CN110186975A - 用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学分析领域,特别是一种用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器及制备方法,其是利用双信号放大体系策略对食源性微生物特异基因片段进行痕量检测,在目标基因片段的存在下,从而实现第一步信号放大;第二DNA步行器打开第三探针后形成双链DNA,将通过二链置换被一端修饰二茂铁的第四探针解离以释放DNA步行器并用于下一个循环,从而实现第二步信号放大。本发明通过双倍信号放大技术提升检测效率,实现信号稳定性,降低目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段检测限,解决了现今对食源性病原体常规检测的周期长,操作繁杂的问题;提高了检测的准确性,有效的避免了假阳性检测;电化学传感器生产工艺简单,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于化学分析领域,特别涉及于微液滴中通过双DNA步行器策略对食源性微生物大肠杆菌O157:H7特异基因片段电化学检测的应用的用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器及制备方法。
背景技术
如今,食品质量问题引起了消费者,食品工业和食品安全检验机构的广泛关注。作为食品安全主要威胁的食源性微生物通常存在于各种食品中,例如蔬菜,水果和即食产品,这些食品可能引起人类疾病并对人类健康构成威胁。因此,准确识别和检测食源性微生物变得至关重要。平板计数,聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)是常规、可靠和准确的微生物检测方法。但是耗费劳动力,昂贵且耗时等缺点在很大程度上限制了其实施。因此,开发和设计灵敏,特异,可靠,快速且成本低的检测食源性微生物的方法迫在眉睫。
近年来,由于电化学传感方法的准确,成本低,信号稳定和小型化等特征,使其在检测食源性微生物方面得到越来越多的关注。为了满足选择性和灵敏度的要求,已经提出了多种信号放大策略,包括熵驱动催化,滚环扩增,催化发夹组装和DNA步行器等策略。其中,DNA步行器策略受到了科学界很多关注,因为其通过链置换、DNA酶和酶自主推进DNA步行器的运行可以实现对目标物超灵敏检测。据报道,DNA步行器与电化学传感结合,用于检测核酸和铜离子。不幸的是,这些电化学传感器灵敏度仍然有待提高,并且不能满足食源性微生物的检测要求。
生物仿生超亲水/超疏水微芯片具有出色的锚定微滴能力,对超痕量样品具有很好的富集效果。此外,传感过程在一个微液滴中完成,这减少了样品消耗。作为一个灵活的检测平台,超亲水/超疏水微芯片可以很容易地与不同的检测方法集成。
发明内容
本公开实施例公开了一种用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器及制备方法,以解决现有技术的上述以及其他潜在问题中任一问题。
为了达到上述目的,本公开实施例公开了一种用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器所述微液滴电化学传感器是利用双信号放大体系策略对食源性微生物特异基因片段进行痕量检测,所述双信号放大体系包括第一信号放大体系和第一信号放大体系;
所述第一信号放大体系,用于在目标基因片段的存在下,被阻断的第一探针被激活作为第一DNA步行器,在切刻内切酶辅助下,导致第二探针部分序列被释放并作为第二DNA步行器,从而实现第一步信号放大;
所述第二信号放大体系,用于在第二DNA步行器打开一端修饰巯基的第三探针的发夹结构后形成双链DNA,此双链DNA将通过二链置换被一端修饰二茂铁的第四探针解离以释放第二DNA步行器并用于下一个循环,从而实现第二步信号放大。
根据本公开实施例,所述微液滴电化学传感器包括:
所述第一信号放大体系包括第一探针、第二探针、阻断DNA和链霉亲和素磁珠;
所述第二信号放大体系包括第三探针、第四探针和超疏水金电极;
所述第一信号放大体系包括第一探针、第二探针、阻断DNA和链霉亲和素磁珠;
其中,所述第一DNA步行器由第一探针、第二探针和阻断DNA包覆在所述链霉亲和素磁珠的表面形成;
所述阻断DNA为将第一探针的可与第二探针结合形成酶识别位点的部分序列保护起来的单链DNA;
根据本公开实施例,所述超疏水金电极自上而下依次为:ITO导电玻璃、基础层、纳米结构金层、超疏水表面,所述超疏水表面设置有亲水微孔。
根据本公开实施例,所述基础层包括钛层和平面金层;所述钛层和平面金层通过磁控溅射方法修饰到所述ITO导电玻璃的导电一侧。
根据本公开实施例,所述纳米结构金层用电化学沉积方法修饰于所述平面金层。
本公开实施例的另一目的是公开一种制备上述的微液滴电化学传感器的方法,所述方法包括以下步骤:
S1)第一信号放大体系制备:首先在浓度为0.3-1 M / L的缓冲液中加入阻断DNA和第一探针的混合溶液中,阻断DNA和第一探针的浓度比为3/1-5/1;反应后形成双链DNA,然后,将获得的双链DNA和第二探针按照浓度比为1/8~1/10同时加入到浓度为0.5~2mg / mL链霉亲和素磁珠的磷酸缓冲盐溶液中,常温下反应后通过磁力分离,得到第一信号放大体系;
S2)金电极制备:选取ITO导电玻璃,然后依次将基础层、纳米结构金层和超疏水表面覆盖在所述ITO导电玻璃,即得到超疏水金电极;
S3)第二信号放大体系制备:将0.1~1μM的第三探针加到S2)得到的超疏水金电极的微孔上并在室温下反应,然后用超纯水冲洗未修饰上的第三探针,然后,将可通过静电吸附或者Au-S键对未结合上第三探针的区域进行封堵的封堵物滴在微孔上反应以封闭未被第三探针结合的区域,然后用超纯水冲洗并用氮气干燥,即得到微液滴电化学传感器。
根据本公开实施例,所述S2)的具体工艺为:
S2.1),将玻璃基板在丙酮,乙醇和超纯水中分别超声处理后用氮气将其干燥,然后依次将钛和金溅射到清洁过的ITO导电一面上,以ITO玻璃基板作为工作电极,Pt线作为对电极并且 Ag /AgCl线作为参比电极在1.5 V电压下通过电化学沉积方法得到超亲水纳米结构金基底,电沉积时间为1500-1600s,沉积液为1 mg/mL氯金酸溶液,用乙醇和超纯水冲洗得到的超亲水纳米结构金基底备用;
S2.2将超亲水纳米结构金基底浸入叔十二硫醇溶液中密封反应至少24小时后,分别用乙醇和超纯水冲洗未修饰上的硫醇,自然风干后得到超疏水纳米结构金基底;
S2.3将含有直径为1 mm圆孔的铝质掩膜板盖在S2.2得到超疏水纳米结构金基底上并用长尾夹夹紧,放于等离子体处理仪中,在功率参数80~100 W下,处理100~120 s,圆孔处的硫醇被分解掉形成亲水位点;即得到出金电极。
根据本公开实施例,所述叔十二硫醇溶液包括叔十二硫醇和乙醇,所述叔十二硫醇和乙醇二者的比例为V/V=1:8。
根据本公开实施例,所述S1中的缓冲液为柠檬酸钠。
根据本公开实施例,所述封堵物为牛血清蛋白或巯基己醇。
一种利用所述微液滴电化学传感器用于食源性微生物检测的检测方法,具体提包括以下步骤:
首先,将待检测样品溶液加入到第一信号放大体系中,并在35℃~37℃下反应2~2.5小时,当链霉亲和素磁珠上的第一探针被激活后,作为第一DNA步行器在切刻内切酶Nt.BsmA1的推动下沿着第二探针运动,导致第二探针部分序列被释放并作为第二DNA步行器,得到含有第二DNA步行器的上清液;
其次,将得到含有第二DNA步行器的上清液与含有1.5~2.5 μM 第四探针的缓冲液同时滴在第二信号放大体系的金电极的微孔上,并在35℃~37℃下反应1~1.2 h;
最后,第二信号放大体系的第三探针和第四探针不断互补,产生二茂铁峰电流信号电化学信号电压,在0 V至0.25 V之间变化,若二茂铁峰电流信号在0.07~0.08 V处增加,则表示待检测样品溶液中含有被检测物,否则不含有。
根据本公开实施例,所述被检测物为食源性病原体特异基因片段。
本发明的有益效果为:由于采用上述技术方案,本发明通过微液滴中的双DNA步行器在金电极上对食源性病原体特异基因片段进行灵敏检测;该发明通过双倍信号放大技术提升检测效率,实现信号稳定性,降低目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段检测限,解决了现今对食源性病原体常规检测的周期长,操作繁杂的问题;检测结果提高了检测的准确性,有效的避免了假阳性检测;电化学传感器生产工艺简单,应用前景广阔。
附图说明
图1所示为纳米结构金基底扫描电镜表征图。
图2所示为超亲水/超疏水纳米结构金基底图。
图3所示为超疏水纳米结构金基底图。
图4所示为等离子体处理后的超亲水纳米结构金基底图。
图5所示为此方法在金电极上反应的电化学阻抗(EIS)表征图。
图6所示为在不同扫描速率:(a) 10, (b) 25, (c) 50, (d) 75, (e) 100, (f)125, (g) 150mV下金电极的典型循环伏安图。
图7所示为研究纳米结构金对电化学检测影响的循环伏安图。
图8所示为电化学信号受切刻内切酶Nt.BsmA1浓度的影响图。
图9所示为电化学信号受第三探针浓度影响图。
图10所示为电化学信号受第四探针浓度影响图。
图11所示为检测不同浓度:(a) 0, (b) 30 am, (c) 0.3 fm, (d) 3 fm, (e) 30fm, (f) 0.3 pm, (g) 0.3 nm的目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段的差分脉冲伏安法标准曲线图。
图12所示为电化学信号与目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段浓度的对数之间的线性关系图。
图13所示为特异性分析图。
图14所示为电化学传感器信号稳定性图。
图15所示为在实际样品中检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段图。
图16所示为基底制备过程及双DNA步行器实验原理图。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是,下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的,它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。在下述实施例的附图中,各附图所出现的相同标号代表相同的特征或者部件,可应用于不同实施例中。
本发明一种用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器,所述微液滴电化学传感器是利用双信号放大体系策略对食源性微生物特异基因片段进行痕量检测,所述双信号放大体系包括第一信号放大体系和第二信号放大体系;
所述第一信号放大体系,用于在目标基因片段的存在下,被阻断的第一探针被激活作为第一DNA步行器,在切刻内切酶辅助下,导致第二探针部分序列被释放并作为第二DNA步行器,从而实现第一步信号放大;
所述第二信号放大体系,用于在第二DNA步行器打开一端修饰巯基的第三探针的发夹结构后形成双链DNA,此双链DNA将通过二链置换被一端修饰二茂铁的第四探针解离以第二释放DNA步行器并用于下一个循环,从而实现第二步信号放大。
根据本公开实施例,所述微液滴电化学传感器包括:
所述第一信号放大体系包括第一探针、第二探针、阻断DNA和链霉亲和素磁珠;
所述第二信号放大体系包括第三探针、第四探针和超疏水金电极;
所述第一信号放大体系包括第一探针、第二探针、阻断DNA和链霉亲和素磁珠;
其中,所述第一DNA步行器由第一探针、第二探针和阻断DNA包覆在所述链霉亲和素磁珠的表面形成;
所述阻断DNA为将第一探针的可与第二探针结合形成酶识别位点的部分序列保护起来的单链DNA;
根据本公开实施例,所述超疏水金电极自上而下依次为:ITO导电玻璃、基础层、纳米结构金层、超疏水表面,所述超疏水表面设置有亲水微孔。
根据本公开实施例,所述基础层包括钛层和平面金层;所述钛层和平面金层通过磁控溅射方法修饰到所述ITO导电玻璃的导电一侧。
根据本公开实施例,所述纳米结构金层用电化学沉积方法修饰于所述平面金层。
本公开实施例的另一目的是公开一种制备上述的微液滴电化学传感器的方法,所述方法包括以下步骤:
S1)第一信号放大体系制备:首先在浓度为0.3-1 M / L的缓冲液中加入阻断DNA和第一探针的混合溶液中,阻断DNA和第一探针的浓度比为3/1-5/1;反应后形成双链DNA,然后,将获得的双链DNA和第二探针按照浓度比为1/8~1/10同时加入到浓度为0.5~2mg / mL链霉亲和素磁珠的磷酸缓冲盐溶液中,常温下反应后通过磁力分离,得到第一信号放大体系;
S2)金电极制备:选取ITO导电玻璃,然后依次将基础层、纳米结构金层和超疏水表面覆盖在所述ITO导电玻璃,即得到超疏水金电极;
S3)第二信号放大体系制备:将0.1~1μM的第三探针加到S2)得到的超疏水金电极的微孔上并在室温下反应,然后用超纯水冲洗未修饰上的第三探针,然后,将可通过静电吸附或者Au-S键对未结合上第三探针的区域进行封堵的封堵物滴在微孔上反应以封闭未被第三探针结合的区域,然后用超纯水冲洗并用氮气干燥,即得到微液滴电化学传感器。
根据本公开实施例,所述S2)的具体工艺为:
S2.1),将玻璃基板在丙酮,乙醇和超纯水中分别超声处理后用氮气将其干燥,然后依次将钛和金溅射到清洁过的ITO导电一面上,以ITO玻璃基板作为工作电极,Pt线作为对电极并且 Ag /AgCl线作为参比电极在1.5 V电压下通过电化学沉积方法得到超亲水纳米结构金基底,电沉积时间为1500-1600s,沉积液为1 mg/mL氯金酸溶液,用乙醇和超纯水冲洗得到的超亲水纳米结构金基底备用;
S2.2将超亲水纳米结构金基底浸入叔十二硫醇溶液中密封反应至少24小时后,分别用乙醇和超纯水冲洗未修饰上的硫醇,自然风干后得到超疏水纳米结构金基底;
S2.3将含有直径为1 mm圆孔的铝质掩膜板盖在S2.2得到超疏水纳米结构金基底上并用长尾夹夹紧,放于等离子体处理仪中,在功率参数80~100 W下,处理100~120 s,圆孔处的硫醇被分解掉形成亲水位点;即得到出金电极。
根据本公开实施例,所述叔十二硫醇溶液包括叔十二硫醇和乙醇,所述叔十二硫醇和乙醇二者的比例为V/V=1:8。
根据本公开实施例,所述S1中的缓冲液为柠檬酸钠。
根据本公开实施例,所述封堵物为牛血清蛋白或巯基己醇。
一种利用所述微液滴电化学传感器的检测方法,具体提包括以下步骤:
首先,将待检测样品溶液加入到第一信号放大体系中,并在35℃~37℃下反应2~2.5小时,当链霉亲和素磁珠上的第一探针被激活后,作为第一DNA步行器在切刻内切酶Nt.BsmA1的推动下沿着第二探针运动,导致第二探针部分序列被释放并作为第二DNA步行器,得到含有第二DNA步行器的上清液;
其次,将得到含有第二DNA步行器的上清液与含有1.5~2.5 μM 第四探针的缓冲液同时滴在第二信号放大体系的金电极的微孔上,并在35℃~37℃下反应1~1.2 h;
最后,第信号放大体系的第三探针和第四探针不断互补,产生二茂铁峰电流信号电化学信号电压,在0 V至0.25 V之间变化,若二茂铁峰电流信号在0.07~0.08 V处增加,则表示待检测样品溶液中含有被检测物,否则不含有。
根据本公开实施例,所述被检测物为食源性病原体特异基因片段。
下述发明实施例为解决现今电化学传感器灵敏度低,并且不能满足食源性微生物检测的要求等问题。
实施例1
1、第一步信号放大体系制备:第一DNA步行器是在链霉亲和素磁珠上产生的。 简而言之,首先在柠檬酸钠(0.5 M / L)中将4 μL阻断DNA(1.5 μM)和1μL第一探针(1.5 μM)在37℃反应2小时以形成双链DNA。然后,将获得的双链DNA,20 μL第二探针(1.5 μM)同时加入到20 μL,1 mg / mL的链霉亲和素磁珠的磷酸缓冲盐溶液中。常温下反应2小时后通过磁力分离得到磁珠体系备用。
2、金电极制备:将ITO玻璃基板(0.5 cm×2 cm)在丙酮,乙醇和超纯水中分别超声处理30分钟后用氮气将其干燥。然后依次将钛和金溅射到清洁过的ITO导电一面上。以ITO玻璃基板作为工作电极,Pt线作为对电极并且 Ag /AgCl线作为参比电极在1.5 V电压下通过电化学沉积方法得到超亲水纳米结构金基底,其具有明显的树枝状结构(图1),电沉积时间为1600 s。沉积液为1 mg/mL氯金酸溶液,用乙醇和超纯水冲洗得到的超亲水纳米结构金基底备用。为了制备金电极(图2),将超亲水纳米结构金基底浸入叔十二硫醇溶液(叔十二硫醇:乙醇,V/V=1:8)中密封反应24小时后,分别用乙醇和超纯水冲洗未修饰上的硫醇。自然风干后得到超疏水纳米结构金基底(图3)。将订制的含有1 mm圆孔的铝质掩膜版盖在超疏水纳米结构金基底上并用长尾夹夹紧,放于等离子体处理仪中,在功率参数100 W下,处理120 s,圆孔处的硫醇被分解掉形成亲水位点(图4)。由此制备出金电极(图2)。
3、第二步信号放大体系制备:在金电极的亲水微孔上进行第二步信号放大反应。简言之,将4 μL溶于Tris缓冲液(10 mM Tris-HCl,15 mM KCl,4 mM MgCl 2,pH7.4)的0.5 μM第三探针滴加到微孔上并在室温下反应12小时,然后用超纯水冲洗未修饰上的的第三探针。然后,将4 μL1%的牛血清蛋白溶液滴在微孔上反应20分钟以封闭未被第三探针结合的区域,然后用超纯水冲洗并用氮气干燥以供进一步使用。
4、通过双DNA步行器策略检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段:为了检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段,将含有不同浓度目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段的2μL样品溶液加入到第一步DNA步行器放大体系中,并在37℃下反应2小时。通过磁力分离收集得到含有第二DNA步行器的上清液。将2 μL含有第二DNA步行器的上清液与2 μL含有2 μM第四探针的Tris缓冲液同时滴在第二步放大体系的金电极的微孔上,并在37℃下反应1 h。将其作为工作电极,Pt线作为对电极和Ag / AgCl参比电极组成的三电极系统,通过差分脉冲伏安法在磷酸缓冲盐溶液中记录电化学信号(图11), 电压在0 V至0.25 V之间变化,电化学信号随着目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段浓度增大而增加。
在金电极上通过微液滴中的双DNA步行器检测可行性判断及优化分析:
(1)纳米金电极的EIS表征:EIS可作为研究双DNA步行器可行性的进一步证据,它可以通过电子转移电阻(Rct)和EIS图中半圆部分的直径反映电极的界面特性。也就是说,直径越大,Rct值越强。在10mV下记录100kHz和0.01Hz之间的电化学阻抗谱(EIS)的测量值(图5)。与纳米结构金电极相比,纳米结构金 / 第三探针电极的Rct增加至50.73 Ω,这表明纳米金电极表面上的带负电的第三探针阻挡了电子转移。在第四探针和第二DNA步行器存在下,纳米Au / 第三探针 / 第四探针 /DNA 步行器电极的Rct进一步急剧增加至167.2 Ω,表明在第二DNA步行器存在下第三探针和第四探针之间可成功杂交。
(2)在不同扫描速率下纳米金电极的典型循环伏安图(图6):10,25,50,75,100,125和150 mV / s(从内到外),随着扫描速率的增加,峰值电流明显增加,并且线性地依赖于扫描速率。
(3)研究纳米结构金对电化学检测的影响:采用三电极体系,纳米结构金基底为工作电极,Pt线作为对电极和Ag / AgCl参比电极,在工作电极滴加一滴检测液(包含0.1 MKCL和5 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.01 M的磷酸盐缓冲液)进行循环伏安扫描,对比导电玻璃,平面金,基底的电化学信号(图7),三个基底都可测出完整的循环伏安曲线,纳米结构金基底电化学信号相比于导电玻璃和平面金基底有明显增强,说明纳米结构金相对较大的比表面积提高了在电化学检测的灵敏度和检测限。
(4)优化实验条件:为了获得最佳的传感性能,优化了包括切刻内切酶Nt.BsmA1,第三探针和第四探针浓度的实验条件。切刻内切酶Nt.BsmA1的浓度影响酶剪切反应效率,进而影响电化学信号。随着切刻内切酶Nt.BsmA1浓度升高,二茂铁峰电流信号增加,在500U达到最大值,之后由非特异性酶剪切引起信号降低(图8)。随着第三探针浓度的增加并达到0.5 μM,二茂铁峰电流信号显着增加,然后达到最大值并趋于稳定(图9)。 此外,当第四探针浓度达到1 μM时,二茂铁峰电流信号明显增加并达到最大值。由于空间位阻效应,二茂铁峰电流信号将随着第四探针浓度的增加而降低(图10)。因此选择最佳条件500 U,0.5 μM和1 μM用于以下实验。
(5)原则上,双DNA步行器应表明优异的序列特异性,以评估双DNA步行器的选择性,在相同条件下检测非特异性的食源性微生物特异基因片段包括(沙门氏菌(S.)、伤寒特异基因片段(b)、沙门氏菌肠炎沙门氏菌特异基因片段(c)、李斯特菌单核细胞增生李斯特氏菌特异基因片段(d)鼠伤寒沙门氏菌特异基因片段(e)。当存在上述四种食源性微生物特异基因片段的情况下,二茂铁峰电流信号没有显着的信号变化。然而,当检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段时,二茂铁峰电流信号显著增加(f),此结果显示出双DNA步行器电化学传感器具有优良的序列特异性(图13)。当在4 ℃下储存电化学传感器并通过DPV测定时,双DNA步行器电化学传感器可以稳定检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段达15天(图14)。
(6)在实际样品中检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段:上述报道的相同双DNA步行器电化学传感器在新鲜桃和牛奶的提取物中进行测试,这些食品购自当地超市以评估其在真实生物样品中定量目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段的能力。两种提取物分别稀释10倍,然后加入目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段,形成0.3 nM真实生物样品。如图15所示,记录了DPV结果,表明与杂交缓冲液中目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段的结果相比,对结果几乎没有影响。结果证明双DNA步行器电化学传感器在检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段浓度时具有足够的灵敏度。
实施例2
双DNA步行器电化学传感器检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段:
(1)检测原理:本设计原理在方案中被详细说明,本方案是一种基于双DNA步行器的电化学传感器,用于目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段检测。基底制备过程如方案所示,超亲水/超疏水金电极自上而下依次包括:ITO导电玻璃、基础层、纳米结构金层、超疏水表面,超疏水表面设置有亲水微孔。基础层包括钛层、平面金层,均是通过磁控溅射方法修饰到ITO导电玻璃导电一侧,再通过电化学沉积方法将纳米结构金层修饰于平面金层上。然后对所述纳米结构金基底进行超疏水处理,得到超疏水表面,最后通过掩膜版法用等离子体刻蚀超疏水表面,得到亲水微孔,从而制备超亲水/超疏水金电极。所述的纳米结构金基底具有明显的树枝状结构的纳米结构金,从而可以增加检测灵敏度。所述的亲水微孔对微液滴具有富集效应,有助降低实验检测线。基底制备过程结束后,进行双DNA步行器实验,如方案所示,第一探针首先被阻断DNA保护形成双链DNA,然后通过链霉亲和素蛋白和生物素之间的强特异性结合作用力将获得的双链DNA和第二探针与链霉亲和素磁珠连接。在目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段的存在下,被阻断的第一探针被激活并与第二探针部分碱基序列杂交出现酶识别位点,然后在切刻内切酶Nt.BsmA1辅助下,导致第二探针部分序列被释放并作为第二DNA步行器,从而实现第一步信号放大。一端修饰巯基的发卡结构DNA(第三探针)通过Au-S键共价修饰在金电极的微孔中。在第二DNA步行器打开第三探针的发夹结构后,以超疏水纳米金电极亲水微孔中的发夹结构第三探针作为轨道,牛血清蛋白封闭未被第三探针结合的区域。在没有第二DNA步行器的情况下,第三探针和第四探针存在位阻效应。当第二DNA步行器存在时,第三探针的发夹结构被打开,形成具有暴露粘性末端第三探针/DNA步行器的双链DNA。具有暴露的粘性末端的第三探针/DNA步行器双链DNA将通过二链置换被第四探针解离以释放DNA步行器用于下一个循环,从而导致第二步信号放大。经过几个循环后,导致二茂铁峰电流信号峰在0.078 V处突然增加。相反,没有目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段时,几乎没有明显的二茂铁峰电流信号,因为第三探针和第四探针存在位阻效应。由此实现目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段的痕量检测。
(2)检测步骤:为了检测目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段,将含有不同浓度目标大肠杆菌O157:H7特异基因片段(浓度分别为0.30 aM,0.3 fM,3.0 fM,30 fM,0.3 fM,0.3 nM)的2 μL样品溶液加入到第一步DNA步行器放大体系中,并在37℃下反应2小时。通过磁力分离收集得到含有第二DNA步行器的上清液。将2 μL含有第二DNA步行器的上清液与2μL含有2 μM 第四探针的Tris缓冲液同时滴在第二步放大体系的金电极的微孔上,充分混匀,并在37℃下反应1 h后用超纯水流冲洗亲水微孔。将反应后电极作为工作电极,Pt线作为对电极和Ag / AgCl参比电极组成的三电极系统,通过差分脉冲伏安法(DPV)在磷酸缓冲盐溶液中记录电化学信号(图11),电压在0 V至0.25 V之间变化,并且存在很好的线性(图12)。
所述标志物为食源性病原体特异基因片段,其在真实样品中均能得到理想的检测结果。
本公开实施例开发了微液滴中的双DNA步行器,用于食源性微生物大肠杆菌O157:H7特异基因片段的灵敏电化学检测。第一DNA步行器是在链霉亲和素蛋白包被的磁珠上产生的,其上覆有第一探针和第二探针。第一探针首先被阻断DNA保护并在加入大肠杆菌O157:H7特异基因片段后被激活,激活后的第一探针作为第一DNA步行器在切刻内切酶Nt.BsmA1的推动下沿着第二探针运动。在酶切作用下,第二探针部分序列被释放并作为第二DNA步行器,至此实现第一步信号放大。一端修饰巯基的发卡第三探针通过Au-S键共价修饰在金电极亲水微孔中,在第二DNA步行器打开第三探针的发夹结构后,具有暴露的粘性末端的第三探针/DNA步行器双链DNA将通过二链置换被一端修饰二茂铁的发夹第四探针解离以释放DNA步行器用于下一个循环,从而导致第二步信号放大。这种方法为食源性微生物的早期诊断提供了稳定,简单和超灵敏的新平台。
本文虽然已经给出了本发明的几个实施例,但是本领域的技术人员应当理解,在不脱离本发明精神的情况下,可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的,不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (10)
1.一种用于食源性微生物检测的微液滴电化学传感器,其特征在于,所述微液滴电化学传感器是利用双信号放大体系策略对食源性微生物特异基因片段进行痕量检测,所述双信号放大体系包括第一信号放大体系和第二信号放大体系;
所述第一信号放大体系,用于在目标基因片段的存在下,被阻断的第一探针被激活作为第一DNA步行器,在切刻内切酶辅助下,导致第二探针部分序列被释放并作为第二DNA步行器,从而实现第一步信号放大;
所述第二信号放大体系,用于在第二DNA步行器打开一端修饰巯基的第三探针的发夹结构后形成双链DNA,此双链DNA将通过二链置换被一端修饰二茂铁的第四探针解离以释放第二DNA步行器并用于下一个循环,从而实现第二步信号放大。
2.根据权利要求1所述的微液滴电化学传感器,其特征在于,所述第一信号放大体系包括第一探针、第二探针、阻断DNA和链霉亲和素磁珠;
所述第二信号放大体系包括第三探针、第四探针和超疏水金电极;
其中,所述第一DNA步行器由第一探针、第二探针和阻断DNA包覆在所述链霉亲和素磁珠的表面形成;
所述阻断DNA为将第一探针的可与第二探针结合形成酶识别位点的部分序列保护起来的单链DNA。
3.根据权利要求2所述的微液滴电化学传感器,其特征在于,所述第三探针和第四探针均设置在所述超疏水金电极的表面;所述第三探针和第四探针均为发卡结构。
4.根据权利要求2所述的微液滴电化学传感器,其特征在于,所述超疏水金电极自上而下依次为:ITO导电玻璃、基础层、纳米结构金层和超疏水表面,所述超疏水表面设置有亲水微孔。
5.据权利要求4所述的微液滴电化学传感器,其特征在于,所述基础层包括钛层和平面金层;所述钛层和平面金层通过磁控溅射方法修饰到所述ITO导电玻璃的导电一侧。
6.据权利要求4所述的微液滴电化学传感器,其特征在于,所述纳米结构金层用电化学沉积方法修饰于所述平面金层。
7.一种制备如权利要求1-6任意一项所述的微液滴电化学传感器的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
S1)第一信号放大体系制备:首先在浓度为0.3-1 M / L的缓冲液中加入阻断DNA和第一探针的混合溶液中,阻断DNA和第一探针的浓度比为3-5:1;反应后形成双链DNA,然后,将获得的双链DNA和第二探针按照浓度比为1:8-10同时加入到浓度为0.5~2mg / mL链霉亲和素磁珠的磷酸缓冲盐溶液中,常温下反应后通过磁力分离,得到第一信号放大体系;
S2)超疏水金电极制备:选取ITO导电玻璃,然后依次将基础层、纳米结构金层和超疏水表面覆盖在所述ITO导电玻璃,即得到超疏水金电极;
S3)第二信号放大体系制备:将0.1~1μM的第三探针加到S2)得到的超疏水金电极的微孔上并在室温下反应,再用超纯水冲洗未修饰上的第三探针,将可通过静电吸附或者Au-S键对未结合上第三探针的区域进行封堵的封堵物滴在微孔上反应以封闭未被第三探针结合的区域,
最后用超纯水冲洗并用氮气干燥,即得到微液滴电化学传感器。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述S2)的具体工艺为:
S2.1)将玻璃基板在丙酮,乙醇和超纯水中分别超声处理后用氮气将其干燥,然后依次将钛和金溅射到清洁过的ITO导电玻璃的导电一面上,以ITO导电玻璃作为工作电极,Pt线作为对电极并且 Ag /AgCl线作为参比电极在1.4~1.8V电压下通过电化学沉积方法得到超亲水纳米结构金基底,电沉积时间为1500-1600s,沉积液为1 mg/mL氯金酸溶液,用乙醇和超纯水冲洗得到的超亲水纳米结构金基底备用;
S2.2)将超亲水纳米结构金基底浸入叔十二硫醇溶液中密封反应至少24小时后,分别用乙醇和超纯水冲洗未修饰上的硫醇,自然风干后得到超疏水纳米结构金基底;
S2.3)将含有直径为1 mm的微孔的铝质掩膜板盖在S2.2得到超疏水纳米结构金基底上并用长尾夹夹紧,放于等离子体处理仪中,在功率参数80~100 W下,处理100~120 s,微孔处的硫醇被分解掉形成亲水位点;即得到超疏水金电极。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述叔十二硫醇溶液包括叔十二硫醇和乙醇,所述叔十二硫醇和乙醇二者的体积比为1:8。
10.一种利用如权利要求1-6任意一项所述的微液滴电化学传感器对食源性微生物特异基因片段进行痕量检测方法,其特征在于,所述检测方法具体提包括以下步骤:
首先,将待检测样品溶液加入到第一信号放大体系中,并在35℃~37℃下反应2~2.5小时,当链霉亲和素磁珠上的第一探针被激活后,作为第一DNA步行器在切刻内切酶Nt.BsmA1的推动下沿着第二探针运动,导致第二探针部分序列被释放并作为第二DNA步行器,得到含有第二DNA步行器的上清液;
其次,将得到含有第二DNA步行器的上清液与含有浓度为1.5~2.5 μM 第四探针的Tris缓冲液同时滴在第二信号放大体系的金电极的微孔上,并在35℃~37℃下反应1~1.2 h;
最后,第二信号放大体系的第三探针和第四探针不断互补,产生二茂铁峰电流信号电化学信号电压,在0 V至0.25 V之间变化,若二茂铁峰电流信号在0.07~0.08 V处增加,则表示待检测样品溶液中含有被检测物,否则不含有。
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