CN107328764A - 化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备方法及其在蛋白检测中的应用。在计算机上利用Adobe illustrator CS6软件设计具有中空通道的纸芯片、检测卡和辅助卡的蜡打印图案，丝网印刷电极后在检测卡上合成具有良好导电性和生物相容性的负载金的石墨烯，通过蛋白和适配体链特异性结合、链循环、靶向模拟链替换技术放大信号，以化学发光作为驱动提供光源，利用光致电化学纸基础传感器实现对凝血酶的高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及纸芯片技术、电化学发光技术、光致电技术，更具体地说是基于化学发光驱动和靶向链替换构建了一个用于凝血酶检测的三维折纸传感器。
背景技术
凝血酶是凝血过程中一种重要的酶，凝血酶含量过高会引起血栓甚至死亡，含量过低会引起过度出血。因此急需构建一种可以实现快速、灵敏检测凝血酶的传感器。与传统的方法如电化学、荧光、电化学发光、比色和表面等离子体共振等相比，电化学发光驱动的纸基光致电传感器具有低成本，环保和易于集成化等优点。
尽管在近几年有很多用于检测凝血酶的方法，但是检测灵敏度不能满足临床诊断的要求。为提高传感器的灵敏度，我们选择金修饰的石墨烯纸作为基底，结合蛋白和适配体链特异性结合、链循环、靶向模拟链替换技术。相比传统的抗原抗体结合，适配体在存储、稳定性和可重复性方面具有更多优势，并且适用于大部分现有蛋白
在世界倡导“节能，环保”理念的形势下，低成本、可折叠、易降解、无污染的纸在生物传感领域引起了人们的广泛关注。由于孔状结构引起的大比表面积更有利于功能化材料的负载。此外纸的多孔性和毛细管现象促使试剂可在无外力作用下加快扩散。结合纸的优良性能，可以构建一个集试剂存储和反应发生于一体的自驱动三维纸基传感器。
发明内容
本发明的目的是在化学发光做内置光源的条件下用金修饰的石墨烯做基底构建一种用于高灵敏检测凝血酶的纸芯片。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：
1．在计算机上通过绘图软件设计如附图1和2所示的纸芯片、检测卡和辅助卡的蜡打印图案；
2．将设计好的打印图案打印到色谱纸上后进行烘烤、切割和丝网印刷电极；
3．将步骤2中得到的检测卡亲水区进行功能化，并用牛血清白蛋白封锁非活性位点；
4．在步骤2中得到的纸芯片按照折叠线折叠后如附图3所示，在反应区I发生目标蛋白和适配体链的识别后循环生成靶向模拟链，在反应区II加入血红素和富含鸟嘌呤的DNA链，生成G-四联体；
5．将步骤2中得到的辅助卡和检测卡嵌入折叠好的纸芯片的相关区域，然后在电路板的作用下用燕尾夹夹住如附图4所示反应一定时间，反应区I和反应区II的反应产物在中空通道和其上层半亲水区的毛吸管现象的作用下流入反应区Ⅲ，由于溶液的导通作用，反应区Ⅲ内的靶向模拟链被检测卡亲水区内的捕获探针捕获，在模拟链的作用下带有G-四联体的链相互杂交引入传感器表面；
6．将含有鲁米诺和过氧化氢的磷酸缓冲溶液从电路板的孔中滴入后，在G-四联体的催化作用下，鲁米诺产生化学发光，激发光敏材料，产生光电流信号，通过电化学工作站进行光电流信号的记录，实现目标蛋白的检测。
本发明所述的步骤1中是在计算机上利用Adobe illustrator CS6软件设计纸芯片、检测卡和辅助卡的打印图案，在CMYK模式下通过设定不同数值获得疏水区、亲水区和半疏水半亲水区域。
本发明所述的步骤2中是将打印后的色谱纸在80-150 ºC下加热50-120 s使蜡完全融化，分别在检测卡和辅助卡上打印碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极，纸芯片长宽分别为 60 mm和30 mm，检测卡和辅助板的工作区域分别为直径为6 mm和8 mm的圆形区域。本发明所述的氮掺杂的碳点制备步骤为：量取10 mL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基二甲氧基硅烷放入烧杯中，然后在搅拌下将0.125 g三聚氰胺和 0.5 g 柠檬酸加入烧杯形成均一溶液，将上述混合溶液加入到15 mL的石英微波反应容器后放入微波合成仪，在160 °C下反应15 min, 合成后的量子点存放于4 °C下备用。
本发明所述的所述的步骤3中功能化的具体步骤：
纸上生长金修饰的石墨烯: 滴加80 μL的石墨烯水溶液到检测卡的亲水区，室温下干燥，滴加和干燥的过程重复3 次后二次水洗涤，30 min后滴加120 μL金纳米种子，45 min后将80 μL含有抗坏血酸和氯金酸的混合溶液滴加到负载有金纳米种子的亲水区，反应15min 后二次水洗涤备用；
制备氧化锌：称取0.5 g醋酸锌于50 mL 超纯水中后搅拌，15 min后加入8 mL 2.0 M氢氧化钠溶液继续搅拌3 min，然后将上述溶液放入高压釜在200 °C环境下反应20 h，将反应后的产物离心洗涤，干燥后备用；
制备氮掺杂的碳点：量取10 mL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基二甲氧基硅烷放入烧杯中，然后在搅拌下将0.125 g三聚氰胺和 0.5 g 柠檬酸加入烧杯形成均一溶液，将上述混合溶液加入到15 mL的石英微波反应容器后放入微波合成仪，在160 °C下反应15 min, 合成后的量子点存放于4 °C下备用；
层层修饰过程：称量0.6 g 合成好的氧化锌溶于10 mL 浓度为 0.1 mM 的对巯基苯酚溶液中常温下搅拌4 h, 将修饰过的氧化锌用乙醇清洗后溶于2 mL二次水，移取100 μL氧化锌溶液滴加到长有金修饰的石墨烯检测卡亲水区，孵化2 h后二次水清洗，随后移取50 μL 氮掺杂的碳点于氧化锌上孵化30 min后用磷酸缓冲溶液清洗后，滴加60 μL 浓度为2.0μM的捕获探针于量子点修饰的检测卡上，孵化35 min后用磷酸缓冲溶液清洗，用50 μL 1%牛血清蛋白封锁非活性位点。
本发明的有益效果
（1）化学发光作为驱动有利于装置的微型化;
（2）在纸上合成金修饰的石墨烯为生物反应提供良好的微环境;
（3）蛋白和适配体链特异性结合、链循环和靶向模拟链技术的引入大大提高了检测的灵敏性;
（4）本发明构建的化学发光驱动光致电化学纸芯片成本低廉，操作简单，可以实现对凝血酶的灵敏检测。
附图说明
附图1：纸芯片的疏水蜡打印图案；
附图2：印有电极的检测卡和辅助卡；
附图3：折叠后的纸芯片模型；
附图4：纸基传感器的组装原理图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容。
实施例1
化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用，以凝血酶检测为例：
1. 在计算机上利用Adobe illustrator CS6软件设计如附图1和2所示的纸芯片、检测卡和辅助卡的打印图案，纸芯片长宽分别为 60 mm和30 mm，检测卡和辅助板的工作区域分别为直径为6 mm和8 mm的圆形区域，在CMYK模式下四分色参数设置如下：
| C（%） | M（%） | Y（%） | K（%） | |
| 疏水区 | 100 | 0 | 100 | 0 |
| 亲水区 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 半疏水半亲水区 | 0 | 0 | 60 | 0 |
2. 将打印后的色谱纸在100 ºC下加热45 s使蜡完全融化，分别在检测卡和辅助卡上如附图2所示打印碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极；
3．将步骤2中得到的检测卡亲水区进行功能化，并用牛血清白蛋白封锁非活性位点，具体步骤如下：
纸上生长金修饰的石墨烯: 滴加80 μL的石墨烯水溶液到检测卡的亲水区，室温下干燥，滴加和干燥的过程重复3 次后二次水洗涤，30 min后滴加120 μL金纳米种子，45 min后将80 μL含有抗坏血酸和氯金酸的混合溶液滴加到负载有金纳米种子的亲水区，反应15min 后二次水洗涤备用；
制备氧化锌：称取0.5 g醋酸锌于50 mL 超纯水中后搅拌，15 min后加入8 mL 2.0 M氢氧化钠溶液继续搅拌3 min，然后将上述溶液放入高压釜在200 °C环境下反应20 h，将反应后的产物离心洗涤，干燥后备用；
制备氮掺杂的碳点：量取10 mL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基二甲氧基硅烷放入烧杯中，然后在搅拌下将0.125 g三聚氰胺和 0.5 g 柠檬酸加入烧杯形成均一溶液，将上述混合溶液加入到15 mL的石英微波反应容器后放入微波合成仪，在160 °C下反应15 min, 合成后的量子点存放于4 °C下备用；
层层修饰过程：称量0.6 g 合成好的氧化锌溶于10 mL 浓度为 0.1 mM 的对巯基苯酚溶液中常温下搅拌4 h, 将修饰过的氧化锌用乙醇清洗后溶于2 mL二次水，移取100 μL氧化锌溶液滴加到长有金修饰的石墨烯检测卡亲水区，孵化2 h后二次水清洗，随后移取50 μL 氮掺杂的碳点于氧化锌上孵化30 min后用磷酸缓冲溶液清洗后，滴加60 μL 浓度为2.0μM的捕获探针于量子点修饰的检测卡上，孵化35 min后用磷酸缓冲溶液清洗，用50 μL 1%牛血清蛋白封锁非活性位点；
4．将步骤2中得到的纸芯片按照折叠线折叠后如附图3所示，在反应区I发生目标蛋白和适配体链的识别后循环生成靶向模拟链，在反应区II加入血红素和富含鸟嘌呤的DNA链，生成G-四联体，具体操作如下：
将发卡链1和和发卡链2溶于含有20 U 的T7核酸外切酶的60 μL三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，使发卡链1和和发卡链2的最终浓度分别为1.0 μM和3.0 μM，移取50 μL 混合液滴加到反应区I, 将一定浓度的凝血酶迅速加入反应区反应100 min, 40 min 后将富含鸟嘌呤的链3和链4稀释到60 μL 含2.0 μM 血红素和300 mM的 K+的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，使链3和链4的最终浓度均为10 μM, 移取50 μL 上述溶液于反应区II, 反应60 min 形成血红素/G-四联体；
5．将步骤2中得到的辅助卡和检测卡嵌入折叠好的纸芯片的相关区域，然后在电路板的作用下用燕尾夹夹住反应一定时间，反应区I和反应区II的反应产物在中空通道和其上层半亲水区的毛吸管现象的作用下流入反应区Ⅲ，由于溶液的导通作用，反应区Ⅲ内的靶向模拟链被检测卡亲水区内的捕获探针捕获，在模拟链的作用下带有G-四联体的链相互杂交引入传感器表面；
6．将80 μL含有浓度为0.5 mM鲁米诺和浓度为6.0 mM的过氧化氢pH为7.4的过氧化氢磷酸缓冲溶液从电路板的注入孔滴入后，在G-四联体的催化作用下，鲁米诺产生化学发光，激发光敏材料，产生光电流信号，通过电化学工作站进行光电流信号的记录，将步骤获得的数据计算处理后得到凝血酶的检测范围为50 fM-1000 pM，检测限为16.7 fM。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南大学
<120> 化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用
<130> 2017
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagcga 7
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttggtgtg gttggacacc a 21
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggtgtctgg ctcctgtgat tgtgctagag cacaatcaca ggagccagac a 51
<210> 4
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgggttggg cgggatgggt aatttttctg gctcctgtga ttgtgctcta gtttacatcg 60
ctagagcaca atcacagg 78
<210> 5
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgggttggg cgggatgggt aatttttcta gagcacaatc acaggagcca gtttcctgtg 60
attgtgctct agcgatgt 78
Claims (6)
1.化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用，其特征包括以下步骤：
1.1 在计算机上通过绘图软件设计纸芯片、检测卡和辅助卡的蜡打印图案；
1.2 将设计好的打印图案打印到色谱纸上后进行烘烤、切割和丝网印刷电极；
1.3 将步骤1.2中得到的检测卡亲水区进行功能化，并用牛血清白蛋白封锁非活性位点；
1.4 在步骤1.2中得到的纸芯片按照折叠线折叠后，在反应区I发生目标蛋白和适配体链的识别后循环生成靶向模拟链，在反应区II加入血红素和富含鸟嘌呤的DNA链，生成G-四联体；
1.5 将步骤1.2中得到的辅助卡和检测卡嵌入折叠好的纸芯片的相关区域，然后在电路板的作用下用燕尾夹夹住反应一定时间，反应区I和反应区II的反应产物在中空通道和其上层半亲水区的毛吸管现象的作用下流入反应区Ⅲ，由于溶液的导通作用，反应区Ⅲ内的靶向模拟链被检测卡亲水区内的捕获探针捕获，在模拟链的作用下带有G-四联体的链相互杂交引入传感器表面；
1.6 将含有鲁米诺和过氧化氢的磷酸缓冲溶液从电路板的孔中滴入后，在G-四联体的催化作用下，鲁米诺产生化学发光，激发光敏材料，产生光电流信号，通过电化学工作站进行光电流信号的记录，实现目标蛋白的检测。
2. 根据权利要求书1所述化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用，其特征是步骤1.1中是在计算机上利用Adobe illustrator CS6软件设计纸芯片、检测卡和辅助卡的打印图案，在CMYK模式下通过设定不同数值获得疏水区、亲水区和半疏水半亲水区域。
3. 根据权利要求书1所述化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用，其特征是步骤1.2中是将打印后的色谱纸在80-150 ºC下加热50-120 s使蜡完全融化，分别在检测卡和辅助卡上打印碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极，纸芯片长宽分别为 60 mm和30 mm，检测卡和辅助板的工作区域分别为直径为6 mm和8 mm的圆形区域。
4.根据权利要求书1所述化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用，其特征是步骤1.3功能化的具体步骤：
纸上生长金修饰的石墨烯: 滴加80 μL的石墨烯水溶液到检测卡的亲水区，室温下干燥，滴加和干燥的过程重复3 次后二次水洗涤，30 min后滴加120 μL金纳米种子，45 min后将80 μL含有抗坏血酸和氯金酸的混合溶液滴加到负载有金纳米种子的亲水区，反应15min 后二次水洗涤备用；
制备氧化锌：称取0.5 g醋酸锌于50 mL 超纯水中后搅拌，15 min后加入8 mL 2.0 M氢氧化钠溶液继续搅拌3 min，然后将上述溶液放入高压釜在200 °C环境下反应20 h，将反应后的产物离心洗涤，干燥后备用；
制备氮掺杂的碳点：量取10 mL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基二甲氧基硅烷放入烧杯中，然后在搅拌下将0.125 g三聚氰胺和 0.5 g 柠檬酸加入烧杯形成均一溶液，将上述混合溶液加入到15 mL的石英微波反应容器后放入微波合成仪，在160 °C下反应15 min, 合成后的量子点存放于4 °C下备用；
层层修饰过程：称量0.6 g 合成好的氧化锌溶于10 mL 浓度为 0.1 mM 的对巯基苯酚溶液中常温下搅拌4 h, 将修饰过的氧化锌用乙醇清洗后溶于2 mL二次水，移取100 μL氧化锌溶液滴加到长有金修饰的石墨烯检测卡亲水区，孵化2 h后二次水清洗，随后移取50 μL 氮掺杂的碳点于氧化锌上孵化30 min后用磷酸缓冲溶液清洗后，滴加60 μL 浓度为2.0μM的捕获探针于量子点修饰的检测卡上，孵化35 min后用磷酸缓冲溶液清洗，用50 μL 1%牛血清蛋白封锁非活性位点。
5.根据权利要求书1所述化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用，其特征是步骤1.4中反应区I 和反应区II中的操作步骤：
将发卡链1和和发卡链2溶于含有20 U 的T7核酸外切酶的60 μL三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，使发卡链1和和发卡链2的最终浓度分别为1.0 μM和3.0 μM，移取50 μL 混合液滴加到反应区I, 将一定浓度的凝血酶迅速加入反应区反应100 min, 40 min 后将富含鸟嘌呤的链3和链4稀释到60 μL 含2.0 μM 血红素和300 mM的 K+的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，使链3和链4的最终浓度均为10 μM, 移取50 μL 上述溶液于反应区II, 反应60 min 形成血红素/G-四联体。
6.根据权利要求书1所述化学发光驱动光致电化学纸基传感器的制备与应用，其特征是步骤1.6中鲁米诺的浓度为0.5 mM，过氧化氢浓度为6.0 mM， 磷酸缓冲溶液的pH为7.4。
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