CN105259231B

CN105259231B - 用于土霉素检测的电化学适体电极及其制备方法

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Publication number: CN105259231B
Application number: CN201510090795.4A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 徐伟; 黄加栋; 刘素; 王虹智; 郭玉娜; 许颖; 邱婷婷; 崔洁
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2015-02-28
Filing date: 2015-02-28
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2035-02-28
Also published as: CN105259231A

Abstract

本发明提供了一种用于土霉素检测的电化学适体电极，包括玻碳电极，所述玻碳电极外表面从里到外依次附有还原石墨烯‑金纳米复合材料层，土霉素抗体层和牛血清白蛋白封闭层。同时提供了其制备方法，本发明制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中土霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。

Description

用于土霉素检测的电化学适体电极及其制备方法

技术领域

本发明涉及检测用传感器技术领域，特别涉及一种用于土霉素检测的电化学适体电极，还涉及所述电化学适体电极的制备方法。

背景技术

四环素类抗生素是广谱抗生素，已被广泛应用在农业的运作和人类医学中用于治疗传染性疾病。它们在低浓度中操作非常有效,并且仅仅在一个较短的时间后就可以完全从体内代谢出来。然而，过度使用四环素可能导致严重的过敏,在人类安全中的细菌抗性和食品中的安全问题。土霉素（OTC）是四环素中最经常被使用的成员之一。世贸组织（WTO）也对药物和食物中土霉素的最大残留量作了规定。最近报道的检测土霉素（OTC）的方法主要包括高效液相色谱法、荧光法，质谱法和其它方法等。但是这些方法通常比较费时间并且价格相对昂贵。

发明内容

为了解决以上现有技术中针对现有检测方法中检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺点，设计了基于核酸适配子的新型夹心构型的用于土霉素检测的电化学适体电极。

本发明还提供了所述电化学适体电极的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种用于土霉素检测的电化学适体电极，包括玻碳电极，所述玻碳电极外表面从里到外依次附有还原石墨烯-金纳米复合物（rGO-Au）层，土霉素抗体层和牛血清白蛋白（BSA）封闭层。

所述的电化学适体电极，优选还原石墨烯-金纳米复合物层的厚度为100±5 nm，土霉素抗体层的厚度为1 μm，BSA封闭层的厚度为500±5 nm。

优选地，电化学适体电极的制备方法，包括以下步骤：

（1）对玻碳电极进行处理洗涤，将氧化石墨烯滴加到电极表面，室温下干燥，用二次水冲洗；

（2）浸入氯金酸的硫酸溶液，利用循环伏安一步电还原氧化石墨烯和氯金酸，得到电极表面的还原石墨烯-金纳米复合物，用二次水冲洗，干燥；

（3）在表面滴加土霉素抗体的PBS缓冲液，37℃下孵育90 min；

（4）用0.5%的牛血清白蛋白封闭电极2 h，即得。

所述石墨烯-金纳米复合物是通过以下步骤得到的：

a）石墨粉经过氧化得到氧化石墨烯的制备；

b）氧化石墨烯同氯金酸按照一步电还原制备石墨烯-金纳米复合物。

所述的制备方法，优选步骤（3）中在表面滴加10 μL 溶解有100 μg·mL^-1 土霉素抗体（Ab）的PBS缓冲液，37℃下孵育90 min。

所述的制备方法，优选还原石墨烯-金纳米纳米复合物是通过以下步骤得到的：玻碳电极首先在0.3μm和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；将20 μL浓度为1.0 mg·mL^-1的氧化石墨烯滴加在已处理好的镜面裸电极上，干燥；之后电极浸入 10 mL 含有2.8 mM HAuCl₄和0.1 M的H₂SO₄溶液，通过循环伏安一步电化学共还原，得到rGO-Au。其循环伏安参数：电位设置为0.0 V到-1.5 V，扫描速率0.05 V/s。

所述的电化学适体电极通过金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物（Apt-Au-HRP）与土霉素特异结合，以放大信号。

优选地，所述金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物中，金纳米与核酸适配体以及辣根过氧化物酶的摩尔比为1:2000:50。

所述金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物是通过以下步骤得到的：

（1）金纳米复合物的制备：

使用机械搅拌装置，在冷凝回流条件下，还原HAuCl₄。具体方案如下：将200 mL浓度为0.01%的氯金酸溶液加热至沸，剧烈搅拌的条件下，快速地加入3 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15 min后，撤去热源，慢慢地冷却至室温，置于4℃保存。取60 μL金纳米颗粒溶液于微量比色皿，使用紫外可见分光光度计（对其进行光吸收波谱扫描，根据光吸收波长在530 nm处的摩尔消光系数3.0×10⁹ M^-1·cm^-1，计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3 nmol·L^-1（涉及到的所有玻璃仪器在使用之前，都用王水（V_盐酸：V_硝酸=3:1）浸泡一夜，超纯水清洗干净）。

（2）金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物的制备：

同时离心2 mL上述制备的金纳米溶液，除上清液，加入300 μL二次灭菌水，即浓缩为1 nmol·L^-1。然后一起移到玻璃瓶中，用0.1 molL^-1 NaOH溶液调节pH为8。取出300 μL转移到小玻璃瓶中加入磁子，边搅拌边标记：先加入3 μL浓度为5 μmol·L^-1 的辣根过氧化物酶（HRP酶）溶液，搅拌10 min后，放入4度冰箱，2 h后取出，再加入60 μL 10 μmol·L^-1 土霉素的核酸适配体（5′-CGA CGC ACA GTC GCT GGT GCG TAC CTG GTT GCC GTT GTG T-3′），边搅拌边加，搅拌10 min后，放入4度冰箱，过夜。过夜后，第二天取出来，边搅拌边加入40.33 μL 100 mmol·L^-1 磷酸缓冲液（PB），10 min后，边搅拌边加入13.90 μL磷酸盐缓冲液（PBS），加完后继续搅拌30 min，放入4度冰箱。过夜，第三天，观察颜色仍为紫红色。平均分成两部分，分别补充灭菌水至1 mL，在两个离心管中离心，除去上清液，各补充150 μL灭菌水，一起转移到玻璃瓶中。即得300 μL浓度为1 nmol·L^-1的金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物。其中，金纳米与核酸适配体以及辣根过氧化物酶的摩尔比为1:2000:50（小玻璃瓶和磁子都用王水浸泡，超纯水清洗干净）。

本发明的工作原理：

在玻碳电极上首先修饰增效物质还原石墨烯-金纳米复合物，不但能促进电极表面电子转移，而且增效物质之间的特殊基团的连接能保证它们的层层组装。金纳米粒子与土霉素抗体（Ab）的氨基，通过Au-NH₂的作用，把抗体修饰到电极上。然后，抗体（Ab）与土霉素有专一的识别能力，土霉素就能成功修饰到电极上。在土霉素的另一端，依靠金纳米标记有辣根过氧化物酶（HRP）的核酸适体（HRP-Apt）通过核酸适体与目标物的特异性识别能力，也被成功修饰。即，HRP被连接到电极上。在检测过程中，通过电极上的HRP催化检测底液中的对苯二酚（HQ）和双氧水（H₂O₂）的氧化还原产生电信号，连接电化学工作站，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.2 V到0.6 V，脉冲宽度0.05 V，脉冲宽度扫描为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，根据电极表面产生的电流的大小起到对目标物检测的作用。

本发明采用金纳米同时标记核酸适配体和HRP，在金纳米微球的表面能同时固定多个HRP。因此，通过标记，更多的HRP被修饰到电极上。电极上固定的HRP的量与修饰的被检测物土霉素的量有直接关系，被检测物越多，固定的HRP的量也越多，催化产生的电信号也越强。

本发明采用的石墨烯-金纳米纳米复合物导电性强，成为构建传感器的优良材料；使用辣根过氧化物酶（HRP），通过与H₂O₂和HQ的反应，放大信号；采用了夹心型的检测模型，分别在检测物OTC的两端引入抗体和适配体，检测更为灵敏；制备的传感器灵敏度高，检测速度快；检测OTC的方法，操作简单、快速、灵敏，便于现场检测。

本发明的有益效果：

1、由于使用玻碳电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用。

2、修饰层采用电化学一步还原，反应快速，操作简单。

3、反应层是使用表面修饰技术固定在工作电极上，优化使用材料的用量与浓度，制得的夹心型电极对环境温度的要求不明显，室温下使用即可。

4、信号层，采用金纳米同时标记核酸适配体和HRP，在金纳米微球的表面能同时固定多个HRP。

5、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中土霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。

6、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

7、以玻碳电极为固定载体固定基于核酸适配体的夹心型电化学传感系统，可实现对食品中土霉素的快速在线检测，根据线性方程，得出检出限为4.2×10^-7μg·mL^-1。

附图说明

图1为电化学适体电极的制备工艺流程图；

图2为电极的结构示意图；其中，1为玻碳电极、2为还原石墨烯-金纳米复合材料层；3为土霉素抗体层，4为牛血清白蛋白封闭层。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是实例性的，不限定本发明的保护范围。

首先制备石墨烯-金纳米纳米复合物（rGO-Au）和金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物（Apt-Au-HRP）的合成

1、石墨烯-金纳米纳米复合物（rGO-Au）的制备：

（1）氧化石墨烯（GO）的制备：

氧化石墨烯（GO）的制备是根据经典的方法。简而言之，1.0 g石墨粉加入到含有0.5 g 硝酸钠（NaNO₃）和3.0 g 高锰酸钾（KMnO₄）的质量分数98%的50 mL浓硫酸（H₂SO₄）中。温度低于20 ℃下，反应1 h，升温到35℃，继续搅拌30 min。然后缓慢加入约100 mL的离子水，持续搅拌20 min后，加入50 mL H₂O₂（30%），来还原残留的氧化剂，溶液渐渐变成亮黄色；趁热过滤，用HCl溶液和去离子水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止。沉淀物在60 ℃的恒温箱中干燥，最终得到GO。

（2）合成石墨烯-金纳米纳米复合物（rGO-Au）：

玻碳电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；20μL 1.0 mg·mL^-1氧化石墨烯滴加在已处理好的镜面裸电极上，干燥；之后电极浸入10 mL含有2.8 mmol·L^-1HAuCl₄和0.1 mol·L^-1的H₂SO₄溶液，通过循环伏安一步电化学共还原，得到rGO-Au。其中循环伏安参数：电位设置为0.0到-1.5 V，扫描速率0.05 V/s。

2、金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物（Apt-Au-HRP）的制备：

（1）金纳米复合物的制备：

使用机械搅拌装置，在冷凝回流条件下，还原HAuCl₄。具体方案如下：200 mL0.01%氯金酸溶液加热至沸，剧烈搅拌的条件下，快速地加入3 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15 min后，撤去热源，慢慢地冷却至室温，置于4℃保存。取60 μL金纳米颗粒溶液于微量比色皿，使用紫外可见分光光度计（对其进行光吸收波谱扫描，根据光吸收波长在530 nm处的摩尔消光系数3.0×10⁹ M^-1·cm^-1，计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3 nmol·L^-1。（涉及到的所有玻璃仪器在使用之前，都用王水（V_盐酸：V_硝酸=3:1）浸泡一夜，超纯水清洗干净）。

（2）标记过程：

同时离心2 mL上述制备的金纳米溶液，除上清液，加入300 μL二次灭菌水，即浓缩为1 nmol·L^-1。然后一起移到玻璃瓶中，用0.1 mol·L^-1 NaOH溶液调节pH约为8。取出300μL转移到小玻璃瓶中加入磁子，边搅拌边标记：先加入3 μL 5 μmolL^-1 HRP酶溶液，搅拌10min后，放入4度冰箱，2 h后取出，再加入60 μL 10 μmol·L^-1核酸适配体，边搅拌边加，搅拌10 min后，放入4度冰箱，过夜。过夜后，第二天取出来，边搅拌边加入40.33 μL 100 mmol·L^-1磷酸缓冲液（PB），10 min后，边搅拌边加入13.90 μL磷酸盐缓冲液（PBS），加完后继续搅拌30 min，放入4度冰箱。过夜，第三天，取出来，看颜色是否有变化。平均分成两部分，分别补充灭菌水至1 mL，在两个离心管中离心，除去上清液，各补充150 μL灭菌水，一起转移到玻璃瓶中。即得300 μL 1 nmol·L^-1的金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物。其中，金纳米与核酸适配体以及辣根过氧化物酶的摩尔比为1:2000:50。（小玻璃瓶和磁子都用王水浸泡，超纯水清洗干净）。

实施例1

一种本发明所述夹心型电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

a、玻碳电极1首先在0.3 μm和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；

b、10 μL 已经制备的GO滴加在电极表面，在室温下干燥过夜；修饰好的电极浸入10 mL 含有2.8 mM HAuCl₄和0.1 M的H₂SO₄溶液，通过循环伏安一步电化学共还原，得到rGO-Au复合物，得还原石墨烯-金纳米复合材料层2；其中循环伏安参数：电位设置为0.0 V到-1.5 V，扫描速率0.05 V/s；

c、待用二次水冲洗几次之后，将10 μL溶解有100 μg·mL^-1的土霉素抗体（Ab）的PBS溶液滴加在电极表面，37℃下保持90 min，用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的Ab，得土霉素抗体层；

d、20 μL BSA（0.5%）被用来封闭电极表面没有被结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层，即得夹心型电化学传感器。

检测方法如下：

e、所得电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在不同浓度待检测土霉素（OTC）溶液中孵育，并用PBS缓冲液冲洗；

f、将10 μL浓度为 1×10^-10mol·L^-1金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物（Apt-Au-HRP）通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面，孵育4 h；

g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.4 V到0.4 V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，检测目标物。

上述方法中所用的PBS缓冲液是由方法配制：称取Na₂HPO₄ 7.1 g，KCl 0.2 g和KH₂PO₄6.8 g，KCl 0.2 g分别溶于500 mL二次水中，得到两种溶液用pH计混合调整，得到pH值为7.4，浓度为0.01 mol·L^-1的PBS缓冲液。

实施例2

将10 μL溶解有100 μg·mL^-1土霉素抗体（Ab）的PBS溶液滴加在电极表面，室温下依次改变孵育时间（30，60，90，120，150，180 min），用二次水和PBS冲洗电极除去未结合的Ab，制作不同电极，用于选择Ab最佳的孵育时间，其他同实施例1。

通过优化实验，我们发现随孵育时间的增加，电流响应逐渐变大，直到90 min时，响应值近似达到饱和。因此选择90 min为Ab的最佳孵育时间。

实施例3

将10 μL 不同浓度的金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物（Apt-Au-HRP）（1×10^-12、5×10^-12、1×10^-11、5×10^-11、1×10^-10、5×10^-10、1×10^-9 mol·L^-1）通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面，孵育4 h，制作不同电极，用于选择Apt-Au-HRP的最适浓度，其他同实施例1。

通过优化实验，我们发现改变金标记的核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物的浓度，电流响应随着浓度增大而增大，5×10^-10 mol·L^-1时，响应值达到平台。因此选择5×10^-10 mol·L^-1作为金标记的核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物的最适浓度。

实施例4

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.4 V到0.4 V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，检测目标物。以检测电流为纵坐标，以不同土霉素（OTC）浓度为横坐标，用以绘制标准工作曲线。其他同实施例1。

在标准曲线实验中，电流响随OTC浓度增加逐渐变大，并与OTC浓度的对数值成一次线性关系，线性方程为I=5.19212+0.39476×logC_（OTC），相关系数为0.99133。良好的线性关系表明该探针设计的科学性和可应用性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于土霉素检测的电化学适体电极，其特征在于，包括玻碳电极，所述玻碳电极外表面从里到外依次附有还原石墨烯-金纳米复合材料层，土霉素抗体层和牛血清白蛋白封闭层；所述电化学适体电极，通过金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物与土霉素特异结合；

还原石墨烯-金纳米复合材料层是通过以下步骤得到的：

取20 μL 1.0 mg·mL^-1氧化石墨烯滴加在已处理好的玻碳电极上，干燥；之后电极浸入10 mL含有2.8 mM 氯金酸和0.1 M硫酸的溶液，通过循环伏安一步电化学共还原，得到还原石墨烯-金纳米复合材料层，其循环伏安参数：电位设置为0.0 V到-1.5 V，扫描速率0.05V/s。

2.根据权利要求1所述的电化学适体电极，其特征在于，所述的还原石墨烯-金纳米复合材料层的厚度为100±5 nm，土霉素抗体层的厚度为1μm，牛血清白蛋白层的厚度为500±5 nm。

3.一种权利要求1或2所述的电化学适体电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）浸入氯金酸的硫酸溶液，利用循环伏安一步电化学共还原氧化石墨烯和氯金酸，得到电极表面的还原石墨烯-金纳米复合材料层，用二次水冲洗，干燥；

（3）在表面滴加土霉素抗体的PBS缓冲液，37℃下孵育90 min；

（4）用0.5%的牛血清白蛋白封闭电极2 h，即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）的具体工艺为：在表面滴加10μL溶解有100 μg·mL^-1土霉素抗体的PBS缓冲液，37℃下孵育90 min。