CN110542714A - 一种dna步行器的制备及其在传感分析中的应用 - Google Patents

一种dna步行器的制备及其在传感分析中的应用 Download PDF

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李丽
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Abstract

本发明公开了一种DNA步行器的制备方法及在传感分析中的应用。利用蜡打印和激光切割机技术在纸上制备疏水区域、亲水区域、中空通道以及流体通道网来实现纸电极的自动清洗和信号采集。将链霉亲和素和修饰有生物素的DNA链进行组装，构建多足DNA步行器，利用链取代反应推动DNA步行器在电极表面移动，使得DNA‑铂铜纳米复合材料被固定在电极表面，依托于铂铜纳米材料对过氧化氢极好的催化作用，鲁米诺的发光信号得到放大，从而实现对待测物的超灵敏检测。

Description

一种DNA步行器的制备及其在传感分析中的应用
技术领域
本发明设计一种电化学发光传感分析检测技术领域，更具体的说是一种DNA步行器的制备及在电化学传感分析中的应用。
背景技术
蛋白质在大多数的生命活动如新陈代谢、遗传和免疫中起着至关重要的作用。特别是链霉菌亲和素，一种从链霉菌中分离得到的蛋白质，它可以在高温、极端的pH值、变性剂等条件下存活，并保持活性，这对生物体具有十分重要的意义。目前，科研人员已经研究多种链霉菌亲和素检测技术。例如，Li等人成功地将捆绑诱导的DNA链取代和荧光检测法结合起来检测链霉亲和素。此外，Kizek的课题组提出了一种基于碳糊电极的方波伏安法用于链霉菌亲和素的测定。尽管这些方法具有很高的灵敏度和准确性，但是它们往往需要复杂和昂贵的仪器，并且耗费大量的时间，这严重限制了它们的进一步使用。所以，设计一种可靠、快速、准确、灵敏的链霉亲和素检测策略迫在眉睫。
电化学发光传感分析方法因其设备简单、重现性好、背景信号低、灵敏度高、可控性好等优点，是一种有潜力的分析方法，并在蛋白质的识别和检测中受到了广泛的关注。目前，人们已经研究了多种电化学发光信号放大策略，如聚合酶链反应、酶催化放大技术等，以追求卓越的灵敏度检测。然而，由于热循环过程繁琐，程序和设计相对复杂，这些方法和策略受到了阻碍。而以DNA和小分子为燃料的，可进行重复机械操作的人工DNA机器，由于其化学稳定性高、DNA合成容易、运动和可控性好等特点，被纳入电化学发光信号放大的考虑范围。由链霉菌亲和素和生物素之间具有很高的亲和力，可以形成生物素-链霉素亲和素结合系统，而设计了一种由生物素标记的步行链和链霉菌亲和素组装而成的DNA步行器。通过脚趾介导的探针链位移反应推动DNA步行器的运动，从而实现信号的放大。值得注意的是，与传统的DNA机器相比，移动过程不需要任何刺激和外部能量的辅助，避免了金属离子或酶的干扰以及额外的操作。同时，该信号放大策略克服了传统蛋白质检测中酶切或聚合转化蛋白质的不足，有望在蛋白质分析中得到高效的应用。
一个简单、灵敏的生物传感平台是高性能电化学发光生物传感器的另一个重要组成部分。特别是自便携式纸芯片首次报道以来，纸以价格低廉、数量丰富、携带方便和化学兼容性好等特点，在传感分析领域得到广泛的应用。此外，纸纤维的毛细作用可以在没有外力的情况下驱动流体流动，避免了动力设备的消耗和高成本。然而，纤维素基质的存在也带来了一些困难，如导电性差。为此，通过将性能良好的纳米材料引入到纸芯片上，不但可以提高其导电性能还可以增大其比表面积，极大地改善纸芯片的性能，对传感器的超灵敏检测具有重要意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是在设计的微流控纸芯片上制备DNA步行器，并用于放大电化学发光传感装置的信号，实现对链霉亲和素浓度的快速、超灵敏检测。
为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的纸基电化学发光传感装置来实现的，纸基电化学发光传感装置的制备方法为：
（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计如附图1所示的纸芯片的疏水蜡打印图案，蜡打印图案的颜色为黑色，该纸基装置包括五个蜡打印区域分别为A、B、C、D和E，其中A为中空通道单元，B为多通道单元，C为亲水单元，D为工作单元，E为对应单元；
（2）通过富士施乐蜡打印机将步骤（1）中设计的疏水图案打印到纸芯片上，所用的纸芯片为色谱纸；
（3）将印有蜡图案的A4纸放置到烘箱中，在140 ºC下加热3 min，确保蜡打印区域的蜡融化并浸透纸张，形成疏水墙；
（4）利用激光切割机对处理好的A4纸芯片进行切割，得到纸基装置，并将A中的亲水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道；
（5）采用丝网印刷技术进行电极印刷，式样如附图2所示，将工作电极印刷到D上的圆形亲水区，Ag/AgCl参比电极和碳对电极印刷到E上的圆形亲水区；
（6）在工作电极所在的圆形亲水区上生长花状银微米颗粒，制备纸基银电极，随后清洗电极表面，并在室温下干燥后，40 μL 5 μM 发夹型DNA链S1滴加到电极表面，在4°C下孵化16 h，反应结束后清洗电极表面，并在室温下干燥，将1% 6-巯基-1-己醇滴涂在工作电极表面，封闭电极表面其余的非特异性位点，随后清洗电极表面，并在室温下干燥；
所述的S1的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上巯基；
（7）折叠纸芯片装置，式样如附图3所示，将含有过氧化氢和鲁米诺的缓冲溶液滴加在工作电极上，并与电化学工作站相连，记录发光强度I 0；
（8）取一定浓度的链霉亲和素和10 μL步行链S2溶解在80 μL的内切酶缓冲溶液中，30min后加入5 U的内切酶溶液，继续反应60 min后，将混合液转移至80 ℃的水浴锅中加热15min，反应完成后，取出混合液冷却至室温并静置1 h，即制得DNA步行器；
所述的S2的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上生物素；
（9）并将20 μL DNA链S3、170 μL 300 mM氯化钠缓冲溶液以及步骤（8）中的DNA步行器混合均匀，滴加到电极表面，并在37 ℃下孵化1 h，随后用缓冲溶液清洗电极；
所述的S3的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上氨基；
（10）制备铂铜纳米材料，并再分散至缓冲液中；
（11）40 μL 1 μΜ的DNA链S4 溶液加入到等体积的铂铜分散液中在37 °C下反应18 h，为了去除未反应的试剂，缓冲液离心洗涤至少4次，即得到DNA-铂铜纳米复合材料；滴加50μL DNA-铂铜纳米复合材料分散液至电极表面，继续反应30 min后清洗电极表面；
所述的S4的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上羧基，5’端均修饰上巯基；
（12）将纸芯片折叠好后重复步骤（7）并记录电化学发光强度为I 1，计算电化学发光强度差I=I 1 -I 0 ，并绘制电化学发光强度与链霉亲和素浓度的标准曲线，即可实现所测样品链霉亲和素浓度的检测；
步骤(1)中所述纸芯片，其特征在于: A和B的尺寸为40×50 mm，C的尺寸为20×40 mm，D和E的尺寸为20×24 mm，A上的中空通道为直径为10 mm的圆形，B上的三通道的宽度为4mm，C上的亲水区面积为38×18 mm，D和E上的亲水区为直径为10 mm的圆形；
步骤(6)中所述纸基银电极，其特征在于：配置0.45 M 硝酸银水溶液，取896 µL（50%，w/v）的羟胺稀释到652 µL蒸馏水中，将40 µL的硝酸银水溶液滴加到工作电极亲水区后，快速滴加40 µL的羟胺溶液，将滴加好的装置放置在已预先调至到35 °C的烘箱中干燥1 h，得到的纸电极用超纯水冲洗多次，以去除未附载上的银颗粒，并继续放置在烘箱中烘干备用；
步骤(10)中所述铂铜纳米材料，其特征在于：将1 mL的20 mM氯铂酸溶液、1 mL的20 mM氯化铜溶液、0.05 mL的5 M碘化钾溶液、160 mg聚乙烯吡咯烷酮和10 mL乙二醇加入到三口瓶中，并在剧烈搅拌下混合均匀，搅拌约3 min后，将三口瓶转移到油浴锅中，在140 ℃下继续搅拌120 min，反应过程中，瓶内的溶液颜色逐渐由深褐色变为黑色，随后，取出三口瓶，自然冷却到室温，将冷却后的溶液在16000 rpm转速下离心20 min，并用蒸馏水洗涤三次，并在真空干燥箱中干燥，即可得到固体的铂铜纳米材料；
步骤(6、9和11)中所述清洗电极，其特征在于：将B沿折叠线折叠至A上层，D折叠至A下层，确保区域I、II和III完全重合，将吸收标签折叠至工作标签下层，其样式如附图4所示，当清洗液滴加到区域IV后，被通道分成三股，根据流道长短分三次抵达区域II，到达区域II后，溶液在重力作用下沿着中空通道抵达区域III，在纸纤维的毛细作用下，清洗液迅速扩散至整个电极表面，进行横向清洗，C的亲水区域的吸收作用下，渗透过工作电极完成纵向清洗。
本发明的有益效果
(1)本发明利用目标物链霉亲和素和生物素的高度亲和作用，构建了DNA步行器，通过DNA链的置换推动了DNA步行器的运动，从而实现对电化学发光信号的放大。
(2)本发明利用纸的毛细作用和清洗液自身重力的作用，设计一种三通道流体通道网以实现一次滴加缓冲液完成三次纸电极的清洗工作，该装置既简化了人为操作，又为超灵敏检测提供了保障。
(3)本发明利用银微米花修饰的纸工作电极为反应平台，改善了纸芯片的导电性同时又增大纸电极的比表面积。
(4)本发明利用高度分支化的铂铜纳米材料作为过氧化氢的催化剂，通过和DNA链连接构筑网状结构，使得被大量负载在电极表面，实现对信号的放大。
附图说明
图1：A4纸上的疏水蜡打印图案。
图2：裁切后印有银/氯化银参比电极、工作电极、碳对电极的纸基装置。
图3：纸基装置连入电路时的3D构象。
图4：纸基装置自动清洗时的3D构象。
具体实施方式
实施例1
该具有纸基电化学发光传感装置的制备方法为：
（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计如附图1所示的纸芯片的疏水蜡打印图案，蜡打印图案的颜色为黑色，该纸基装置包括五个蜡打印区域分别为A、B、C、D和E，其中A为中空通道单元，B为多通道单元，C为亲水单元，D为工作单元，E为对应单元，A和B的尺寸为40×50 mm，C的尺寸为20×40 mm，D和E的尺寸为20×24 mm，A上的中空通道为直径为10 mm的圆形，B上的三通道的宽度为4 mm，C上的亲水区面积为38 × 18 mm，D和E上的亲水区为直径为10 mm的圆形；
（2）通过富士施乐蜡打印机将步骤（1）中设计的疏水图案打印到纸芯片上，所用的纸芯片为色谱纸；
（3）将印有蜡图案的A4纸放置到烘箱中，在140 ºC下加热3 min，确保蜡打印区域的蜡融化并浸透纸张，形成疏水墙；
（4）利用激光切割机对处理好的A4纸芯片进行切割，得到纸基装置，并将A中的亲水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道；
（5）采用丝网印刷技术进行电极印刷，式样如附图2所示，将工作电极印刷到D上的圆形亲水区，Ag/AgCl参比电极和碳对电极印刷到E上的圆形亲水区;
（6）配置0.45 M AgNO3水溶液，取896 µL（50%，w/v）的羟胺稀释到652 µL蒸馏水中，将40 µL的硝酸银水溶液滴加到工作电极亲水区后，快速滴加40 µL的羟胺溶液，将滴加好的装置放置在已预先调至到35 °C的烘箱中干燥1 h，得到的纸电极用超纯水冲洗多次，以去除未附载上的银颗粒，并继续放置在烘箱烘干，随后40 μL 5 μM 发夹型DNA链S1滴加到电极表面，在4°C下孵化16 h，反应结束后清洗电极表面，并在室温下干燥，将1% 6-巯基-1-己醇滴涂在工作电极表面，封闭电极表面其余的非特异性位点，随后清洗电极表面，并在室温下干燥；
所述的S1的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上巯基；
（7）折叠纸芯片装置，式样如附图3所示，将含有过氧化氢和鲁米诺的缓冲溶液滴加在工作电极上，并与电化学工作站相连，记录发光强度I 0；
（8）取一定浓度的链霉亲和素和10 μL步行链S2溶解在80 μL的内切酶缓冲溶液中，30min后加入5 U的内切酶溶液，继续反应60 min后，将混合液转移至80 ℃的水浴锅中加热15min，反应完成后，取出混合液冷却至室温并静置1 h，即制得DNA步行器；
所述的S2的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上生物素；
（9）并将20 μL DNA链S3、170 μL 300 mM氯化钠缓冲溶液以及步骤（8）中的DNA步行器混合均匀，滴加到电极表面，并在37 ℃下孵化1 h，随后用缓冲溶液清洗电极；
所述的S3的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上氨基；
（10）将1 mL的20 mM H2PtCl6溶液、1 mL的20 mM CuCl2 溶液、0.05 mL的5 M KI溶液、160 mg PVP和10 mL EG加入到三口瓶中，并在剧烈搅拌下混合均匀，搅拌约3 min后，将三口瓶转移到油浴锅中，在140 ℃下继续搅拌120 min，反应过程中，瓶内的溶液颜色逐渐由深褐色变为黑色，随后，取出三口瓶，自然冷却到室温，将冷却后的溶液在16000 rpm转速下离心20 min，并用蒸馏水洗涤三次，并在真空干燥箱中干燥，即可得到PtCuTNFs固体，并再分散至缓冲液中；
（11）40 μL 1 μΜ的DNA链S4 溶液加入到等体积的铂铜分散液中在37 °C下反应18 h，为了去除未反应的试剂，缓冲液离心洗涤至少4次，即得到DNA-铂铜纳米复合材料；滴加50μL DNA-铂铜纳米复合材料分散液至电极表面，继续反应30 min后清洗电极表面；
所述的S4的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上羧基，5’端均修饰上巯基；
（12）将纸芯片折叠好后重复步骤（7）并记录电化学发光强度为I 1，计算电化学发光强度差I=I 1 -I 0 ，并绘制电化学发光强度与链霉亲和素浓度的标准曲线，即可实现所测样品链霉亲和素浓度的检测；
步骤(6、9和11)中所述清洗电极，其步骤是：将B沿折叠线折叠至A上层，D折叠至A下层，确保区域I、II和III完全重合，将吸收标签折叠至工作标签下层，其样式如附图4所示，当清洗液滴加到区域IV后，被通道(1-3)分成三股，根据流道长短分三次抵达区域II，到达区域II后，溶液在重力作用下沿着中空通道抵达区域III，在纸纤维的毛细作用下，清洗液迅速扩散至整个电极表面，进行横向清洗，C的亲水区域的吸收作用下，渗透过工作电极完成纵向清洗。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种DNA 步行器的制备及其在传感分析中的应用
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt ttttttttgt cagtgagcta ggttagatgt cgccatgtgt agacgacatc 60
taacctagc 69
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacatctaa cctagctcac tgac 24
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatgtcgtc tacacatggc gacatctaac ctagcccatg tgtaga 46
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctattcgtcg acgaatag 18

Claims (5)

1.一种DNA 步行器的制备及其在传感分析中的应用，其特征是包括以下步骤：
（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的疏水蜡打印图案；（2）通过富士施乐蜡打印机将步骤（1）中设计的疏水图案打印到纸芯片上，所用的纸芯片为色谱纸；
（3）将印有蜡图案的A4纸放置到烘箱中，在140 ºC下加热3 min，确保蜡打印区域的蜡融化并浸透纸张，形成疏水墙；
（4）利用激光切割机对处理好的A4纸芯片进行切割，得到纸基装置，并将A中的亲水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道；
（5）采用丝网印刷技术进行电极印刷，将工作电极印刷到D上的圆形亲水区，Ag/AgCl参比电极和碳对电极印刷到E上的圆形亲水区;
（6）在工作电极所在的圆形亲水区上生长花状银微米颗粒，制备纸基银电极，随后清洗电极表面，并在室温下干燥后，40 μL 5 μM 发夹型DNA链S1滴加到电极表面，在4°C下孵化16 h，反应结束后清洗电极表面，并在室温下干燥，将1% 6-巯基-1-己醇滴涂在工作电极表面，封闭电极表面其余的非特异性位点，随后清洗电极表面，并在室温下干燥；
所述的S1的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上巯基；
（7）折叠纸芯片装置，将含有过氧化氢和鲁米诺的缓冲溶液滴加在工作电极上，并与电化学工作站相连，记录发光强度I 0；
（8）取一定浓度的链霉亲和素和10 μL步行链S2溶解在80 μL的内切酶缓冲溶液中，30min后加入5 U的内切酶溶液，继续反应60 min后，将混合液转移至80 ℃的水浴锅中加热15min，反应完成后，取出混合液冷却至室温并静置1 h，即制得DNA步行器；
所述的S2的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上生物素；
（9）并将20 μL DNA链S3、170 μL 300 mM氯化钠缓冲溶液以及步骤（8）中的DNA步行器混合均匀，滴加到电极表面，并在37 ℃下孵化1 h，随后用缓冲溶液清洗电极；
所述的S3的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上氨基；
（10）制备铂铜纳米材料，并再分散至缓冲液中；
（11）40 μL 1 μΜ的DNA链S4 溶液加入到等体积的铂铜分散液中在37 °C下反应18 h，为了去除未反应的试剂，缓冲液离心洗涤至少4次，即得到DNA-铂铜纳米复合材料；滴加50μL DNA-铂铜纳米复合材料分散液至电极表面，继续反应30 min后清洗电极表面；
所述的S4的碱基序列如核苷酸序列表所示，且DNA链的3’端均修饰上羧基，5’端均修饰上巯基；
（12）将纸芯片折叠好后重复步骤（7）并记录电化学发光强度为I 1，计算电化学发光强度差I=I 1 -I 0 ，并绘制电化学发光强度与链霉亲和素浓度的标准曲线，即可实现所测样品链霉亲和素浓度的检测。
2.根据权利要求1所述纸基装置，其特征是：其蜡打印图案的颜色为黑色，该纸基装置包括五个蜡打印区域分别为A、B、C、D和E，其中A为中空通道单元，B为多通道单元，C为亲水单元，D为工作单元，E为对应单元；A和B的尺寸为40×50 mm，C的尺寸为20×40 mm，D和E的尺寸为20×24 mm，A上的中空通道为直径为10 mm的圆形，B上的三通道的宽度为4 mm，C上的亲水区面积为38×18 mm，D和E上的亲水区为直径为10 mm的圆形。
3.根据权利要求6所述纸基银电极，其特征是：配置0.45 M 硝酸银水溶液，取896 µL（50%，w/v）的羟胺稀释到652 µL蒸馏水中，将40 µL的硝酸银水溶液滴加到工作电极亲水区后，快速滴加40 µL的羟胺溶液，将滴加好的装置放置在已预先调至到35 °C的烘箱中干燥1h，得到的纸电极用超纯水冲洗多次，以去除未附载上的银颗粒，并继续放置在烘箱中烘干备用。
4.根据权利要求10所述铂铜纳米材料，其特征是：将1 mL的20 mM氯铂酸溶液、1 mL的20 mM氯化铜溶液、0.05 mL的5 M碘化钾溶液、160 mg聚乙烯吡咯烷酮和10 mL乙二醇加入到三口瓶中，并在剧烈搅拌下混合均匀，搅拌约3 min后，将三口瓶转移到油浴锅中，在140℃下继续搅拌120 min，反应过程中，瓶内的溶液颜色逐渐由深褐色变为黑色，随后，取出三口瓶，自然冷却到室温，将冷却后的溶液在16000 rpm转速下离心20 min，并用蒸馏水洗涤三次，并在真空干燥箱中干燥，即可得到固体的铂铜纳米材料。
5.根据权利要求6、9和11所述清洗电极，其特征是将B沿折叠线折叠至A上层，D折叠至A下层，确保区域I、II和III完全重合，将吸收标签折叠至工作标签下层，当清洗液滴加到区域IV后，被通道分成三股，根据流道长短分三次抵达区域II，到达区域II后，溶液在重力作用下沿着中空通道抵达区域III，在纸纤维的毛细作用下，清洗液迅速扩散至整个电极表面，进行横向清洗，C的亲水区域的吸收作用下，渗透过工作电极完成纵向清洗。
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