CN107643286B - 一种多孔CeO2纳米材料的制备及在纸基传感器中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多孔CeO₂纳米材料的制备方法及在生长有雪花状的Ag纳米粒子的纸芯片传感器中的应用。利用蜡打印和激光切割机技术在纸上制备疏水区域、半亲水区、亲水区域以及中空通道。通过在纸上印制相应的电极并对工作区域进行功能化来修饰纸芯片。将得到的纸芯片折叠构成三电极体系，进行一次检测。利用Pb²⁺激活DNA链酶并催化底物链断裂，促使多孔CeO₂纳米材料被固定在纸基传感器上，电化学发光的抑制被催化作用所取代；将制备好的纸芯片进行折叠并二次检测，通过两次检测的发光强度之差实现了待测物的超灵敏检测。

Description

一种多孔CeO2纳米材料的制备及在纸基传感器中的应用

技术领域

本发明涉及一种便携式纸基传感分析检测技术领域，更具体地说是一种以多孔CeO₂纳米材料为基础的纸基电化学发光检测平台的构建。

背景技术

随着科学技术的快速发展，多功能检测设备均朝着简单、小型化方向发展。纸凭借着价格低廉、储量丰富、易于储存、好的化学兼容性的特点备受研究者的关注。将纸用在优化检测设备中，极大的降低了设备的费用，使得设备更易存储、折叠便携。这种纸芯片的工作原理是：根据实验需要在纸芯片上绘制亲疏水图案，并通过蜡打印的方式将疏水的蜡打印到纸芯片上，未打印疏水图案的部分借助于纸的毛细驱动力而构成亲水通道。基于此原理，可以实现对检测样品的引流，减免了引流设备，优化了实验装置。

近年来，水污染问题严重威胁着我国的水资源安全，水质的恶化不仅仅破坏的是地表水环境，还包括地下水，近海海域，甚至大气等相关的生态环境，会严重的影响农产品的安全，进而威胁到人的身体健康。其中铅离子是水污染的一个重要因素。长期过量的接触和摄入铅离子会引起一系列疾病发生。为了解决这一问题，找到一种简单、快速并且灵敏的检测方法是当务之急。目前，已经有许多国内外学者在这方面做出了巨大的贡献。其中主要的方法有荧光、比色和电化学发光。比色方法只能进行定性和半定量检测，并不能得到精确值。荧光检测方法具有高的灵敏度，但检测设备比较昂贵并且需要特殊技术人员进行操作。因此这种检测手段受到地域和人为限制，不能推广使用。然而，电化学发光同时具有电化学分析方法和化学发光技术的优势，如：设备简单，高可控性，重现性，稳定性和灵敏度。所以，构建一种便携式、廉价且能够对铅离子实现定量分析的检测平台成为研究工作者的首要目标。

为了实现铅离子的超灵敏检测，采用一个适当的信号放大策略和功能性能好的检测平台是至关重要的。众所周知，纸的导电性能非常差，而银纳米材料凭借着其独特的导电、光学和热学性能常作为导电基底或负载生物分子的信号标签来使用。此外，多孔CeO₂纳米材料，具有很大的比表面积和类酶催化性能，有望在纸基传感平台中实现信号放大的功效。

发明内容

本发明的目的是提供一种生长有雪花状的Ag纳米粒子的纸芯片，同时合成多孔CeO₂纳米材料，作为负载标签，通过电化学发光的方法，实现对铅离子的快速、超灵敏检测。

本发明的目的是提供一种生长有雪花状的Ag纳米粒子的纸芯片，同时合成多孔CeO₂纳米材料，作为负载标签，通过电化学发光的方法，实现对铅离子的快速、超灵敏检测。

为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的便携式纸基电化学发光传感平台来实现的，该纸基电化学发光传感平台的制备方法为：

（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计如附图1所示的纸芯片的疏水蜡打印图案，蜡打印图案包括两个颜色区域：灰色区域和浅灰色区域；

（2）通过富士施乐蜡打印机将步骤（1）中设计的疏水图案打印到纸芯片上，所用的纸芯片为普通滤纸或者色谱纸；

（3）将印有蜡图案的A4纸放置到烘箱中，在130-150 ºC下加热1-3 min，除附图1中最下层的中间浅色区域疏水蜡含量少且不足以透过纸外，其它蜡打印区域的蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，其打印的蜡浸透纸后，背面放大后的样式如附图2所示；

（4）将得到的纸芯片放于激光切割机上，将中间纸芯片上白色的亲水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道；

（5）采用丝网印刷技术进行电极印刷，将Ag/AgCl参比电极、工作电极、碳对电极自左向右依次印刷到处理好的A4纸上，如附图3所示；

（6）在工作电极所在的纸芯片亲水区上生长雪花状Ag纳米粒子，定义为SLAg NPs-PWE，实现工作电极的功能化；

所述纸芯片功能化具体步骤为：将10 µL 0.4 M的AgNO₃溶液滴加到工作电极所在纸样品亲水区，快速加入40 µL的1.6 M NH₂OH，室温下反应60 min，用超纯水冲洗3次，将纸芯片放置在室温下干燥，即可得到SLAg NPs-PWE；

（7）将DNA酶链定义为S1，将S1固定在功能化的纸芯片亲水区，随后用巯基己醇封锁活性位点，将底物链定义为S2，Ag NPs功能化的S2添加到纸芯片上；

所述的S1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上巯基；所述的S2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上巯基，且自左向右第十个碱基A代表腺嘌呤核糖核酸；

（8）将纸芯片折叠，加入含有鲁米诺和过氧化氢的的Tris-HCl缓冲溶液，并将纸芯片与电化学工作站相连，在0~0.8 V记录发光强度I ₁；

（9）滴加一定铅离子浓度的样品到功能化的工作电极表面，室温下孵化55 min，打开纸芯片上层，用Tris-HCl的缓冲溶液清洗电极表面；

（10）将信号链定义为S3，其碱基序列如核苷酸序列表所示且5’端修饰上氨基，将合成的多孔CeO₂纳米粒子功能化的S3的溶液滴加到电极表面，孵化105 min，随后，用Tris–HCl的缓冲溶液清洗电极表面三次；

（11）将纸芯片折叠好后重复步骤（8）并记录电化学发光强度为I ₂，计算电化学发光强度差I=I ₂ -I ₁ ，并绘制电化学发光强度与铅离子浓度的标准曲线，即可实现所测样品铅离子浓度的检测。

步骤(1)中所述纸芯片，其特征在于: 纸芯片上层是三个直径为6 mm的圆形亲水区，两两间距为1.5 mm，中层的中空通道由两个直径为10 mm的半圆和长为13 mm宽为10 mm的长方形组成，中空通道的形状与下层纸芯片浅灰色区域完全一致。

步骤(7)中所述Ag NPs功能化的S2，其特征在于: 制备Ag NPs，并用于功能化S2：在160 °C下，5 mL的乙二醇剧烈搅拌1 h，随后0.04 g的硝酸银和1.55 g聚乙烯吡咯烷酮分别溶于5 mL的乙二醇中，并将两种乙二醇溶液同时快速地滴加到160 °C的乙二醇中，并在160 °C下继续搅拌45 min，最后将所得产物离心，并用乙醇清洗三遍，收集并再分散到1 mL的超纯水中，将S2溶液加入到1.5 μL 10 mM 磷酸三氯乙酯中，孵化1 h，随后加入300 μL的Ag NPs，将混合溶液震荡2 h，多余的试剂用超纯水清洗三次，在8000 rpm下离心收集，最后将功能化后的S2分散在Tris–HCl缓冲溶液中并储存在4 °C下备用。

步骤(10)中所述多孔CeO₂ NPs功能化的S3，其特征在于: 制备多孔CeO₂ NPs，并用于功能化S3中：将0.1 g CeCl₃∙7H₂O和0.5 g 聚乙烯吡咯烷酮在搅拌下溶解在无水乙醇中，加入100 μL的甲酸和200 μL的NH₃∙H₂O，持续搅拌15 min，混合溶液逐渐变白，随后添加100μL的30% H₂O₂，溶液颜色由白变黄，将所得溶液转移到25 mL的反应釜中，并在150 °C下加热6 h，将反应釜在自然状态下冷却到室温，所得到的产物用超纯水和无水乙醇离心清洗4次，并再分散到3 mL超纯水中，即可得到多孔CeO₂ NPs溶液，将S3加入到在1.5 μL 10 mM磷酸三氯乙酯中，室温下孵化1 h，加入300 μL CeO₂ NPs溶液，震荡下孵化6 h，随后100 μL的1% 巯基己醇溶液加入，继续震荡1 h，多余的试剂通过超纯水清洗3遍离心去除，将离心沉淀再分散到10 mM的pH 为7.4 Tris–HCl缓冲溶液中，即可得到CeO₂ NPs功能化的S3。

本发明的有益效果

(1) SLAg NPs-PWE的使用，提高了纸芯片的导电性及比表面积，使信号强度获得大幅度提高，同时银的价格相对低廉有效降低成本。

(2) 本发明利用Ag NPs对鲁米诺的抑制作用，降低了电化学发光的背景噪声。

(3) 本发明利用多孔CeO₂纳米材料做催化剂，这种多孔的形貌增大了与鲁米诺的接触面积，提高了催化的效率，从而发光强度得到明显的提升，从而降低了检测限，提高了检测的灵敏度。

附图说明

图1：纸芯片的疏水蜡打印图案；

图2：疏水蜡打印图案浸透后背面放大图；

图3：疏水蜡打印图案上丝网印刷上3个电极，从左到右依次为Ag/AgCl参比电极、工作电极、碳对电极。

具体实施方式

实施例1

一种多孔CeO₂纳米材料的制备及在纸基传感器中的应用：

（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的疏水蜡打印图案，蜡打印图案纸芯片由三层组成，上层是三个直径为6 mm的圆形亲水区，两两间距为1.5 mm，中层的中空通道由两个直径为10 mm的半圆和长为13 mm宽为10 mm的长方形组成，中空通道的形状与下层纸芯片浅灰色区域完全一致；

（2）通过富士施乐蜡打印机将步骤（1）中设计的疏水图案打印到纸芯片上，所用的纸芯片为普通滤纸或者色谱纸；

（3）将印有蜡图案的A4纸放置到烘箱中，在130-150 ºC下加热1-3 min，除最下层的中间浅色区域疏水蜡含量少且不足以透过纸外，其它蜡打印区域的蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；

（4）将得到的纸芯片放于激光切割机上，将中间纸芯片上白色的亲水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道；

（5）采用丝网印刷技术进行电极印刷，将Ag/AgCl参比电极、工作电极、碳对电极自左向右依次印刷到处理好的A4纸上；

（6）在工作电极所在的纸芯片亲水区上生长雪花状Ag纳米粒子，实现工作电极的功能化，具体步骤：将10 µL 0.4 M的AgNO₃溶液滴加到工作电极所在纸样品亲水区，快速加入40 µL的1.6 M NH₂OH，室温下反应60 min，用超纯水冲洗3次，将纸芯片放置在室温下干燥，即可得到SLAg NPs-PWE；

（7）将DNA酶链定义为S1，将S1固定在功能化的纸芯片亲水区，随后用巯基己醇封锁活性位点，将底物链定义为S2，Ag NPs功能化的S2添加到纸芯片上；

所述的S1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上巯基；所述的S2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上巯基，且自左向右第十个碱基A代表腺嘌呤核糖核酸；

Ag NPs功能化的S2，其制备方法：在160 °C下，5 mL的乙二醇剧烈搅拌1 h，随后0.04 g的硝酸银和1.55 g聚乙烯吡咯烷酮分别溶于5 mL的乙二醇中，并将两种乙二醇溶液同时快速地滴加到160 °C的乙二醇中，并在160 °C下继续搅拌45 min，最后将所得产物离心，并用乙醇清洗三遍，收集并再分散到1 mL的超纯水中，将S2溶液加入到1.5 μL 10 mM磷酸三氯乙酯中，孵化1 h，随后加入300 μL的Ag NPs，将混合溶液震荡2 h，多余的试剂用超纯水清洗三次，在8000 rpm下离心收集，最后将功能化后的S2分散在Tris–HCl缓冲溶液中并储存在4 °C下备用；

（8）将纸芯片折叠，加入含有鲁米诺和过氧化氢的的Tris-HCl缓冲溶液，并将纸芯片与电化学工作站相连，在0~0.8 V记录发光强度I ₁；

（9）滴加一定铅离子浓度的样品到功能化的工作电极表面，室温下孵化55 min，打开纸芯片上层，用Tris-HCl的缓冲溶液清洗电极表面；

（10）将信号链定义为S3，其碱基序列如核苷酸序列表所示且5’端修饰上氨基，将合成的多孔CeO₂纳米粒子功能化的S3的溶液滴加到电极表面，孵化105 min，随后，用Tris–HCl的缓冲溶液清洗电极表面三次，所述的多孔CeO₂ NPs功能化的S3，其制备方法：将0.1 gCeCl₃∙7H₂O和0.5 g 聚乙烯吡咯烷酮在搅拌下溶解在无水乙醇中，加入100 μL的甲酸和200μL的NH₃∙H₂O，持续搅拌15 min，混合溶液逐渐变白，随后添加100 μL的30% H₂O₂，溶液颜色由白变黄，将所得溶液转移到25 mL的反应釜中，并在150 °C下加热6 h，将反应釜在自然状态下冷却到室温，所得到的产物用超纯水和无水乙醇离心清洗4次，并再分散到3 mL超纯水中，即可得到多孔CeO₂ NPs溶液，将S3加入到在1.5 μL 10 mM磷酸三氯乙酯中，室温下孵化1 h，加入300 μL CeO₂ NPs溶液，震荡下孵化6 h，随后100 μL的1 % 巯基己醇溶液加入，继续震荡1 h，多余的试剂通过超纯水清洗3遍离心去除，将离心沉淀再分散到10 mM的pH 为7.4 Tris–HCl缓冲溶液中，即可得到CeO₂ NPs功能化的S3；

（11）将纸芯片折叠好后重复步骤（8）并记录电化学发光强度为I ₂，计算电化学发光强度差I=I ₂ -I ₁ ，并绘制电化学发光强度与铅离子浓度的标准曲线，即可实现所测样品铅离子浓度的检测。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种多孔CeO2纳米材料的制备及在纸基传感器中的应用

<130> 2017

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tttttttcat ctcttctccg agccggtcga aatagtgagt 40

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

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<400> 2

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

aactcacctg ttagaactca ctatttcga 29

Claims (3)

1.多孔CeO₂纳米材料在检测铅离子中的应用，其特征是包括以下步骤：

（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的疏水蜡打印图案，蜡打印图案包括两个颜色区域：灰色区域和浅灰色区域；纸芯片的上层是三个直径为6 mm的圆形亲水区，两两间距为1.5 mm，中层的中空通道由两个直径为10 mm的半圆和长为13 mm宽为10 mm的长方形组成，中空通道的形状与下层纸芯片浅灰色区域完全一致；

（2）通过富士施乐蜡打印机将步骤（1）中设计的疏水图案打印到纸芯片上，所用的纸芯片为普通滤纸或者色谱纸；

（3）将印有蜡图案的纸芯片放置到烘箱中，在130-150 ºC下加热1-3 min，除最下层的中间浅色区域疏水蜡含量少且不足以透过纸外，其它蜡打印区域的蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；

（4）将得到的纸芯片放于激光切割机上，将中层纸芯片上亲水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道；

（5）采用丝网印刷技术进行电极印刷，将Ag/AgCl参比电极、工作电极、碳对电极自左向右依次印刷到处理好的上层纸芯片上；

（6）在工作电极所在的纸芯片亲水区上生长雪花状Ag纳米粒子，定义为SLAg NPs-PWE，实现工作电极的功能化；

所述纸芯片功能化具体步骤为：将10 µL 0.4 M的AgNO₃溶液滴加到工作电极所在纸样品亲水区，快速加入40 µL的1.6 M NH₂OH，室温下反应60 min，用超纯水冲洗3次，将纸芯片放置在室温下干燥，即可得到SLAg NPs-PWE；

（7）将DNA酶链定义为S1，将S1固定在功能化的纸芯片亲水区，随后用巯基己醇封锁活性位点，将底物链定义为S2，将Ag NPs功能化的S2添加到纸芯片上；

所述的S1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上巯基；所述的S2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上巯基，且自左向右第十个碱基A代表腺嘌呤核糖核酸；

（8）将纸芯片折叠，加入含有鲁米诺和过氧化氢的的Tris-HCl缓冲溶液，并将纸芯片与电化学工作站相连，在0~0.8 V记录发光强度I ₁；

（9）滴加一定铅离子浓度的样品到功能化的工作电极表面，室温下孵化55 min，打开纸芯片上层，用Tris-HCl的缓冲溶液清洗电极表面；

（10）将信号链定义为S3，其碱基序列如核苷酸序列表所示且5’端修饰上氨基，将合成的多孔CeO₂纳米粒子功能化的S3的溶液滴加到电极表面，孵化105 min，随后，用Tris–HCl的缓冲溶液清洗电极表面三次；

（11）将纸芯片折叠好后重复步骤（8）并记录电化学发光强度为I ₂，计算电化学发光强度差I=I ₂ -I ₁ ，并绘制电化学发光强度与铅离子浓度的标准曲线，即可实现所测样品铅离子浓度的检测。

2.根据权利要求1所述的多孔 CeO₂ 纳米材料在检测铅离子中的应用 ，其特征在于权利要求1步骤（7）中所述的Ag NPs功能化的S2的制备过程: 制备Ag NPs，并用于功能化S2：在160 °C下，5 mL的乙二醇剧烈搅拌1 h，随后0.04 g的硝酸银和1.55 g聚乙烯吡咯烷酮分别溶于5 mL的乙二醇中，并将两种乙二醇溶液同时快速地滴加到160 °C的乙二醇中，并在160 °C下继续搅拌45 min，最后将所得产物离心，并用乙醇清洗三遍，收集并再分散到1 mL的超纯水中；将S2溶液加入到1.5 μL 10 mM 磷酸三氯乙酯中，孵化1 h，随后加入300 μL的Ag NPs，将混合溶液震荡2 h，多余的试剂用超纯水清洗三次，在8000 rpm下离心收集，最后将功能化后的S2分散在Tris–HCl缓冲溶液中并储存在4 °C下备用。

3.根据权利要求1所述的多孔 CeO₂ 纳米材料在检测铅离子中的应用 ，其特征在于权利要求1步骤（10）中所述的多孔CeO₂ NPs用以功能化S3的步骤为：将0.1 g CeCl₃∙7H₂O和0.5 g 聚乙烯吡咯烷酮在搅拌下溶解在无水乙醇中，加入100 μL的甲酸和200 μL的NH₃∙H₂O，持续搅拌15 min，混合溶液逐渐变白，随后添加100 μL的30% H₂O₂，溶液颜色由白变黄，将所得溶液转移到25 mL的反应釜中，并在150 °C下加热6 h，将反应釜在自然状态下冷却到室温，所得到的产物用超纯水和无水乙醇离心清洗4次，并再分散到3 mL超纯水中，即可得到多孔CeO₂ NPs溶液，将S3加入到在1.5 μL 10 mM磷酸三氯乙酯中，室温下孵化1 h，加入300 μL CeO₂ NPs溶液，震荡下孵化6 h，随后100 μL的1 % 巯基己醇溶液加入，继续震荡1 h，多余的试剂通过超纯水清洗3遍离心去除，将离心沉淀再分散到10 mM的pH 为7.4Tris–HCl缓冲溶液中，即可得到CeO₂ NPs功能化的S3。

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