CN114235770B - 植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和LeadmiumTMGreen AM新用途 - Google Patents

植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和LeadmiumTMGreen AM新用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，包括：S1、先对LeadmiumTM Green AM进行改性处理，去掉其连接的AM基团，得到不含AM基团的LeadmiumTM Green‑，并配成溶液；S2、将植物组织与上述不含AM基团的LeadmiumTM Green‑溶液混合、避光孵育，孵育结束后，将植物组织取出，用适当波长的光照射植物组织，检测观察植物组织细胞外的荧光分布情况。本发明通过对LeadmuimTM Green AM进行预处理，使其失去AM基团，利用失去AM基团的LeadmuimTM Green AM无法进入植物细胞内和易与质外体铅离子和/或镉离子相结合并产生荧光的特性，实现了对植物质外体铅离子和/或镉离子的特异性示踪，拓宽了LeadmiumTM Green AM的应用范围。

Description

植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和LeadmiumTMGreen AM新用途
技术领域
本发明涉及植物细胞中金属元素的示踪方法，尤其是植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和LeadmiumTM Green AM试剂的新用途。
背景技术
目前，土壤铅、镉等重金属污染形式严峻。而利用植物对重金属的吸收和积累来修复铅、镉等重金属污染土壤，因其经济、环境友好，被当作理想的重金属污染土壤治理修复方法。近年来，大量研究致力于解析植物吸收、转运和积累铅、镉等重金属的机制。在植物中，铅和镉等重金属的吸收和转运经由两条途径：细胞内途径(共质体途径)和细胞外途径(质外体途径)。如何精确和特异的指示胞内和胞外的铅、镉等重金属离子一直是植物吸收转运重金属研究的热点和难点。
LeadmiumTM Green AM(铅离子/镉离子绿色荧光探针)是ThermoFisherScientific旗下品牌Invitrogen的专利产品，是一种独特的工具用来高度特异性和高灵敏度的检测细胞内铅(lead,Pb)离子和镉(cadmium,Cd)离子水平。该指示剂中的AM(acetoxymethyl)基团一方面可以促进指示剂跨膜进入细胞内，另一方面能够阻止指示剂与铅、镉离子结合。当LeadmuimTM Green AM进入细胞后，细胞质中的非特异性酯酶会水解掉AM基团，从而释放出带电荷的LeadmiumTM Green，其与细胞内的铅、镉离子易于结合，并在特定波长照射发出荧光，由此实现对细胞内铅、镉离子的示踪和检测。由此可见，LeadmiumTMGreen AM试剂只能用于指示细胞内的铅、镉离子，而不能用于对细胞外(质外体)铅、镉离子的特异性指示。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法以及LeadmiumTM Green AM新用途。该方法主要是通过对LeadmiumTM Green AM进行改性处理，去除其所带的AM(acetoxymethyl)基团，使其不能进入细胞内并易于与细胞外的铅离子和/或镉离子结合产生荧光效应，借此用于对植物质外体中的铅离子和/或镉离子进行指示和示踪。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其包括：
S1、先对LeadmiumTM Green AM进行改性处理，去掉其连接的AM基团，得到不含AM基团的LeadmiumTM Green-，并配成溶液；
S2、将植物组织与上述不含AM基团的LeadmiumTM Green-溶液混合、避光孵育，孵育结束后，将植物组织取出，用适当波长的光照射植物组织，检测观察植物组织细胞外的荧光分布情况。
根据本发明的较佳实施例，S1的具体方法为：将LeadmiumTM Green AM粉末加入溶剂进行溶解和稀释，然后加入酯酶，混匀、25℃避光反应。
根据本发明的较佳实施例，S1的具体方法为：取一定量LeadmiumTM Green AM粉末，加入DMSO溶解，再加入去离子水定容，得到浓度为100μg/mL的LeadmiumTM Green AM溶液；将酯酶粉末用去离子水配成100U/mL的溶液；按体积比5：1将LeadmiumTM Green AM溶液与酯酶溶液混合均匀，25℃避光反应0.5-1h，得到不含AM基团的LeadmiumTM Green-溶液。
根据本发明的较佳实施例，S2中，所述适当波长为488nm。
根据本发明的较佳实施例，S2的具体方法为：先将植物组织浸泡在EDTA-Na2溶液中1-2min，取出用去离子水清洗3-5次，随后将植物组织浸没到不含AM基团的LeadmiumTMGreen-溶液中，室温避光孵育1-2h，将植物组织取出，用去离子水清洗3-5次，在激光共聚焦显微镜/荧光显微镜下观察植物组织细胞外的荧光分布情况。
第二方面，本发明提供LeadmiumTM Green AM新用途，所述用途为用于对植物细胞外的铅离子和/或镉离子进行特异性指示或示踪。
优选地，首先对LeadmiumTM Green AM进行改性，去掉其所带的AM基团得到不含AM基团的LeadmiumTM Green-，并配成溶液，使用该不含AM基团的LeadmiumTM Green-溶液对植物细胞外的铅离子和/或镉离子进行特异性指示或示踪。
优选地，还包括将LeadmiumTM Green AM和不含AM基团的LeadmiumTM Green-溶液联用，即将同一植物组织的同一部位分成两份，分别浸入LeadmiumTM Green AM溶液和不含AM基团的LeadmiumTM Green-溶液中，室温避光孵育1-2h，将两份植物组织取出，用去离子水清洗3-5次，在激光共聚焦显微镜/荧光显微镜下分别观察植物组织细胞内和细胞外的荧光分布情况。
(三)有益效果
本发明通过对LeadmuimTM Green AM进行改性预处理，去掉LeadmuimTM Green AM所带的AM基团，得到不含AM基团的LeadmiumTM Green-，利用LeadmiumTM Green-无法进入植物细胞内以及易于与质外体铅离子和/或镉离子相结合并产生荧光效应的特性，在一定波长的光照射下，通过荧光检测植物细胞外铅离子和/或镉离子的分布情况，由此实现了对植物质外体铅离子和/或镉离子的特异性示踪。
具体地，将LeadmuimTM Green AM粉末配成溶液，加入一定酯酶使LeadmuimTMGreen AM上的AM基团被水解，使其不能进入细胞内(共质体)，并且能够在体外结合铅、镉离子，从而达到特异指示植物细胞外(质外体)铅、镉离子的目的。
本发明操作简单，在实际应用中可以结合LeadmuimTM Green AM共同使用，同时指示植物细胞内(共质体)和细胞外(质外体)的铅、镉离子，对研究植物吸收、转运和积累铅、镉离子具有重要的促进意义。
附图说明
图1为分别使用LeadmuimTM Green AM溶液、去掉AM基团的Pre-Leadmium溶液、酯酶溶液与铅、镉离子反应，在荧光显微镜下观察的荧光情况。
图2为对照组(未用硝酸铅处理)和铅处理组的杨树根分别浸到LeadmuimTM GreenAM溶液、Pre-Leadmium溶液后，在荧光显微镜下观察的荧光情况。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明使用酯酶体外水解掉LeadmuimTM Green AM的AM基团，使该指示剂不能进入细胞内(共质体)，并且能够在体外结合铅、镉离子。预处理后的LeadmuimTM Green-，可应用于植物细胞外(质外体)铅离子和/或镉离子特异性示踪，开拓了LeadmuimTM Green AM的新用途，解决了特异性指示细胞外(质外体)铅、镉离子的科学难题。
以下结合具体实施例，对本发明的方案和技术效果说明。
实施例1
本实施例采用生化方法(酯酶)体外水解掉LeadmuimTM Green AM的AM基团。
试剂：LeadmuimTM Green AM(A10024,Invitrogen,Paisley,UK)
DMSO(D2650,Sigma,St Louis,USA)
酯酶(46058,Sigma,St Louis,USA)
水解LeadmuimTM Green AM的AM基团的方法为：
(1)取50μg LeadmuimTM Green AM粉末，加入10μL DMSO溶解，随后加入490μL去离子水，配成终浓度为100μg/mL的溶液。
(2)将酯酶粉末用去离子水配成100U/mL的溶液。
(3)取500μL LeadmuimTM Green AM溶液，加入100μL酯酶，混匀，25℃避光反应30min。
此混合液为预处理后的LeadmuimTM Green AM，命名为“Pre-Leadmium”，以下“Pre-Leadmium”均指该预处理后的LeadmuimTM Green AM或记作LeadmuimTM Green-。
本发明的实施例采用生化方法(酯酶)体外水解AM基团对LeadmuimTM Green AM进行改造，改造后的产物不残留任何对细胞有毒的因子。相比利用化学方法(如甲醇+氢氧化钾)，可避免使用化学试剂如甲醇或强碱等对植物细胞产生的毒害作用。同时，化学方法使用的有机溶剂(如甲醇)还会改变细胞膜通透性，导致细胞内和细胞外铅、镉离子分布发生改变。相对而言，酯酶广泛存在于在植物细胞内，外源酯酶对植物细胞活性和细胞膜的通透性几无影响。因此，本发明使用生化方法水解掉LeadmuimTM Green AM的AM基团，对植物细胞干扰小，从而能够更加准确的指示植物质外体中的铅、镉离子。
实施例2
本实施例验证“Pre-Leadmium”是否具有在细胞外结合铅离子并受激发光激发产生荧光的特性。
将实施例1制备的100μg/mL的LeadmuimTM Green AM溶液、实施例1制备的“Pre-Leadmium”和实施例1制备的100U/mL的酯酶分别取50μL滴加到载玻片上，随后，在载玻片上分别滴加20μL的硝酸铅溶液(50μmol/L)或氯化镉溶液(50μmol/L)。将载玻片室温避光反应5min，在荧光显微镜下观察荧光情况。
结果如图1所示，“LeadmiumTM Green AM+Pb/Cd”以及“酯酶+Pb/Cd”和均没有荧光，而“Pre-Leadmium+Pb/Cd”均有荧光，这说明了酯酶预处理后的LeadmuimTM Green AM(“Pre-Leadmium”)仍能够在体外和铅、镉离子结合，并发出荧光。而LeadmuimTM Green AM不能直接与铅、镉离子结合。
实施例3
本实施例为对Pre-Leadmium的应用，对杨树根质外体的铅进行示踪实验，实验方法如下：
(1)按照实施例1的方法准备100μg/mL的LeadmuimTM Green AM溶液、实施例1制备的“Pre-Leadmium”溶液，配制5mmol/L硝酸铅溶液、20mmol/L EDTA-Na2溶液(去离子水配制)。
(2)试验材料为灰杨(Populus×canescense)幼苗的根。将灰杨组培苗转移到8L营养液(1/4Hoagland)中培养1个月，随后在营养液中加入80mL 5mmol/L的硝酸铅溶液，进行铅处理。加入硝酸铅前将营养液中的磷酸二氢钾移除，防止出现铅沉淀。2天后，采集新鲜铅处理灰杨根尖和未处理的灰杨根尖，进行染色。
(3)将新鲜的灰杨根尖浸入10mL 20mmol/L的EDTA-Na2溶液中，室温静置1min，随后取出，用去离子水冲洗3次。
将根尖分为两部分，分别浸入LeadmuimTM Green AM溶液和Pre-Leadmium溶液中，室温避光静置1h，随后取出，用去离子水冲洗3次。利用激光共聚焦显微镜观察灰杨根尖上的荧光分布情况，激发光为488nm，接收光为505-545nm。
如图2所示，在对照根尖(未使用硝酸铅处理的)中并未发现荧光信号，但在铅处理的根尖中有明显的荧光信号，且LeadmuimTM Green AM染色结果和Pre-Leadmium染色结果存在明显差异。LeadmuimTM Green AM染色后，荧光信号主要分布在根尖顶端的细胞内，而Pre-Leadmium染色后，荧光信号主要分布在根尖中后部和根毛区的胞外空间。由此说明，Pre-Leadmium可与根尖细胞外的铅离子结合并可在激发光下产生荧光，因此能够用于特异性地指示植物细胞外铅、镉离子的分布情况。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，包括：
S1、先对Leadmium™ Green AM进行改性处理，去掉其连接的AM基团，得到不含AM基团的Leadmium™ Green-，并配成溶液；
S2、将植物组织与上述不含AM基团的Leadmium™ Green-溶液混合、避光孵育，孵育结束后，将植物组织取出，用波长为488nm的光照射植物组织，检测观察植物组织细胞外的荧光分布情况。
2.根据权利要求1所述的植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，S1的具体方法为：将Leadmium™ Green AM粉末加入溶剂进行溶解和稀释，然后加入酯酶，混匀、25℃避光反应。
3.根据权利要求1所述的植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，S1的具体方法为：取一定量Leadmium™ Green AM粉末，加入DMSO溶解，再加入去离子水定容，得到浓度为100 μg/mL的Leadmium™ Green AM溶液；将酯酶粉末用去离子水配成100 U/mL的溶液；按体积比5：1将Leadmium™ Green AM溶液与酯酶溶液混合均匀，25℃避光反应0.5-1h，得到不含AM基团的Leadmium™ Green-溶液。
4.根据权利要求1所述的植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，S2的具体方法为：先将植物组织浸泡在EDTA-Na2溶液中1-2min，取出用去离子水清洗3-5次，随后将植物组织浸没到不含AM基团的Leadmium™ Green-溶液中，室温避光孵育1-2h，将植物组织取出，用去离子水清洗3-5次，在激光共聚焦显微镜/荧光显微镜下观察植物组织细胞外的荧光分布情况。
5.LeadmiumTM Green AM新用途，其特征在于，所述用途为用于对植物细胞外的铅离子和/或镉离子进行特异性指示或示踪：首先对LeadmiumTM Green AM进行改性，去掉其所带的AM基团得到不含AM基团的Leadmium™ Green-，并配成溶液，使用该不含AM基团的Leadmium™ Green-溶液对植物细胞外的铅离子和/或镉离子进行特异性指示或示踪。
6.根据权利要求5所述的LeadmiumTM Green AM新用途，其特征在于，包括将LeadmiumTMGreen AM和不含AM基团的Leadmium™ Green-溶液联用，即将同一植物组织的同一部位分成两份，分别浸入LeadmiumTM Green AM溶液和不含AM基团的Leadmium™ Green-溶液中，室温避光孵育1-2h，将两份植物组织取出，用去离子水清洗3-5次，在激光共聚焦显微镜/荧光显微镜下分别观察植物组织细胞内和细胞外的荧光分布情况。
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