CN112432980A - 基于dna步行器和纳米花结构的致病菌电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于DNA步行器和纳米花结构的致病菌电化学检测方法，属于检测技术领域。本发明通过在电极表面修饰DNA步行器，当目标物存在时释放大量游离滚环扩增引物，随后的滚环扩增反应诱导DNA纳米花的形成，增大电极表面有效面积，放大检测信号，有效提高检测灵敏度。而当溶液中不存在目标物时，DNA步行器在核酸外切酶III的诱导下水解滚环扩增引物，降低背景信号，拓宽传感器的检测范围。

Description

基于DNA步行器和纳米花结构的致病菌电化学检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于DNA步行器和纳米花结构的致病菌电化学检测方法，属于检测技术领域。
背景技术
致病菌(Pathogenic bacteria)是能引起疾病的微生物，也被称为病原微生物。其中，金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种广泛存在于环境中的食源性致病菌。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素可引起食物中毒和各种感染。传统的金黄色葡萄球菌检测方法具有较高的灵敏度和特异性，但存在耗时长、操作复杂等缺点。因此，构建一种准确、简便的金黄色葡萄球菌检测方法已成为当务之急。
生物传感器作为一种新型检测手段具有高灵敏度，高特异性，被广泛应用于疾病诊断、食品安全和环境监测等。根据传感器检测信号的不同，可分为光学传感器、电化学传感器等。电化学生物传感器由于满足了高灵敏度、高选择性和良好稳定性的检测要求而受到广泛关注。电化学生物传感器的性能受固定层的理化性质和修饰工艺的影响。寻找合适的修饰材料和工艺对提高电化学生物传感器的检测灵敏度、重复性和稳定性有很大的帮助。为了提高电化学生物传感器的灵敏度，人们开发了许多性能和可靠性都很好的放大策略。其中，基于DNA步行器的信号放大方法因其结构简单、易于合成、序列可预见性和可编程性而受到广泛关注。DNA步行器是一种受环境刺激、酶反应或链置换反应驱动的纳米级分子器件。它可以沿着部分或全部核酸组成的DNA轨道进行重复的机械循环运动，实现信号级联放大。与生物传感器相结合，DNA步行器是一种基于环境刺激、酶反应或链置换反应的纳米级分子器件，它可以沿着部分或全部核酸组成的DNA轨道进行重复机械循环运动，实现信号级联放大。靶标结合可以触发DNA组分的改变，然后通过酶介导的DNA底物水解或脚趾介导的链置换进行重复的DNA杂交。最后，靶标结合诱导的DNA步行器可以激活数百个信号分子来响应单个高度特异的结合，这为设计信号放大方法提供了一个很有前途的工具。
纳米技术的结合还可以有效提高生物传感器的性能，有助于开发新型生物传感器。纳米材料的小尺寸效应、表面效应等物理化学性质正好符合生物传感器小型化、多功能化的要求。与外源材料(贵金属纳米颗粒、金属氧化物、碳等)相比，DNA具有优异的生物相容性，是构建纳米结构的理想材料，在生物医学和生物技术领域具有广阔的应用前景。传统的制备DNA纳米结构的方法通常依赖于短DNA链之间的Watson-Crick碱基配对。该方法具有DNA链设计复杂、需要合成大量DNA、易受核酸外切酶攻击、易因变性而解离等固有缺点。同时，DNA纳米结构的合成过程费时、繁琐、昂贵，稳定性难以保证。与传统的Watson-Crick碱基配对不同的是，DNA纳米花可以通过局部高浓度DNA液相结晶和自组装来合成。在温和的反应条件下，两条DNA链和phi29DNA聚合酶被用来产生直径从几十到数百纳米的DNA纳米花。研究表明，DNA纳米花具有良好的稳定性，能有效抵抗核酸外切酶的攻击，已被应用于细胞内成像和药物载体的制备。目前DNA纳米花用于化学检测中应用较少。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于DNA步行器和纳米花结构的致病菌电化学检测方法，通过在电极表面修饰DNA步行器，当目标物存在时释放大量游离滚环扩增引物，随后的滚环扩增反应诱导DNA纳米花的形成，增大电极表面有效面积，放大检测信号，有效提高检测灵敏度。而当溶液中不存在目标物时，DNA步行器在核酸外切酶III的诱导下水解滚环扩增引物，降低背景信号，拓宽传感器的检测范围。
本发明的第一个目的是提供一种基于DNA步行器和纳米花结构的致病菌电化学检测方法，包括如下步骤：
S1、将DNA步行器和目的致病菌的适配体变性、复性形成适配体/DNA步行器双链，并将滚环扩增引物和辅助序列变性、复性形成辅助序列/滚环扩增引物双链；
其中，所述的DNA步行器与目的致病菌的适配体具有一段互补序列，所述的辅助序列与滚环扩增引物具有一段互补序列，所述的DNA步行器与辅助序列具有一段互补序列，所述的目的致病菌的适配体与滚环扩增引物具有一段互补序列；
且所述的DNA步行器与滚环扩增引物一端设有与电极表面反应的基团；
S2、将适配体/DNA步行器双链和辅助序列/滚环扩增引物双链修饰到电极表面，得到修饰电极；
S3、将含有目的致病菌的样品制备成不同浓度的溶液，分别涂布在修饰电极上，孵育后冲洗修饰电极，冲洗后在修饰电极表面滴加核酸外切酶III反应溶液，孵育后清洗并干燥；
S4、配制DNA滚环扩增反应液，滴加在S3步骤干燥后的电极表面，孵育后洗涤电极，洗涤后的电极采用电化学工作站测定电化学响应值；
S5、建立电化学响应值与致病菌样品浓度之间的关系曲线；
S6、将实际待检测样品按照S1～S4步骤进行操作，测定出电化学响应值，根据S5步骤的关系曲线，计算出待检测样品中致病菌的含量。
进一步地，所述的致病菌为金黄色葡萄球菌。
进一步地，致病菌为金黄色葡萄球菌时，适配体的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
5’-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’。
进一步地，致病菌为金黄色葡萄球菌时，DNA步行器的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
5’-SH-(CH2)6-(T)40-TAGCGTGCACTTTTGACGTAGCTGTGGGATTTTTTTTTT-3’。
进一步地，致病菌为金黄色葡萄球菌时，辅助序列的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
5’-T15-TTGCCAGTCGAGTCGAGTCGTCCCACAGCTACGTC-3’。
进一步地，致病菌为金黄色葡萄球菌时，滚环扩增引物的序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTCGACTCGACTCGACTGGCAAGTACCATTGC-3’。
进一步地，所述的DNA滚环扩增反应液中包括环状DNA模板、phi29 DNA聚合酶缓冲液、phi29 DNA聚合酶、dNTPs、BSA和亚甲基蓝溶液。
进一步地，所述的环状DNA模板的序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：5’-P-CTCGACTGGCGCAATGGTACTTGCCAGTCGAGTCGAGTCGGCAATGGTACTTGTTTGCCGACTCGA-3’。
进一步地，所述的电极为金电极。
进一步地，所述的与电极表面反应的基团为HS-(CH2)6。
本发明的工作原理：在有目的致病菌存在的情况下，适配体与致病菌结合，从适配体/步行器双链上挣脱，DNA步行器的3’末端与辅助序列结合，核酸外切酶III从辅助序列的3’末端开始，将辅助序列水解，露出滚环扩增引物，参与后续滚环扩增反应。
而当溶液中没有致病菌时，适配体/步行器双链中的适配体序列与滚环扩增引物结合，因此在核酸外切酶III的作用下将滚环扩增引物水解，由于没有滚环扩增引物的参与，后续的滚环扩增无法启动。
本发明的有益效果是：
本发明通过在电极表面修饰DNA步行器，当目标物存在时释放大量游离滚环扩增引物，随后的滚环扩增反应诱导DNA纳米花的形成，增大电极表面有效面积，放大检测信号，有效提高检测灵敏度。而当溶液中不存在目标物时，DNA步行器在核酸外切酶III的诱导下水解滚环扩增引物，降低背景信号，拓宽传感器的检测范围。
附图说明
图1为基于DNA步行器触发的自组装纳米花结构的检测金黄色葡萄球菌的原理图；
图2为金黄色葡萄球菌电化学检测标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中所述DNA步行器购于生工生物工程(上海)股份有限公司，辅助序列购于生工生物工程(上海)股份有限公司，滚环扩增引物序列购于生工生物工程(上海)股份有限公司，环状DNA模板序列购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明实施例中所用的金黄色葡萄球菌适配体、DNA步行器、辅助序列、引物、环状模板的核酸序列如表1所示。
表1
Figure BDA0002825977490000051
实施例1：金黄色葡萄球菌浓度标准曲线的绘制
用30％H2O2和H2SO4配制食人鱼溶液，金电极在食人鱼溶液中浸泡15min去除表面杂质，将电极表面清洗并转移到超纯水中超声5min，随后电极用0.5mol·L-1H2SO4进行电化学清洗和电极活化，超纯水再次清洗电极，氮气吹干。0.2μmol·L-1DNA步行器序列和0.4μmol·L-1适配体加入PBS缓冲液中，1μmol·L-1滚环扩增引物和2μmol·L-1辅助序列加入PBS缓冲液中，两种混合物分别在95℃下热变性10min，然后放置在4℃冰浴10min，分别形成适配体/DNA步行器双链和辅助序列/滚环扩增引物双链。两管双链混匀后取10μL滴在清洁的金电极表面，30℃孵育12h，用超纯水清洗15s；最后将金电极置于100μL的1mol·L-16-MCH溶液中室温放置60min。
含有金黄色葡萄球菌的样品在3000r·min-1离心5min，使用PBS缓冲液清洗沉淀3次后重悬于PBS缓冲液中。取100μL含有不同浓度金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液均匀滴加在修饰电极上，37℃孵育60min后，用PBS缓冲液冲洗电极，滴加10μL核酸外切酶III反应溶液(0.75μL 10U/μL核酸外切酶III，1μL 10×核酸外切酶III反应缓冲液和8.25μL ddH2O)在电极表面，37℃孵育80min，PBS缓冲液清洗电极并用超纯氮气干燥。
20μmol·L-1环状DNA模板、1U/μL T4DNA连接酶、4μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和27μL ddH2O混匀后在16℃孵育12h；溶液在65℃下处理10min以终止反应。
取2μL环状DNA模板，10μL10×phi29 DNA聚合酶缓冲液，1μL10 U/μL phi29 DNA聚合酶，5μL 25μmol·L-1dNTPs，10μL2 mg/mL BSA和72μL亚甲蓝溶液混匀。将反应溶液滴在DNA步行器运动后的电极表面上，30℃孵育3h，用PBS缓冲液洗涤电极并用超纯氮气干燥。
使用超纯氮气提前30min吹PBS缓冲液，去除PBS缓冲液中的溶解氧，将金电极，铂丝电极和Ag/AgCl电极插入PBS缓冲液中，并正确连接到电化学工作站进行DPV扫描，扫描电压为-0.5V～0.1V。通过摇瓶培养金黄色葡萄球菌溶液，逐倍稀释，根据测定电化学响应值与加入金黄色葡萄球菌的浓度之间的关系，绘制相应的线性关系曲线。
如图2所示，电极表面电流响应值随着溶液中金黄色葡萄球菌浓度的增加而增加，线性回归方程是y＝0.3206×logC+3.3536，R2＝0.9924，其中y表示电流响应值，C表示溶液中金黄色葡萄球菌的浓度(CFU·mL-1)，该方法检测限为9CFU·mL-1。
实施例2：实际样品中金黄色葡萄球菌含量的测定
为了进一步验证该方法在测定实际样品中金黄色葡萄球菌含量时的准确性，选用了无预处理的太湖水和自来水以及使用PBS缓冲液进行5倍稀释后的蜂蜜水进行金黄色葡萄球菌加标测定。
用30％H2O2和H2SO4配制食人鱼溶液，金电极在食人鱼溶液中浸泡15min去除表面杂质，将电极表面清洗并转移到超纯水中超声5min，随后电极用0.5mol·L-1H2SO4进行电化学清洗和电极活化，超纯水再次清洗电极，氮气吹干。0.2μmol·L-1DNA步行器序列和0.4μmol·L-1适配体加入PBS缓冲液中，1μmol·L-1滚环扩增引物和2μmol·L-1辅助序列加入PBS缓冲液中，两种混合物分别在95℃下热变性10min，然后放置在4℃冰浴10min，分别形成适配体/DNA步行器双链和辅助序列/滚环扩增引物双链。两管双链混匀后取10μL滴在清洁的金电极表面，30℃孵育12h，用超纯水清洗15s；最后将金电极置于100μL的1mol·L-16-MCH溶液中室温放置60min。
含有金黄色葡萄球菌的样品在3000r·min-1离心5min，使用PBS缓冲液清洗沉淀3次后重悬于PBS缓冲液中。然后将沉淀物以6×104CFU·mL-1和6×107 CFU·mL-1的浓度溶解在100 μL不同实际样品中。取100μL含有不同浓度金黄色葡萄球菌的实际样品均匀滴加在修饰电极上，37℃孵育60min后，用PB S缓冲液冲洗电极，滴加10μL核酸外切酶III反应溶液(0.75μL 10U/μL核酸外切酶III，1μL 10×核酸外切酶III反应缓冲液和8.25μL ddH2O)在电极表面，37℃孵育80min，PBS缓冲液清洗电极并用超纯氮气干燥。
20μmol·L-1环状DNA模板、1U/μL T4DNA连接酶、4μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和27μL ddH2O混匀后在16℃孵育12h；溶液在65℃下处理10min以终止反应。
取2μL环状DNA模板，10μL10×phi29 DNA聚合酶缓冲液，1μL10 U/μL phi29 DNA聚合酶，5μL25μmol·L-1dNTPs，10μL2 mg/mL BSA和72μL亚甲蓝溶液混匀。将反应溶液滴在DNA步行器运动后的电极表面上，30℃孵育3h，用PBS缓冲液洗涤电极并用超纯氮气干燥。
使用超纯氮气提前30min吹PBS缓冲液，去除PBS缓冲液中的溶解氧，将电极插入PBS缓冲液并正确连接到电化学工作站进行电化学信号测定。测定结果代入标准曲线即可计算出实际样品中金黄色葡萄球菌浓度。
具体样品和检测结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002825977490000081
注：样品1和样品2为太湖水样品；样品3和样品4为自来水样品，样品5和样品6为稀释蜂蜜样品
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 基于DNA步行器和纳米花结构的致病菌电化学检测方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
gcaatggtac ggtacttcct cggcacgttc tcagtagcgc tcgctggtca tcccacagct 60
acgtcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tagcgtgcac ttttgacgta 60
gctgtgggat ttttttttt 79
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
tttttttttt tttttttgcc agtcgagtcg agtcgtccca cagctacgtc 50
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
ttttttttcg actcgactcg actggcaagt accattgc 38
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ctcgactggc gcaatggtac ttgccagtcg agtcgagtcg gcaatggtac ttgtttgccg 60
actcga 66

Claims (10)

1.一种基于DNA步行器和纳米花结构的致病菌电化学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将DNA步行器和目的致病菌的适配体变性、复性形成适配体/DNA步行器双链，并将滚环扩增引物和辅助序列变性、复性形成辅助序列/滚环扩增引物双链；
其中，所述的DNA步行器与目的致病菌的适配体具有一段互补序列，所述的辅助序列与滚环扩增引物具有一段互补序列，所述的DNA步行器与辅助序列具有一段互补序列，所述的目的致病菌的适配体与滚环扩增引物具有一段互补序列；
且所述的DNA步行器与滚环扩增引物一端设有与电极表面反应的基团；
S2、将适配体/DNA步行器双链和辅助序列/滚环扩增引物双链修饰到电极表面，得到修饰电极；
S3、将含有目的致病菌的样品制备成不同浓度的溶液，分别涂布在修饰电极上，孵育后冲洗修饰电极，冲洗后在修饰电极表面滴加核酸外切酶III反应溶液，孵育后清洗并干燥；
S4、配制DNA滚环扩增反应液，滴加在S3步骤干燥后的电极表面，孵育后洗涤电极，洗涤后的电极采用电化学工作站测定电化学响应值；
S5、建立电化学响应值与致病菌样品浓度之间的关系曲线；
S6、将实际待检测样品按照S1～S4步骤进行操作，测定出电化学响应值，根据S5步骤的关系曲线，计算出待检测样品中致病菌的含量。
2.根据权利要求1所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，所述的致病菌为金黄色葡萄球菌。
3.根据权利要求2所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，致病菌为金黄色葡萄球菌时，适配体的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’。
4.根据权利要求3所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，致病菌为金黄色葡萄球菌时，DNA步行器的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-SH-(CH2)6-(T)40-TAGCGTGCACTTTTGACGTAGCTGTGGGATTTTTTTTTT-3’。
5.根据权利要求4所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，致病菌为金黄色葡萄球菌时，辅助序列的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5’-T15-TTGCCAGTCGAGTCGAGTCGTCCCACAGCTACGTC-3’。
6.根据权利要求5所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，致病菌为金黄色葡萄球菌时，滚环扩增引物的序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTCGACTCGACTCGACTGGCAAGTACCATTGC-3’。
7.根据权利要求1所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，所述的DNA滚环扩增反应液中包括环状DNA模板、phi29 DNA聚合酶缓冲液、phi29DNA聚合酶、dNTPs、BSA和亚甲基蓝溶液。
8.根据权利要求7所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，所述的环状DNA模板的序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
5’-P-CTCGACTGGCGCAATGGTACTTGCCAGTCGAGTCGAGTCGGCAATGGTACTTGTTTGCCGACTCGA-3’。
9.根据权利要求1所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，所述的电极为金电极。
10.根据权利要求1所述的致病菌电化学检测方法，其特征在于，所述的与电极表面反应的基团为HS-(CH2)6。
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