500μL胰酶消解后的NG108、HeLa或PCS-460-010细胞培养液,放入培养箱培养24h使细胞贴壁;
(3)24h后,用移液枪吸去培养基,并在小皿中加入CuSO4(使小皿中CuSO4终浓度为500nM)、MgSO4(使小皿中MgSO4终浓度为100μM)、ZnSO4(使小皿中ZnSO4终浓度为100μM)与细胞共培养12h;
(4)12h后,用DPBS洗培养液三次,再加入实施例1中含有终浓度为5nM的荧光检测探针与细胞小皿中共孵育8h;
(5)8h后,用DPBS洗掉培养基和探针,洗三次后,加入一定量的固定液(覆盖细胞小皿底部即可),使用激光共聚焦显微镜(激光波长分别为546nm,640nm以及980nm)观察细胞内的上转换发光强度,同时收集每个激光共聚焦小皿的细胞,使用荧光光谱仪以获取细胞内的荧光光谱图(检测结果见图26-29)。
由图26-29可知,铜离子和镁离子在PCS-460-010细胞中含量最高,而锌离子含量在NG108细胞中含量最高,与报道的结果一致,因此,探针具有很好的实用性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 1
<120> 一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttactca ctatttcgac c 21
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcacgtccat cttctccgag ccggtcgaaa tagtgagt 38
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtgcaggta gaaggatatc actca 25
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaaagggct agctacaacg aaaaaaaata gattgggtat agcgcctggg ccccccgggg 60
ac 62
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgttgtagct agcccttttt t 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctatttttt ttattttt 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccccaatacg cgctataccc aa 22
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccccgggggg cccag 15
Claims (44)
1.一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,是修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体、修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子,与荧光基因修饰的DNA3、荧光基因修饰的DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8的混合孵育物;所述修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体是AuNRs@Pt-DNA1以及AuNRs@Pt-DNA2的孵育物;
所述DNA1为与DNA2的活性部位互补或部分互补的序列;
所述DNA2为锌离子特异性DNA酶;
所述DNA3为与DNA2的非活性部位互补或部分互补的序列;
所述DNA4为镁/铜离子特异性DNA酶;
所述DNA5为与DNA4的活性部位互补或部分互补的序列;
所述DNA6为与DNA4的非活性部位互补或部分互补的序列;
所述DNA7为与DNA4的非活性部位互补或部分互补的序列;
所述DNA8为与DNA4的活性部位互补或部分互补的序列。
2.如权利要求1所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述DNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1;所述DNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO.2;所述DNA3的核苷酸序列为SEQ ID NO.3;所述DNA4的核苷酸序列为SEQ ID NO.4;所述DNA5的核苷酸序列为SEQ ID NO.5;所述DNA6的核苷酸序列为SEQ ID NO.6;所述DNA7的核苷酸序列为SEQID NO.7;所述DNA8的核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
3.如权利要求1所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述荧光检测探针的制备方法为将铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合后进行反应,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液分别与巯基化的DNA1、巯基化的DNA2混合后进行孵育,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液;将AuNRs@Pt-DNA1溶液以及AuNRs@Pt-DNA2溶液混合并进行反应,反应结束后,再与巯基化的DNA4混合并进行反应,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液;将上转换纳米粒子溶液与Tris-HCl缓冲液混合后,将混合得到的混合液与巯基化的DNA7混合并进行孵育,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液混合后,将混合得到的混合液与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8混合并进行孵育,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液。
4.如权利要求2所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述荧光检测探针的制备方法为将铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合后进行反应,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液分别与巯基化的DNA1、巯基化的DNA2混合后进行孵育,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液;将AuNRs@Pt-DNA1溶液以及AuNRs@Pt-DNA2溶液混合并进行反应,反应结束后,再与巯基化的DNA4混合并进行反应,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液;将上转换纳米粒子溶液与Tris-HCl缓冲液混合后,将混合得到的混合液与巯基化的DNA7混合并进行孵育,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液混合后,将混合得到的混合液与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8混合并进行孵育,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液。
5.如权利要求2所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述荧光检测探针的制备方法为将铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合后进行反应,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A离心弃上清后,用十六烷基三甲基溴化铵溶液进行分散,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分别与巯基化的DNA1和DNA2混合后进行孵育,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B;将AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合并进行反应,反应结束后,先离心弃上清,再用CTAB溶液进行分散,最后将分散得到的重悬液与巯基化的DNA4混合并进行反应,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B;将上转换纳米粒子溶液与Tris-HCl缓冲液混合后,将混合得到的混合液A与巯基化的DNA7混合并进行孵育,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A;将修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A离心并过滤后,在得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲液,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B混合后,将混合得到的混合液B与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8混合并进行孵育,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液A;将荧光检测探针溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液。
6.如权利要求3所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述荧光检测探针的制备方法为将铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合后进行反应,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A离心弃上清后,用十六烷基三甲基溴化铵溶液进行分散,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分别与巯基化的DNA1和DNA2混合后进行孵育,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B;将AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合并进行反应,反应结束后,先离心弃上清,再用CTAB溶液进行分散,最后将分散得到的重悬液与巯基化的DNA4混合并进行反应,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B;将上转换纳米粒子溶液与Tris-HCl缓冲液混合后,将混合得到的混合液A与巯基化的DNA7混合并进行孵育,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A;将修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A离心并过滤后,在得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲液,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B混合后,将混合得到的混合液B与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8混合并进行孵育,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液A;将荧光检测探针溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液。
7.如权利要求4所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述荧光检测探针的制备方法为将铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合后进行反应,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液A离心弃上清后,用十六烷基三甲基溴化铵溶液进行分散,得到金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B;将金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分成两份,将两份金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B分别与巯基化的DNA1和DNA2混合后进行孵育,得到金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A;将金纳米棒-聚乙二醇-DNA1复合物溶液A以及金纳米棒-聚乙二醇-DNA2复合物溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B;将AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合并进行反应,反应结束后,先离心弃上清,再用CTAB溶液进行分散,最后将分散得到的重悬液与巯基化的DNA4混合并进行反应,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B;将上转换纳米粒子溶液与Tris-HCl缓冲液混合后,将混合得到的混合液A与巯基化的DNA7混合并进行孵育,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A;将修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液A离心并过滤后,在得到的沉淀中加入Tris-HCl缓冲液,得到修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B;将修饰有巯基化DNA4的AuNRs@Pt二聚体溶液B与修饰有巯基化DNA7的上转换纳米粒子溶液B混合后,将混合得到的混合液B与荧光基因修饰的DNA3、DNA5、荧光淬灭基团TAMRA修饰的DNA6以及DNA8混合并进行孵育,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液A;将荧光检测探针溶液A离心弃上清后,用CTAB溶液进行分散,得到可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针溶液。
8.如权利要求3所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合的摩尔比为10~200:1。
9.如权利要求4所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合的摩尔比为10~200:1。
10.如权利要求5所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合的摩尔比为10~200:1。
11.如权利要求6或7所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述铂包裹的金纳米棒溶液与巯基聚乙二醇溶液混合的摩尔比为10~200:1。
12.如权利要求5所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,所述金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA1混合的摩尔比为200~500:1。
13.如权利要求6或7所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA1混合的摩尔比为200~500:1。
14.如权利要求8所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA1混合的摩尔比为200~500:1。
15.如权利要求9或10所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA1混合的摩尔比为200~500:1。
16.如权利要求5所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA2混合的摩尔比为200~500:1。
17.如权利要求6或7所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA2混合的摩尔比为200~500:1。
18.如权利要求8所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA2混合的摩尔比为200~500:1。
19.如权利要求9或10所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA2混合的摩尔比为200~500:1。
20.如权利要求12所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA2混合的摩尔比为200~500:1。
21.如权利要求14所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,金纳米棒-聚乙二醇复合物溶液B与巯基化的DNA2混合的摩尔比为200~500:1。
22.如权利要求5所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
23.如权利要求6或7所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
24.如权利要求8所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
25.如权利要求9或10所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
26.如权利要求12所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
27.如权利要求14所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
28.如权利要求16所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
29.如权利要求18或20或21所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,AuNRs@Pt-DNA1溶液B以及AuNRs@Pt-DNA2溶液B混合的体积比为0.5~2:1。
30.如权利要求5所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
31.如权利要求6或7所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
32.如权利要求8所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
33.如权利要求9或10所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
34.如权利要求12所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
35.如权利要求14所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
36.如权利要求16所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
37.如权利要求18或20或21所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
38.如权利要求22所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
39.如权利要求24或26或27或28所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针,其特征在于,重悬液与巯基化的DNA4混合的摩尔比为200~500:1。
40.权利要求1-10任一所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针在检测金属离子方面的应用。
41.权利要求12或14或16或18或24或30或32或38所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针在检测金属离子方面的应用。
42.权利要求20-22任一所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针在检测金属离子方面的应用。
43.权利要求26-28任一所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针在检测金属离子方面的应用。
44.权利要求34-36任一所述的一种可检测活细胞内金属离子的荧光检测探针在检测金属离子方面的应用。
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Publication number | Publication date |
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