JP2018531387A6 - 核酸アプタマー/ナノ銀プローブとexo i酵素に基づく電気化学的バイオセンサ。 - Google Patents
核酸アプタマー/ナノ銀プローブとexo i酵素に基づく電気化学的バイオセンサ。 Download PDFInfo
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Abstract
核酸アプタマー/ナノ銀プローブとEXO I酵素に基づく電気化学的バイオセンサを開示する。ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備える核酸アプタマーで修飾された銀ナノ粒子をターゲット生体分子を検出するバイオプローブとして、ターゲット物質により開始されて、相補的プローブとEXO I酵素によるサイクル切断増幅を補助として、DNAの相補的対合原理を利用して、該プローブは金電極の表面に集まり、ターゲット生体分子の濃度が大きいほど、誘導された核酸アプタマー/ナノ銀プローブの凝集程度が高くなり、さらに、ターゲット物質の認識過程にEXO Iエキソヌクレアーゼのターゲットサイクル増幅メカニズムを導入することで、該電気化学的バイオセンサはターゲット生体物質を高感度で効率良く検出できる。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
本発明は、電気化学的検出の技術分野に関し、具体的には、核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブとEXO I酵素のターゲットサイクル増幅戦略とに基づく電気化学的バイオセンサ及びその製造方法に関する。
電気化学的バイオセンサは、生物学的活性物質(たとえば、酵素、抗体、核酸、細胞等)を生体感受性モチーフとして、電極を信号変換器として生化学的信号を電気化学的信号に変換することによって検出目的を達成させるバイオセンサである。電気化学的バイオセンサは、電極において得られた電位、電流または静電容量等の電気信号を特徴として信号を検出するものであり、高い感度と高い選択性を有すると同時に、装置がシンプルで、製造コストが低く、容易に小型化でき、現場でリアルタイムに検出することができる等のユニークな利点を有し、既に生物医学、食品分析、環境モニタリング等の様々な分野に幅広く適用されている。
従来の電気化学的バイオセンサは、電気化学的信号の発生方式によってラベル付きタイプとラベルフリータイプに分類される。ラベル付きタイプの電気化学的バイオセンサは、DNA鎖にメチレンブルー、フェロセン等の電気活性物質を標識するため、操作しにくく、コストが高く、ラベルフリータイプの電気化学的バイオセンサにより置換されていく。ラベルフリータイプの電気化学的バイオセンサは、標識ステップを省略して、基質液における電気活性物質を直接用いて検出するため、コストと操作の複雑さを大幅に低下させる。その反面、基質液が使用されることによって、ラベルフリータイプの電気化学的バイオセンサは使用範囲が制限される上、バックグラウンド信号が大きく、感度が低く、安定性が悪い。
従って、現在、感度が高く安定性に優れたラベルフリータイプの生体分子検出方法が期待されている。
本発明は、従来技術の欠点に対して、核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブに基づく電気化学的バイオセンサ及びその製造方法と応用を提供することを目的とする。該電気化学的バイオセンサは、生体分子の検出に用いると、選択性に優れて、感度が高い等の利点を有する。
上記目的を達成させるために、本発明は下記技術案を採用する。
本発明は、ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備えてターゲット生体分子を検出するバイオプローブ(以下、バイオ捕捉プローブと呼ばれることがある)であって、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続された複数のプローブ本体とを備え、前記プローブ本体はターゲット物質に対して特異的認識機能を有する核酸アプタマー断片(以下、ターゲットアプタマーと呼ばれることがない)と該核酸アプタマー断片と部分相補的な塩基配列を構成する核酸断片(以下、捕捉プローブDNAと呼ばれることがある)とを含み、前記核酸アプタマー断片は前記核酸断片とハイブリダイゼーションして前記プローブ本体を形成し、前記核酸断片の3’末端がチオール化されており、
前記核酸断片の前記核酸アプタマー断片に対する競合ハイブリダイゼーション能力が前記ターゲット物質の核酸アプタマー断片に対するハイブリダイゼーション能力より低いバイオプローブを提供することを第一目的とする。
ナノ銀とナノ銀の表面に接続された複数のプローブ本体とを備え、前記プローブ本体はターゲット物質に対して特異的認識機能を有する核酸アプタマー断片(以下、ターゲットアプタマーと呼ばれることがない)と該核酸アプタマー断片と部分相補的な塩基配列を構成する核酸断片(以下、捕捉プローブDNAと呼ばれることがある)とを含み、前記核酸アプタマー断片は前記核酸断片とハイブリダイゼーションして前記プローブ本体を形成し、前記核酸断片の3’末端がチオール化されており、
前記核酸断片の前記核酸アプタマー断片に対する競合ハイブリダイゼーション能力が前記ターゲット物質の核酸アプタマー断片に対するハイブリダイゼーション能力より低いバイオプローブを提供することを第一目的とする。
本発明は、前記ターゲット生体分子を検出するバイオプローブを含む電気化学的バイオセンサであって、
前記ターゲット生体分子を検出するバイオプローブはターゲット物質により開始されて、競合反応を行って、前記核酸アプタマー断片を前記プローブ本体から離脱させてターゲット物質と特異的に結合するステップと、
EXO I酵素を加えて、EXO I酵素で前記一本鎖形態として存在する核酸アプタマー断片を加水分解し、ターゲット物質が遊離して前記プローブ本体中の核酸アプタマー断片と特異的に結合し続けて、加水分解と特異的結合に対応したターゲット信号の増幅サイクル反応を形成し、最終的に前記核酸断片(捕捉プローブDNA)に接続されたナノ銀を得るステップと、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続されて前記核酸断片の塩基と相補的であり、3’末端がチオール化された核酸断片(以下、相補的プローブDNAと呼ばれることがある)とを含む、相補的プローブ(以下、バイオ相補的プローブと呼ばれることがある)を加えるステップと、
塩基相補的対合の原理を利用して、得られた前記相補的プローブの塩基と相補的であるナノ銀が前記相補的プローブDNAを修飾した金電極の表面に集まり、金電極すなわち電気化学的バイオセンサを得るステップとを含む方法によって製造される電気化学的バイオセンサを提供することを第二目的とする。
前記ターゲット生体分子を検出するバイオプローブはターゲット物質により開始されて、競合反応を行って、前記核酸アプタマー断片を前記プローブ本体から離脱させてターゲット物質と特異的に結合するステップと、
EXO I酵素を加えて、EXO I酵素で前記一本鎖形態として存在する核酸アプタマー断片を加水分解し、ターゲット物質が遊離して前記プローブ本体中の核酸アプタマー断片と特異的に結合し続けて、加水分解と特異的結合に対応したターゲット信号の増幅サイクル反応を形成し、最終的に前記核酸断片(捕捉プローブDNA)に接続されたナノ銀を得るステップと、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続されて前記核酸断片の塩基と相補的であり、3’末端がチオール化された核酸断片(以下、相補的プローブDNAと呼ばれることがある)とを含む、相補的プローブ(以下、バイオ相補的プローブと呼ばれることがある)を加えるステップと、
塩基相補的対合の原理を利用して、得られた前記相補的プローブの塩基と相補的であるナノ銀が前記相補的プローブDNAを修飾した金電極の表面に集まり、金電極すなわち電気化学的バイオセンサを得るステップとを含む方法によって製造される電気化学的バイオセンサを提供することを第二目的とする。
前記核酸断片(捕捉プローブDNA)に接続されたナノ銀としては、ナノ銀に上記核酸断片(捕捉プローブDNA)だけが接続される場合と、ナノ銀に上記核酸断片(捕捉プローブDNA)以外、前記プローブ本体が接続される場合がある。
本発明に係る核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブとEXO I酵素のターゲットサイクル増幅策略とに基づく電気化学的バイオセンサの製造方法は、具体的に、以下のステップを含む。
(1)バイオ捕捉プローブの製造
ジスルフィド結合を開裂した捕捉プローブDNAとターゲットアプタマーとを相補的に対合して、プローブ本体溶液(二本鎖DNA溶液)を形成し、前記プローブ本体溶液とナノ銀コロイドを混合して反応させて、3’末端がチオール化されたバイオ捕捉プローブを得る。
(2)バイオ相補的プローブの製造
ジスルフィド結合を開裂したステップ(1)の前記捕捉プローブDNAの塩基相補的プローブDNAとナノ銀コロイドを混合して反応させ、DNAの3’末端がチオール化されたバイオ相補的プローブを得る。
(3)バイオ捕捉プローブの認識及び酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
ステップ(1)で得られたバイオ捕捉プローブ、ターゲット物質及びEXOIエキソヌクレアーゼを混合して反応させる。
(4)電気化学的バイオセンサの製造
ステップ(3)で得られた溶液をステップ(2)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、電気化学的バイオセンサを得る。
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以上のステップの順番は必要に応じて調整してもよい。
ステップ(1)では、ターゲットアプタマーはターゲット物質に特異的に結合され、好ましくは、前記ターゲット物質がリゾチームである場合、前記捕捉プローブのDNA配列は、SEQID NO:1に示されるように、5’−A CTC TTT AGC CCT GAT−C6−SH−3’であり、リゾチームアプタマー配列は、SEQID NO:2に示されるように、5’− ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG−3’である。
前記ターゲット物質がγインターフェロン(IFN−γ)である場合、前記捕捉プローブのDNA配列は、SEQID NO:4に示されるように、5´− CC AAC ACA ACC AAC CCC−C6−SH−3´であり、γインターフェロンアプタマー配列は、SEQID NO:5に示されるように、5´−GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGT GTC CAA CCC C−3´である。
好ましくは、捕捉プローブDNAの濃度は100μM、ターゲットアプタマーの濃度は100μMである。前記捕捉プローブDNA、ターゲットアプタマー及びナノ銀コロイドの体積比率は(0.5〜1.5):(0.5〜1.5):100である。
プローブのジスルフィド結合を開裂するために、チオール化類還元剤を用いる等の方法が採用可能であり、好ましくは、前記ジスルフィド結合を開裂した捕捉プローブDNAの製造方法は、捕捉プローブDNAとトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを含有する溶液を反応させてジスルフィド結合を開裂することであり、前記トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを含有する溶液において、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)の濃度が0.01M、PBの濃度が0.01M、NaClの濃度が0.1Mであり、反応時間が0.5〜1.5h(好ましくは1h)である。
前記プローブ本体溶液(二本鎖DNA溶液)の具体的な反応ステップでは、35〜40℃で1.5〜2.5時間反応させ、好ましくは37℃で2h反応させる。
前記混合反応の条件としては、密封遮光下、35〜40℃で撹拌して5〜6h反応させ、2〜6℃で10〜14h反応させる。
バイオ捕捉プローブをさらに安定化させるために、2〜6℃で10〜14h反応させた後、撹拌しながら反応物にPBS緩衝液を加えてpHを調整し、次にNaCl溶液を加え、密封遮光下、2〜4h撹拌して、密封遮光下、2〜6℃で一晩(反応時間10〜24h)反応させた後、PBSで遠心洗浄して、バイオ捕捉プローブを得る。
ステップ(2)では、ターゲット物質がリゾチームである場合、相補的プローブDNA配列は、SEQID NO:3に示されるように、5’−ATC AGG GCT AAA GAG T−C6−SH−3’ であり、ターゲット物質がγインターフェロンである場合、相補的プローブDNA配列は、SEQID NO:6に示されるように、5´−GGG GTT GGT TGT GTT GG−C6−SH −3´であり、その濃度が100μMである。前記相補的プローブDNAとナノ銀コロイドの体積比率は0.5〜1.5:100である。
プローブのジスルフィド結合を開裂するために、チオール化類還元剤を用いる等の方法が採用可能であり、好ましくは、前記ジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNAの製造方法は、相補的プローブDNAとトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを含有する溶液とを反応させてジスルフィド結合を開裂することであり、前記トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを含有する溶液において、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)の濃度が0.01M、PBの濃度が0.01M、NaClの濃度が0.1Mであり、反応時間が0.5〜1.5h(好ましくは1h)である。
前記混合反応の条件としては、密封遮光下、35〜40℃で撹拌して5〜6h反応させ、2〜6℃で10〜14h反応させる。
バイオ相補的プローブをさらに安定化させるために、2〜6℃で10〜14h反応させた後、撹拌しながら反応物にPBS緩衝液を加えてpHを調整し、次にNaCl溶液を加え、密封遮光下、2〜4h撹拌して、密封遮光下、2〜6℃で(反応時間10〜24h)反応させた後、PBSで遠心洗浄して、バイオ相補的プローブを得る。
ステップ(1)(2)では、前記ナノ銀の製造方法は以下のとおりである。氷水浴において、激しく撹拌しながら、1回に1ミリリットル滴下する速度で0.002 M硝酸銀を緩慢にその体積に対して2〜2.5倍の0.003M水素化ホウ素ナトリウムに加えて、硝酸銀の滴下が終了した後、5分間かけて連続して激しく撹拌し、得られた反応物を沸騰水浴に移して、3〜5分間加熱した直後、所定量の0.003M水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、温水浴から取り出して激しく撹拌して室温まで冷却させ、製造されたナノ銀コロイドを王水で浸漬された茶色瓶に移して、遮光下、4℃で保存する。
ステップ(3)では、前記ターゲット物質は所定濃度を有する被測定物または濃度が未知の被測定物であり、前記混合反応の条件としては、35〜40℃で0.5〜1.5h反応させ、好ましくは37℃で1h反応させる。
前記ステップ(1)で得られたバイオ捕捉プローブとターゲット物質との体積比率は1:1〜2、EXOIエキソヌクレアーゼの添加量は15〜25Uであり、好ましくは、前記ステップ(1)で得られたバイオ捕捉プローブとターゲット物質との体積比率は1:1、EXOIエキソヌクレアーゼの添加量は20Uである。
ステップ(4)では、ステップ(3)で得られた溶液とステップ(2)で得られたバイオ相補的プローブとの体積比率は1:1〜2、好ましくは1:1である。
前記金電極について研磨処理を施す必要がある。研磨処理のステップとしては、金電極をアルミナパウダーで研磨し、次に、再蒸留水で洗浄し、さらにエタノールと再蒸留水においてそれぞれ超音波洗浄を行って、乾燥させて研磨処理済みの金電極を得る。具体的には、ウォッシュレザーにおいて0.3μmと0.05μmのアルミナパウダーで順次研磨し、研磨後、まず再蒸留水で洗浄して、次にエタノールと再蒸留水においてそれぞれ超音波洗浄を20−25s行って、窒素ガスで吹き干す。
前記相補的プローブDNAを修飾した金電極の製造方法には、前記相補的プローブDNAをTCEPで2時間反応させてジスルフィド結合を開裂し、ここで、相補的プローブDNAのジスルフィド結合を開裂した反応系において、DNAの濃度を1μM、TCEPの濃度を0.01M、PBの濃度を0.01M、NaClの濃度を0.1Mにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNAを研磨処理済みの金電極において24時間浸入して、前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を得るステップを含む。
前記混合反応の条件としては、35〜40℃で1.5〜2.5h反応させ、好ましくは37℃で振とう反応を2h行う。
本発明第三目的は、上記電気化学センサの生体分子濃度検出における応用を提供することである。前記生体分子は、ATP、アミノ酸、ヌクレオチド、毒素、酵素、成長因子、細胞接着分子、ウィルス、細菌及び細胞またはアプタマーとしてスクリーニング可能なほかの生体分子を含む。本発明の発明構想に基づき、各種生体分子の濃度、たとえばリゾチーム、γインターフェロン、ATPまたはその他生体分子を検出できる。その応用方法は、
標準濃度を有する各ターゲット物質の電気化学的バイオセンサについてLSV検出を行って、異なる標準濃度を有するターゲット物質のLSVピーク電流を取得する、電気化学的検出をするステップ(1)と、
ステップ(1)のLSVピーク電流についてターゲット物質の濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得る、検量線を作成するステップ(2)と、
実際サンプルの電気化学センサを用いて電気化学的検出を行って、対応したLSVピーク電流を得て、LSVピーク電流をステップ(2)の検量線に代入して、実際サンプルにおけるターゲット物質の濃度を得る、実際サンプルを検出するステップ(3)とを含む。
標準濃度を有する各ターゲット物質の電気化学的バイオセンサについてLSV検出を行って、異なる標準濃度を有するターゲット物質のLSVピーク電流を取得する、電気化学的検出をするステップ(1)と、
ステップ(1)のLSVピーク電流についてターゲット物質の濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得る、検量線を作成するステップ(2)と、
実際サンプルの電気化学センサを用いて電気化学的検出を行って、対応したLSVピーク電流を得て、LSVピーク電流をステップ(2)の検量線に代入して、実際サンプルにおけるターゲット物質の濃度を得る、実際サンプルを検出するステップ(3)とを含む。
ステップ(1)では、LSV検出条件としては、金電極を作用電極、カロメル電極を参照電極、白金線電極をコントラスト電極として三電極システムを構成してLSV検出を行う。
LSV検出液はPBS緩衝液、具体的に0.2M PBSである。その調製方法としては、Na2HPO4・2H2O 1.78gを水1000mLに溶解して、Na2HPO4水溶液を得て、NaH2PO4・H2O 1.38gを水1000mLに溶解して、NaH2PO4水溶液を得て、Na2HPO4水溶液810mL、NaH2PO4水溶液190mL及びNaCl 11.69gを均一に混合して、pH7.4の0.2M PBSを得る。
上記技術案のうち、1つの技術案は下記有益な効果を有する。
(1)本発明に係る核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブとEXO I酵素のターゲット策略とに基づく電気化学的バイオセンサは、新規なラベルフリー電気化学的バイオセンサであり、ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備える核酸アプタマーで修飾された銀ナノ粒子をターゲット生体分子を検出するバイオプローブとして、ターゲット物質により開始されて、相補的プローブとEXO I酵素によるサイクル切断増幅を補助として、DNAの相補的対合原理を利用して、該プローブは金電極の表面に集まり、ターゲット生体分子の濃度が大きいほど、誘導された核酸アプタマー/ナノ銀プローブの凝集程度が高くなり、さらに、ターゲット物質の認識過程にEXO Iエキソヌクレアーゼのターゲットサイクル増幅メカニズムを導入することで、該電気化学的バイオセンサはターゲット生体物質を高感度で効率よく検出できる。
(2)他の操作に比べて、本発明は、初めて電気化学的バイオセンサに認識と信号発生の2種の機能を備える核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブを適用することによって、従来のラベルフリー検出方法に使用される信号基質を省略して、該バイオセンサの操作を簡便にして、安定性を高め、検出限界を低下させて、感度を高め、選択性を向上させる。
(3)本発明では、電気化学的検出方法の使用により、操作を簡便にして、コストを削減させ、検出速度及び効率を高め、容易に小型化できる等の利点を付与し、現場でリアルタイムに迅速に検出できる。このため、核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブに基づく電気化学的バイオセンサは生体分子を検出するための新規な高感度方法を提供する。
(1)本発明に係る核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブとEXO I酵素のターゲット策略とに基づく電気化学的バイオセンサは、新規なラベルフリー電気化学的バイオセンサであり、ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備える核酸アプタマーで修飾された銀ナノ粒子をターゲット生体分子を検出するバイオプローブとして、ターゲット物質により開始されて、相補的プローブとEXO I酵素によるサイクル切断増幅を補助として、DNAの相補的対合原理を利用して、該プローブは金電極の表面に集まり、ターゲット生体分子の濃度が大きいほど、誘導された核酸アプタマー/ナノ銀プローブの凝集程度が高くなり、さらに、ターゲット物質の認識過程にEXO Iエキソヌクレアーゼのターゲットサイクル増幅メカニズムを導入することで、該電気化学的バイオセンサはターゲット生体物質を高感度で効率よく検出できる。
(2)他の操作に比べて、本発明は、初めて電気化学的バイオセンサに認識と信号発生の2種の機能を備える核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブを適用することによって、従来のラベルフリー検出方法に使用される信号基質を省略して、該バイオセンサの操作を簡便にして、安定性を高め、検出限界を低下させて、感度を高め、選択性を向上させる。
(3)本発明では、電気化学的検出方法の使用により、操作を簡便にして、コストを削減させ、検出速度及び効率を高め、容易に小型化できる等の利点を付与し、現場でリアルタイムに迅速に検出できる。このため、核酸アプタマー/ナノ銀バイオプローブに基づく電気化学的バイオセンサは生体分子を検出するための新規な高感度方法を提供する。
以下、実施例を利用して本発明について更に説明する。
実験に使用される装置及び試薬
(1)装置
CHI650電気化学ワークステーション(上海辰華装置有限公司製);飽和カロメル電極(SCE)を参照電極、白金線電極を対電極とする。
(2)試薬
リゾチームアプタマー、γインターフェロンアプタマー及びレポートプローブ(上海生工生物工程股▲ふん▼有限公司製)
ほかの試薬はすべて分析的に純粋なものであり、実験用水は二次蒸留水である。
(1)装置
CHI650電気化学ワークステーション(上海辰華装置有限公司製);飽和カロメル電極(SCE)を参照電極、白金線電極を対電極とする。
(2)試薬
リゾチームアプタマー、γインターフェロンアプタマー及びレポートプローブ(上海生工生物工程股▲ふん▼有限公司製)
ほかの試薬はすべて分析的に純粋なものであり、実験用水は二次蒸留水である。
実施例1
リゾチームを検出する電気化学的バイオセンサの製造方法は、図1に示すように、以下のステップを含む。
(1)ナノ銀の製造
氷水浴において0.003M水素化ホウ素ナトリウム100mlを250ml三つ口丸底フラスコに投入して、前後にある2つの開口をシールして、激しく撹拌した。ピペットガンを用いて、1回に1ミリリットル滴下するように0.002M硝酸銀50mLを、10ml添加する毎に2分間を空けるように緩慢に水素化ホウ素ナトリウムに加え、硝酸銀の添加が終了した後、5min連続して激しく撹拌した。丸底フラスコを沸騰水浴に入れて、3〜5分間加熱した直後、迅速に0.003M水素化ホウ素ナトリウム溶液を10ml加えた。フラスコを温水浴から取り出して、続けて激しく撹拌して室温まで冷却させた。製造されたナノ銀コロイドを王水で浸漬された茶色瓶に移して、遮光下、4℃で保存した。
(2)捕捉プローブの製造
捕捉プローブDNA(5’−A CTC TTT AGC CCT GAT−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:1)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にリゾチームアプタマー(5’− ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG−3’;配列 SEQID NO:2)10μLを加えて水浴鍋に入れて37℃で2時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて緩やかに撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5’−ATC AGG GCT AAA GAG T−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:3)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(4)標準濃度を有するリゾチーム溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBS緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するリゾチーム溶液を調製した。
(5)捕捉プローブの認識と酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するリゾチーム100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において37℃で1時間放置した。
(6)相補的プローブDNAを修飾した金電極の製造
金電極の研磨処理
金電極をウォッシュレザーにおいて0.3umと0.05umのAl2O3で順次研磨して鏡面に仕上げて、順次エタノール、再蒸留水で超音波洗浄を20−25秒間行い、次に0.5M硫酸溶液において、掃引速度を0.1V/sとしてサイクリックボルタンメトリーを行って、安定的になると、蒸留水できれいに洗浄して、窒素ガスで吹き干した。
前記相補的プローブDNAをTCEPで2時間反応させてジスルフィド結合を開裂して、ここで、相補的プローブDNAのジスルフィド結合を開裂した反応系において、DNAの濃度を1μM、TCEPの濃度を0.01M、PBの濃度を0.01M、NaClの濃度を0.1Mにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNAを研磨処理済みの金電極に24時間浸入して、前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を得た。
(7)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(5)で得られた各溶液をステップ(3)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
(1)ナノ銀の製造
氷水浴において0.003M水素化ホウ素ナトリウム100mlを250ml三つ口丸底フラスコに投入して、前後にある2つの開口をシールして、激しく撹拌した。ピペットガンを用いて、1回に1ミリリットル滴下するように0.002M硝酸銀50mLを、10ml添加する毎に2分間を空けるように緩慢に水素化ホウ素ナトリウムに加え、硝酸銀の添加が終了した後、5min連続して激しく撹拌した。丸底フラスコを沸騰水浴に入れて、3〜5分間加熱した直後、迅速に0.003M水素化ホウ素ナトリウム溶液を10ml加えた。フラスコを温水浴から取り出して、続けて激しく撹拌して室温まで冷却させた。製造されたナノ銀コロイドを王水で浸漬された茶色瓶に移して、遮光下、4℃で保存した。
(2)捕捉プローブの製造
捕捉プローブDNA(5’−A CTC TTT AGC CCT GAT−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:1)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にリゾチームアプタマー(5’− ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG−3’;配列 SEQID NO:2)10μLを加えて水浴鍋に入れて37℃で2時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて緩やかに撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5’−ATC AGG GCT AAA GAG T−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:3)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(4)標準濃度を有するリゾチーム溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBS緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するリゾチーム溶液を調製した。
(5)捕捉プローブの認識と酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するリゾチーム100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において37℃で1時間放置した。
(6)相補的プローブDNAを修飾した金電極の製造
金電極の研磨処理
金電極をウォッシュレザーにおいて0.3umと0.05umのAl2O3で順次研磨して鏡面に仕上げて、順次エタノール、再蒸留水で超音波洗浄を20−25秒間行い、次に0.5M硫酸溶液において、掃引速度を0.1V/sとしてサイクリックボルタンメトリーを行って、安定的になると、蒸留水できれいに洗浄して、窒素ガスで吹き干した。
前記相補的プローブDNAをTCEPで2時間反応させてジスルフィド結合を開裂して、ここで、相補的プローブDNAのジスルフィド結合を開裂した反応系において、DNAの濃度を1μM、TCEPの濃度を0.01M、PBの濃度を0.01M、NaClの濃度を0.1Mにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNAを研磨処理済みの金電極に24時間浸入して、前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を得た。
(7)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(5)で得られた各溶液をステップ(3)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
実施例2
(1)捕捉プローブの製造
捕捉プローブDNA(5’−A CTC TTT AGC CCT GAT−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:1)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にリゾチームアプタマー(5’− ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG−3’;配列 SEQID NO:2)10μLを加えて水浴鍋において37℃で1.5時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、5℃で13時間反応させた。13時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(2)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5’−ATC AGG GCT AAA GAG T−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:3)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、5℃で13時間反応させた。13時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)標準濃度を有するリゾチーム溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBS緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するリゾチーム溶液を調製した。
(4)捕捉プローブの認識及び酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するリゾチーム100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において35℃で1.5時間放置した。
(5)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(4)で得られた各溶液をステップ(2)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に実施例1のステップ(6)の相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、修飾された電極を取り出しいて、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
捕捉プローブDNA(5’−A CTC TTT AGC CCT GAT−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:1)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にリゾチームアプタマー(5’− ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG−3’;配列 SEQID NO:2)10μLを加えて水浴鍋において37℃で1.5時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、5℃で13時間反応させた。13時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(2)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5’−ATC AGG GCT AAA GAG T−C6−SH−3’;配列 SEQID NO:3)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、5℃で13時間反応させた。13時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)標準濃度を有するリゾチーム溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBS緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するリゾチーム溶液を調製した。
(4)捕捉プローブの認識及び酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するリゾチーム100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において35℃で1.5時間放置した。
(5)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(4)で得られた各溶液をステップ(2)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に実施例1のステップ(6)の相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、修飾された電極を取り出しいて、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
実施例3
実施例1で製造された電気化学的バイオセンサによって、リゾチームの濃度を測定する方法は、以下のステップを含む。
(1)電気化学的検出
実施例1で得られた各電極を取り出した後、0.01M PBで2−3回洗浄して、電極を0.2M PBSの検出液に浸入して、カロメル参照電極と白金線コントラスト電極とともに三電極システムを構成して、LSV検出を行った。
(2)検量線の作成
標準濃度を有するリゾチームが認識されたLSVピーク電流について、リゾチーム濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得た。図2に示すように、該線形回帰方程はI=0.5068lgC+0.67798、R2=0.997、線形範囲は1.5pM−10nM、検出限界は290fM(S/N=3)であった。
(3)実際サンプルの検出
実際サンプルについて実施例1の方法によって操作を行って、得られたピーク電流を検量線に代入して、実際サンプルにおけるリゾチームの濃度を得た。
リゾチームの検出結果から明らかなように、異なる濃度のリゾチームは、ピーク電流の曲線が顕著に変化しており、リゾチームは、1.5pM−10nMの濃度範囲で良好な線形関係を示し、本発明に係る電気化学的バイオセンサによるリゾチームの検出限界は290fMと低くなる。
(1)電気化学的検出
実施例1で得られた各電極を取り出した後、0.01M PBで2−3回洗浄して、電極を0.2M PBSの検出液に浸入して、カロメル参照電極と白金線コントラスト電極とともに三電極システムを構成して、LSV検出を行った。
(2)検量線の作成
標準濃度を有するリゾチームが認識されたLSVピーク電流について、リゾチーム濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得た。図2に示すように、該線形回帰方程はI=0.5068lgC+0.67798、R2=0.997、線形範囲は1.5pM−10nM、検出限界は290fM(S/N=3)であった。
(3)実際サンプルの検出
実際サンプルについて実施例1の方法によって操作を行って、得られたピーク電流を検量線に代入して、実際サンプルにおけるリゾチームの濃度を得た。
リゾチームの検出結果から明らかなように、異なる濃度のリゾチームは、ピーク電流の曲線が顕著に変化しており、リゾチームは、1.5pM−10nMの濃度範囲で良好な線形関係を示し、本発明に係る電気化学的バイオセンサによるリゾチームの検出限界は290fMと低くなる。
実施例4
γインターフェロンを検出する電気化学的バイオセンサの製造方法は、以下のステップを含む:
(1)ナノ銀の製造
実施例1のナノ銀の製造ステップと同様であった。
(2)捕捉プローブの製造
捕捉プローブDNA(5´− CC AAC ACA ACC AAC CCC−C6−SH−3´;配列 SEQID NO:4)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にγインターフェロンアプタマー(5´−GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGT GTC CAA CCC C−3´;配列 SEQID NO:5)10μLを加えて水浴鍋において37℃で2時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5´−GGG GTT GGT TGT GTT GG−C6−SH −3´;配列 SEQID NO:6)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(4)標準濃度を有するγインターフェロン溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBSの緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するγインターフェロン溶液を調製した。
(5)捕捉プローブの認識と酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するγインターフェロン100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において37℃で1時間放置した。
(6)相補的プローブDNAを修飾した金電極の製造
金電極の研磨処理
金電極をウォッシュレザーにおいて0.3umと0.05umのAl2O3で順次研磨して鏡面に仕上げて、順次エタノール、再蒸留水で超音波洗浄を20−25秒間行い、次に0.5M硫酸溶液において、掃引速度を0.1V/sとしてサイクリックボルタンメトリーを行って、安定的になると、再蒸留水できれいに洗浄して、窒素ガスで吹き干した。
前記相補的プローブDNAをTCEPで2時間反応させてジスルフィド結合を開裂して、ここで、相補的プローブDNAのジスルフィド結合を開裂した反応系において、DNAの濃度を1μM、TCEPの濃度を0.01M、PBの濃度を0.01M、NaClの濃度を0.1Mにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNAを研磨処理済みの金電極に24時間浸入して、前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を得た。
(7)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(5)で得られた各溶液をステップ(3)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
(1)ナノ銀の製造
実施例1のナノ銀の製造ステップと同様であった。
(2)捕捉プローブの製造
捕捉プローブDNA(5´− CC AAC ACA ACC AAC CCC−C6−SH−3´;配列 SEQID NO:4)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にγインターフェロンアプタマー(5´−GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGT GTC CAA CCC C−3´;配列 SEQID NO:5)10μLを加えて水浴鍋において37℃で2時間反応させて、二本鎖を形成した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加えて、次に二本鎖DNAを加えてシールして、遮光下で5〜6時間かけて低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(3)相補的プローブの製造
相補的プローブDNA(5´−GGG GTT GGT TGT GTT GG−C6−SH −3´;配列 SEQID NO:6)10μLを2mL遠心分離管に投入して、捕捉プローブDNAに0.01M TCEP(0.01M PB、0.1M NaCl)溶液2μLを加えて1時間静置してジスルフィド結合を開裂した。3mLガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド1mlを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNA 10μLを加えて、密封遮光下、5〜6時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、4℃で12時間反応させた。12時間後、反応瓶に0.1M PBS緩衝溶液122μLを加えてpHを調整し、低速撹拌した。1回に1μL添加する速度で2M NaCl溶液21μLを加えた後、密封遮光下、3時間低速撹拌し、密封遮光下、4℃で一晩放置した後、0.1M PBSで遠心洗浄した。
(4)標準濃度を有するγインターフェロン溶液の調製
超純水を用いて100uM母液を調製して、0.1M PBSの緩衝溶液で母液を希釈して0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nMの濃度勾配を有するγインターフェロン溶液を調製した。
(5)捕捉プローブの認識と酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
2mL遠心分離管に捕捉プローブ100μLと勾配濃度を有するγインターフェロン100uLとを加え、次に20 U EXO I エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において37℃で1時間放置した。
(6)相補的プローブDNAを修飾した金電極の製造
金電極の研磨処理
金電極をウォッシュレザーにおいて0.3umと0.05umのAl2O3で順次研磨して鏡面に仕上げて、順次エタノール、再蒸留水で超音波洗浄を20−25秒間行い、次に0.5M硫酸溶液において、掃引速度を0.1V/sとしてサイクリックボルタンメトリーを行って、安定的になると、再蒸留水できれいに洗浄して、窒素ガスで吹き干した。
前記相補的プローブDNAをTCEPで2時間反応させてジスルフィド結合を開裂して、ここで、相補的プローブDNAのジスルフィド結合を開裂した反応系において、DNAの濃度を1μM、TCEPの濃度を0.01M、PBの濃度を0.01M、NaClの濃度を0.1Mにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブDNAを研磨処理済みの金電極に24時間浸入して、前記相補的プローブDNAを修飾した金電極を得た。
(7)電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ(5)で得られた各溶液をステップ(3)で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に相補的プローブDNAを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。
実施例4における電気化学的バイオセンサを用いてLSV検出を行い、試験した結果、本発明における実施例4で製造された電気化学的バイオセンサはγインターフェロンの濃度を検出することができ、異なる濃度を有するγインターフェロンに対してピーク電流曲線が顕著に変化しており、本発明に係る電気化学的バイオセンサはγインターフェロンに対する検出限界がfM級と低くなる。
上記実施例は、本発明の好適な実施形態であるが、本発明の実施形態は上記実施例により制限されず、本発明の主旨及び原理を逸脱することなく、想到し得る変化、修飾、置換、組み合わせ、簡略化はいずれも同等置換形態とされて、本発明の保護範囲に含まれる。
Claims (10)
- ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備えてターゲット生体分子を検出するバイオプローブであって、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続された複数のプローブ本体とを備え、前記プローブ本体はターゲット物質に対して特異的認識機能を有する核酸アプタマー断片と該核酸アプタマー断片と部分相補的な塩基配列を構成する核酸断片とを含み、前記核酸アプタマー断片は前記核酸断片とハイブリダイゼーションして前記プローブ本体を形成し、前記核酸断片の3’末端がチオール化されており、
前記核酸断片の前記核酸アプタマー断片に対する競合ハイブリダイゼーション能力が前記ターゲット物質の核酸アプタマー断片に対するハイブリダイゼーション能力より低い
ことを特徴とするバイオプローブ。 - 請求項1に記載のバイオプローブの製造方法であって、
ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片と核酸アプタマー断片を相補的に対合して、プローブ本体溶液を形成するステップと、
前記プローブ本体溶液とナノ銀コロイドを混合して反応させ、ターゲット生体分子を検出するバイオプローブを得るステップとを含む
ことを特徴とするバイオプローブの製造方法。 - ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片は、
前記核酸断片とトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを含有する溶液とを反応させてジスルフィド結合を開裂して、ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片を得る方法によって製造されるものであり、
好ましくは、前記プローブ本体溶液の反応ステップでは、35〜40℃で1.5〜2.5時間反応させ、
好ましくは、前記混合反応の条件としては、密封遮光下、35〜40℃で撹拌しながら5〜6h反応させ、2〜6℃で10〜14h反応させ、
より好ましくは、2〜6℃で10〜14h反応させた後、撹拌しながら反応物にPBS緩衝液を加えてpHを調整し、次にNaCl溶液を加え、密封遮光下、2〜4h撹拌し、密封遮光下、2〜6℃で10〜24h反応させた後、PBSで遠心洗浄して、ターゲット生体分子を検出するバイオプローブを得る
請求項2に記載の製造方法。 - 請求項1に記載のバイオプローブを含む電気化学的バイオセンサであって、
前記ターゲット生体分子を検出するバイオプローブはターゲット物質により開始されて、競合反応を行って、前記核酸アプタマー断片を前記プローブ本体から離脱させてターゲット物質と特異的に結合するステップと、
EXO I酵素を加えて、EXO I酵素で前記一本鎖形態として存在する核酸アプタマー断片を加水分解し、ターゲット物質が遊離して前記プローブ本体中の核酸アプタマー断片と特異的に結合し続けて、加水分解と特異的結合に対応したターゲット信号の増幅サイクル反応を形成し、最終的に前記核酸断片に接続されたナノ銀を得るステップと、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続されて前記核酸断片の塩基と相補的であり、3’末端がチオール化された複数の核酸断片とを含む、相補的プローブを加えるステップと、
塩基相補的対合の原理を利用して、得られた前記相補的プローブの塩基と相補的であるナノ銀が前記相補的プローブDNAを修飾した金電極の表面に集まり、金電極すなわち電気化学的バイオセンサを得るステップとを含む方法によって製造される
ことを特徴とする電気化学的バイオセンサ。 - 前記相補的プローブは、
ジスルフィド結合を開裂して前記核酸断片の塩基と相補的である核酸断片とナノ銀コロイドとを混合して反応させ、相補的プローブを得る方法によって製造されるものであり、
好ましくは、ジスルフィド結合を開裂して前記核酸断片の塩基と相補的である核酸断片は、
前記核酸断片の塩基と相補的である核酸断片とトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを含有する溶液とを反応させてジスルフィド結合を開裂して、ジスルフィド結合を開裂して前記核酸断片の塩基と相補的である核酸断片を得る方法によって製造されるものであり、
好ましくは、前記混合反応の条件としては、密封遮光下、35〜40℃で撹拌して5〜6h反応させ、2〜6℃で10〜14h反応させ、
より好ましくは、2〜6℃で10〜14h反応させた後、撹拌しながら反応物にPBS緩衝液を加えてpHを調整し、次にNaCl溶液を加え、密封遮光下、2〜4h撹拌して、密封遮光下、2〜6℃で10〜24h反応させた後、PBSで遠心洗浄して、相補的プローブを得る
請求項4に記載の電気化学的バイオセンサ。 - 請求項4または5に記載の電気化学的バイオセンサの生体分子濃度検出における応用。
- 前記生体分子は、ATP、アミノ酸、ヌクレオチド、毒素、酵素、成長因子、細胞接着分子、ウィルス、細菌及び細胞またはアプタマーとしてスクリーニング可能なその他の生体分子を含む
請求項6に記載の応用。 - 標準濃度を有する各ターゲット物質の電気化学的バイオセンサについてLSV検出を行って、異なる標準濃度を有するターゲット物質のLSVピーク電流を取得する、電気化学的検出をするステップ(1)と、
ステップ(1)のLSVピーク電流についてターゲット物質の濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得る、検量線を作成するステップ(2)と、
実際サンプルの電気化学センサを用いて電気化学的検出を行って、対応したLSVピーク電流を得て、LSVピーク電流をステップ(2)の検量線に代入して、実際サンプルにおけるターゲット物質の濃度を得る、実際サンプルを検出するステップ(3)とを含む
請求項6または7に記載の応用。 - LSV検出条件としては、金電極を作用電極、カロメル電極を参照電極、白金線電極をコントラスト電極として三電極システムを構成してLSV検出を行う
請求項8に記載の応用。 - LSV検出液はPBS緩衝液である
請求項9に記載の応用。
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