CN101004422A - 细胞内镉离子检测用氟硼染料荧光探针 - Google Patents

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CN101004422A CN 200710010109 CN200710010109A CN101004422A CN 101004422 A CN101004422 A CN 101004422A CN 200710010109 CN200710010109 CN 200710010109 CN 200710010109 A CN200710010109 A CN 200710010109A CN 101004422 A CN101004422 A CN 101004422A
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彭孝军
樊江莉
杜健军
王静云
吴云扣
孙世国
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Abstract

本发明涉及精细化工领域中一类镉离子荧光比率分子探针，该探针通过甲基氟硼荧光染料与二－(2－吡啶甲基)－苯甲醛缩合而成。激发和发射波长在可见光区。在pH 5～12的范围内，探针对镉离子有很好的选择性，而钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰，可以检测微摩尔浓度的镉离子。探针分子络合镉离子后荧光量子产率增大4倍以上，镉离子络合前后发射光谱蓝移约40－80nm，可以对镉离子进行比率荧光检测。共聚焦激光荧光显微成像实验表明这类探针对DC等细胞等各类细胞或组织渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，特别适于细胞内镉离子浓度变化和镉离子分布的检测。

Description

细胞内镉离子检测用氟硼染料荧光探针
技术领域：
本发明属于精细化工领域中细胞内镉离子检测用荧光分子探针。
背景技术：
镉离子是对人体和环境最有威胁和毒害作用的金属离子之一。它对于生殖、骨骼、肾脏以及神经系统都有不同程度的毒性。镉广泛用于如电镀、冶金、军工等工业生产过程，甚至在磷酸肥料中也有发现，这些因素以及镉镍电池的广泛应用导致镉大量流失到环境中，并且可进一步通过食物链富积于人体中，对人的健康也有极大损害。所以对于镉离子尤其是细胞或组织内的镉离子的检测以及生物学研究已经成为近年来的研究热点。
尽管对金属离子的检测已经存在很多方法，比如原子吸收、电子顺磁共振等，但是这些方法都不能够对生物体内离子进行直观、实时检测，并且样品的预处理也比较复杂，所以其应用受到一定的限制。荧光探针具有灵敏度高、选择性好、反应时间快、能够进行实时区域离子检测，而受到普遍的重视。理想的金属离子荧光分子探针应具有以下性质：化学/光稳定性高、激发波长在可见光区(≥400nm)、对金属离子具有选择性和灵敏性、响应快、对细胞pH环境不敏感、具有适当的脂溶性和水溶性、对细胞毒害作用小等。
目前有效的镉离子选择性荧光探针较少，并且还没有开发出适于细胞内镉离子检测的荧光探针。已报道的对镉离子有选择性的荧光探针主要分两大类：一是氮杂冠醚类镉离子荧光探针；二是多羟基类镉离子荧光探针。但是这两类探针还存在性能上的不足。氮杂冠醚类镉离子荧光探针是一种喹啉类氮杂冠醚[Prodi，L.；Montalti，M.；Zaccheroni，N.；Bradshaw，J.S.；Izatt，R.M.；Savage，P.B.Characterization of5-chloro-8-methoxyquinoline appended diaza-18-crown-6 as a chemosensor for cadmiumTetrahedron Lett.2001，42，2941-2944.]，因易质子化，不适用于生理环境中检测，激发波长处于紫外区(～350nm)容易使生物本体产生自荧光干扰，并且短的激发波长还会对细胞产生伤害，因此这种探针的应用受到了一定的限制。多羟基类镉离子荧光探针是近年来发展的一类探针，这类探针具有对pH不敏感，荧光增强较大等优点。代表性报道是Gunnlaugsson等研究的荧光探针[(a)Gunnlaugsson，T.；Lee，T.C.；Parkesh，R.Org.Lett.2003，5，4065-4068.(b)Gunnlaugsson，T.；Lee，T.C.；Parkesh，R.Tetrahedron2004，60，11239-11249.]。这类探针最大的不足就是锌离子对于镉离子的检测干扰较大，两种离子的响应区域交叉较大，所以在研究有锌离子干扰下的镉离子变化受到限制。
基于ICT原理的比率荧光探针由于在检测到金属离子后，荧光量子产率可能增大，并伴随吸收或发射光谱明显地移动，因此这种探针在检测金属离子是受外界因素的干扰较小，甚至可以通过定量检测信号提供准确的数据。
发明内容
本发明改进现有的镉离子荧光探针结构和性能上的不足，设计合成出适用于活细胞内镉离子检测、性能优良的基于氟硼荧光染料的探针分子作为研究目标。
本发明使用甲基氟硼荧光染料，用乙烯基连接染料母体和识别基团，使整个分子的吸收和发射红移，染料波长增长。
本发明的细胞内镉离子检测用的氟硼染料荧光探针具有下列结构通式(I)：
Figure A20071001010900041
通式I中：R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10为相同或不相同的R11；R11为H、C1-12烷基、C1-12环烷基、C1-12烷基取代的苯基、C1-12烷基取代的萘基、F、Cl、Br、I、OR12、N(R12)2、CN、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M；R12为H、C1-12烷基、C1-12环烷基、C1-12烷基取代的苯基、C1-12烷基取代的萘基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M；R3为H、C1-12烷基、C1-12环烷基、C1-12烷基取代的苯基、C1-12烷基取代的萘基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM、(CH2)mSO3M，苯基、苄基、萘基、含邻、间、对位取代的C6H4R13或含邻、间、对位取代的-CH2-C6H4-R13；R13为H、C1-12烷基、F、Cl、Br、I、OR12、N(R12)2、CN、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M；n、m＝0-15；M为H、K、Na、Li、NH4、NH3R14、NH2(R14)2、NH(R14)3或N(R14)4；R14为H、C1-4烷基或CH2CH2OH。
本发明代表性的化合物的合成方法，是让带甲基取代的染料母体(II)，与带二-(2-吡啶甲基氨基)的苯甲醛(III)反应，经过柱分离得到探针纯品。在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和分析检测方法。
Figure A20071001010900051
本发明的氟硼染料荧光探针使用方法没有特殊的限制。通常，可以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙腈、丙酮、二甲基亚砜等水溶性有机溶剂，然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。
本发明的氟硼染料荧光探针的具体特征如下：
探针分子激发在530～590nm范围内，本身发射在600～690nm范围内，加入镉离子后在550～650nm范围内，对溶剂极性不敏感，并且化学-光稳定性好；探针分子络合镉离子前荧光量子产率较低，络合镉离子后荧光量子产率增大4倍以上，镉离子络合前后发射光谱蓝移约40-80nm，可以对镉离子进行比率荧光检测。探针分子对镉离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰；探针分子对pH变化不敏感，pKa值3-4。在pH-12的范围内，pH变化对荧光发射没有影响；探针分子与镉离子之间的络合常数在微摩范围内，可以检测微摩尔浓度的细胞镉离子；探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适于细胞内镉离子浓度变化的检测。可使用各类荧光显微镜、各类共聚焦激光显微镜得到各类活细胞或组织内镉离子的分布荧光图像或假彩比例荧光图像。
附图说明
图1是本发明的荧光探针分子I-1对镉离子具有良好的选择性。荧光探针分子I-1的浓度为5μM，各种金属离子的浓度是其30倍当量时的荧光发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图2是本发明的荧光探针分子I-1的荧光强度和镉离子浓度的关系。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。荧光探针分子I-1的浓度为5μM，箭头表示镉离子的浓度变化从小到大依次为0，0.1，0.3，0.5，0.7，1.0，2.0，5.0，7.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0和500.0倍当量。
图3是本发明的荧光探针分子I-1荧光强度与pH变化关系。横坐标为pH，纵坐标为(a)荧光强度的比率(F624nm/F652nm)，(b)597nm处荧光强度。荧光探针分子I-1的浓度为5μM。
图4是各种金属离子对于本发明的荧光探针分子(I-1)-镉离子络合物的干扰。荧光探针分子I-1的浓度为5μM。横坐标为50倍当量的各种金属离子，纵坐标为比率荧光强度(F597nm/F697nm)。
图5是用本发明的荧光探针分子I-1研究DC癌细胞内镉离子的共聚焦荧光显微照片，激发波长为543nm，收集597±15nm通道的荧光。图5a是白光下的DC细胞；图5b是在DC细胞培养基中加入5μM的荧光探针分子，在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中I-1孵育1小时后(未加入镉离子)；图5c是在DC细胞培养基中加入荧光探针分子I-1孵育0.5小时后，继续加入5μM CdCl2，在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时。所用仪器是共聚焦激光扫描显微镜，20倍目镜。型号：LeicaTCS-SP2。
图6是用本发明的荧光探针分子I-1研究DC细胞内镉离子假彩荧光比率图像(F597±15/F697±15)，利用图形处理软件MetaFluor software(Universal Imaging Corp)处理后，得到F597/F697比例假彩图像。图6a是在DC细胞培养基中加入5μM的荧光探针分子I-1孵育1小时后(未加入镉离子)；图6b是在DC细胞培养基中加入荧光探针分子I-1孵育0.5小时后，继续加入5μM CdCl2孵育0.5小时。所用仪器是共聚焦激光扫描显微镜，20倍目镜。型号：Leica TCS-SP2。
研究探针对镉离子选择性的方法是将探针分子I-1分别加到30倍过量的不同金属离子的缓冲液中的荧光强度与未加金属离子的探针分子溶液比较。另外，比较干扰离子存在下对镉离子的响应，通常是将探针分子I-1加到50倍过量的不同金属离子与50倍过量的镉离子混合的缓冲液中，荧光强度与仅加50倍过量镉离子的探针分子溶液比较。
研究探针pH的响应的方法是将探针分子加入离子强度为0.1的水溶液中，调节pH值为2.0左右，测定荧光强度后，加入碱液，缓慢增大pH值，记录相应的荧光强度变化，以荧光变化对pH作图。
探针在细胞内探测镉离子性能的实验方法是将含有探针分子的中性缓冲液加入到培养好的细胞中，在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时，用上述缓冲溶液或培养液充分洗涤后，用荧光显微镜成像得到空白图像。向上述含探针的细胞培养液中加入CdCl2溶液(最终浓度为5μM)37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时，用培养液冲洗后，再进行荧光显微成像得到细胞内镉离子的分布图像，由此得到镉离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。
探针的应用方法是将溶解于有机溶剂或有机/水混合溶剂中的这类探针加入到被测的含镉离子的细胞的培养液中，使探针浓度在1-100μM，被测细胞与探针在10-40℃和含1-10％CO2气氛的细胞培养箱中孵育0.1-10小时后，探针透过细胞膜，与细胞内镉离子络合发出荧光，用不含探针和镉离子的水溶液或培养液充分洗涤后，细胞在荧光显微镜或激光共聚焦扫描荧光显微镜下得到镉离子分布的荧光图像。根据不同扫描波长的镉离子荧光图像强度的比值，得到镉离子荧光比例图像。由此得到镉离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。最佳孵育条件为：温度为37℃，含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5-1小时。
本发明涉及的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该系列探针分子对pH变化极不敏感，响应时间极短，检测灵敏度极较高，对细胞的渗透性和毒副作用小，使得这类探针作为测定生物体内的镉离子浓度快速变化的试剂是极其有用的。这类探针具有如下特点：
第一，本发明荧光探针分子激发和发射光谱在可见区，荧光量子产率高，对溶剂极性不敏感，并且化学/光稳定性好。
第二，本发明荧光探针分子的设计基于分子内光诱导电荷转移(PCT)原理，探针分子络合镉离子前后荧光发射光谱有约53nm的蓝移且量子产率至少有4倍的增长，可以进行比率荧光检测。荧光探针分子对镉离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。另外荧光探针分子对pH变化不敏感，pKa值3-4，在pH5-12的范围内，pH变化对荧光发射没有影响。
第三，本发明荧光探针分子与镉离子之间的络合常数在亚微摩尔范围内，可以检测微摩尔浓度的细胞内镉离子。
第四，探针分子细胞渗透性好，对细胞本身毒副作用小，适于细胞内镉离子浓度变化的检测。
具体实施方式
实施例1
探针I-1的合成：
(1)中间体2的合成
将150ml除水二氯甲烷作为溶剂加入到250ml单口烧瓶中，再量取0.14ml乙酰氯(1.95mmol)和0.4ml 2，4-二甲基吡咯(3.89mmol)加入上述反应液，氩气保护的条件下，加热回流10小时，溶液颜色变黑，薄层色谱检测发现原料2，4-二甲基吡咯反应完毕。旋转蒸发掉大约100ml二氯甲烷，量取8ml三氟化硼乙醚溶液(7.52mmol)和4ml三乙胺(28.65mmol)慢慢加入上述旋转蒸发后的溶液，反应剧烈且放出大量的热，4小时后反应完毕，旋转蒸发除去二氯甲烷溶剂而得到黑褐色粘稠液体，硅胶色谱分离得到0.204g目标产物，产率40％。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：2.41(s，6H，CH3)，2.52(s，6H，CH3)，2.58(s，3H，CH3)，6.05(s，2H，CH)MS，m/z(M-)：262.1。
(2)探针3(I-1)的合成
将0.131g(0.5mmol)的中间体2，0.228g(0.75mmol)的二(2-吡啶甲基)苯甲醛，0.1ml的哌啶溶于10ml甲苯中，氩气保护。搅拌，回流反应16h。硅胶色谱分离得到0.048g目标产物，产率18％。1H-NMRδ(400MHz，CDCl3，Me4Si)：2.41(s，3H)，2.44(s，3H)，2.52(s，3H)，2.58(s，3H)，4.88(s，4H)，6.04(s，1H)，6.63(s，1H)，6.69(d，J＝8Hz，2H)，7.13(d，J＝12Hz，1H)，7.23(m，J＝32Hz，5H)，7.41(d，J＝8Hz，2H)，7.66(t，J＝12Hz，2H)，8.61(d，J＝8Hz，2H)。13C-NMRδ(400MHz，CDCl3，Me4Si)：16.5，17.445，17.8，57.4，112.8，113.9，115.5，117.8，121.1，122.5，127.3，129.3，133.0，136.3，137.3，150.4，152.2，158.3。HRMS(EI)C33H32BF2N5[M+H]+ calcd for 548.2797，found 548.2789。
探针I-2的合成：
Figure A20071001010900091
(1)中间体2的合成
将10ml除水二氯甲烷作为溶剂加入到50ml单口烧瓶中，再连续加入戊二酸酐(68mg，0.60mmol)，2，4-二甲基吡咯(112mg，1.20mmol)和三氟化硼乙醚溶液(0.11g，0.80mmol)，氩气保护的条件下，加热回流5小时，溶液颜色变黑，薄层色谱检测发现原料2，4-二甲基吡咯反应完毕。冷却至室温，将三氟化硼乙醚溶液(0.56g，4.0mmol)和三乙胺(0.3g，3.0mmol)慢慢加入，反应剧烈且放出大量的热.过夜，旋转蒸发除去二氯甲烷溶剂而得到黑褐色粘稠液体，硅胶色谱分离得到30mg目标产物，产率16％。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：6.06(s，2H)，3.05-2.98(m，2H)，2.58-2.48(m，2H)，2.51(s，6H)，2.42(s，6H)，2.02-1.93(m，2H)；13C-NMRδ(400MHz，CDCl3，Me4Si)：177.9，154.3，144.7，140.4，131.5，121.9，27.4，26.5，16.3，14.5，14.4；HRMS[EI，M+]m/z calcdfor C17H21BF2N2O2 333.1701，found 333.1705.
(2)探针3(I-2)的合成
将0.167g(0.5mmol)的中间体2，0.228g(0.75 mmol)的二(2-吡啶甲基)苯甲醛，0.1ml的哌啶溶于10ml甲苯中，氩气保护。搅拌，回流反应24h。硅胶色谱分离得到0.042g目标产物，产率16％。1H-NMRδ(400MHz，CDCl3，Me4Si)：1.60(m，1H)，1.96(t，2H)，2.23(t，2H)，2.41(s，3H)，2.44(s，3H)，2.52(s，3H)，2.58(s，3H)，4.88(s，4H)，6.04(s，1H)，6.63(s，1H)，6.69(d，J＝8Hz，2H)，7.13(d，J＝12Hz，1H)，7.23(m，J＝32Hz，5H)，7.41(d，J＝8Hz，2H)，7.66(t，J＝12Hz，2H)，8.61(d，J＝8Hz，2H)。13C-NMRδ(400MHz，CDCl3，Me4Si)：16.45，17.4，17.8，22.6，33.0，36.2，57.4，112.8，113.9，115.5，117.8，121.1，122.5，127.3，129.3，133.0，136.3，137.3，150.4，152.2，158.3，177.0。HRMS(EI)C36H36BF2N5O2[M+H]+ calcd for 619.5204，found 619.4875。
实施例2
探针I-1对镉离子选择性：
使用上述合成的化合物I-1评价对镉离子的选择性。将5μM的化合物I-1加到三十倍过量的各种金属离子的pH7.4的Tris-盐酸缓冲液中(丙酮/水＝9/1，v/v)，探针激发波长为580nm，发射波长为597nm，测试结果显示于图1中。从图中可以看到，探针I-1对镉离子具有很高的选择性，镉离子的加入产生很大蓝移以及荧光的增强，另外钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。
实施例3
探针I-1对pH的不敏感性：
使用上述合成的化合物I-1评价对pH的响应，对于化合物I-1在离子强度为0.1的水溶液中调节pH值为2.0左右，测定荧光强度后，加入碱液，使pH值缓慢增大，记录相应的荧光强度变化，测试结果显示于图3中。从图中可以看出探针I-1有很低的pKa值，在pH-12的范围内，pH变化对荧光发射基本没有影响。因此探针I-1可用于大pH范围内的细胞内镉离子的检测。
实施例4
细胞培养：
DC细胞由DEME(Invitrogen)培养液培养，成像的前一天，细胞放于平底表面皿中，成像时细胞放于含有5％CO2和5μM的探针I-1缓冲液于37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5-1小时，用中性缓冲溶液或培养液充分洗涤后(洗涤三遍以上)，用荧光微镜成像得到空白图像(图5a)。向上述含探针的细胞培养液中加入CdCl2溶液(最终浓度为5μM)在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵化0.5小时，用培养液冲洗三遍后，再进行荧光显微成像得到细胞内镉离子的分布图像(图5c)。利用图形处理软件MetaFluor software(Universal Imaging Corp)处理后，得到F597/F697比例荧光假彩，见附图6。其中图6a是在DC细胞培养基中加入5μM的荧光探针分子I-1孵育1小时后(未加入镉离子)；图6b是在DC细胞培养基中加入荧光探针分子I-1孵育0.5小时后，继续加入5μM CdCl2孵育0.5小时。所用仪器是共聚焦激光扫描显微镜，20倍目镜，型号：Leica TCS-SP2。

Claims (2)

1.一类氟硼染料荧光探针，其特征在于该氟硼染料荧光探针具有下列结构通式I：
Figure A2007100101090002C1
通式I中：R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10为相同或不相同的R11；R11为H、C1-12烷基、C1-12环烷基、C1-12烷基取代的苯基、C1-12烷基取代的萘基、F、Cl、Br、I、OR12、N(R12)2、CN、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M；R12为H、C1-12烷基、C1-12环烷基、C1-12烷基取代的苯基、C1-12烷基取代的萘基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M；R3为H、C1-12烷基、C1-12环烷基、C1-12烷基取代的苯基、C1-12烷基取代的萘基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM、(CH2)mSO3M，苯基、苄基、萘基、含邻、间、对位取代的C6H4R13或含邻、间、对位取代的-CH2-C6H4-R13；R13为H、C1-12烷基、F、Cl、Br、I、OR12、N(R12)2、CN、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M；n、m＝0-15；M为H、K、Na、Li、NH4、NH3R14、NH2(R14)2、NH(R14)3或N(R14)4；R14为H、C1-4烷基或CH2CH2OH。
2.按照权利要求1所述的氟硼染料荧光探针的用途，其特征在于将溶解于有机溶剂或有机/水混合溶剂中的这类探针加入到被测的含镉离子的细胞的培养液中，使探针浓度在1～100μM，被测细胞与探针在10～40℃和含1～10％CO2气氛的细胞培养箱中孵育0.1-1小时后，探针透过细胞膜，与细胞内镉离子络合发出荧光，用不含探针和镉离子的水溶液或培养液充分洗涤后，细胞在荧光显微镜或激光共聚焦扫描荧光显微镜下得到镉离子分布的荧光图像，根据不同扫描波长的镉离子荧光图像强度的比值，得到镉离子荧光比例图像，由此得到镉离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。
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