CN111337679A - 一种基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器及其制备方法和应用，该适配体传感器利用近距离杂交和分裂适配体的优势对外泌体进行定量分析，通过将巯基修饰的捕获DNA固定在金电极表面，三氯化六氨合钌作为电活性物质，将目标外泌体和带有适配体的DNA链加入，靶诱导的近距离杂交将外泌体捕获在金电极上得到，自组装的DNA可吸附较多的三氯化六氨合钌，从而产生较高的峰值电流。本发明传感器对于外泌体检测具有较好的线性关系，检出限低，同时能够实现对多种细胞分泌的外泌体表面蛋白含量进行分析，并且可以完成对复杂生物样品中外泌体的检测，本发明的适配体传感器在临床诊断中具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物电化学传感器技术领域，具体涉及一种基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
外泌体(exosome)是由活细胞分泌的具有脂质双分子层的囊泡小体，粒径在30-150nm之间。肿瘤细胞来源的外泌体可以参与肿瘤微环境和转移位形成的调节，且具有稳定性好、体液中含量高等特点，对其进行灵敏、准确的检测对癌症的早期诊断和治疗监控具有极其重要意义，是癌症液体活检的重要检测物。肿瘤外泌体表面具有多种来源于母细胞的特征蛋白，这些蛋白的种类和含量与肿瘤的种类，发展及治疗具有紧密的联系，所以一些肿瘤细胞来源的外泌体携带的特殊蛋白质成为癌症诊断的重要生物标志物。迄今为止，已经开发了多种方法用于肿瘤外泌体的检测，如比色法，荧光法，表面增强拉曼法，表面等离子体法。这些方法中大多数需要昂贵的仪器，比色法操作简单，但灵敏度不高，其它方法尽管具有很高的灵敏度，但需要制备特定的材料，要求比较高，且费时费力。因此，需要简单有效的方法来实现肿瘤外泌体的检测。电化学方法以其廉价、便携和灵敏度高等优点，在肿瘤外泌体检测中显示出独特的优越性。
适配体是一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，具有与抗体相媲美的亲和力与特异性。通过指数富集的配体进化技术(SELEX)，可以从特定的寡核苷酸库中筛选出能与目标物(如蛋白、小分子、离子等)特异性结合的分子探针。适配体较抗体更容易获得(可通过化学合成，不依赖于动物和细胞)，利于储存且稳定性高。分裂适配体是将原始的适配体序列分裂成两个或多个片段，在没有目标的情况下，这些片段一般不能形成相对完整的结构，在目标存在的情况下，这些片段能能够聚集靠近，形成识别构型，并与目标物结合。2000年自Stojanovic等报道第一篇可卡因分裂适配体以来，分裂适配体在小分子、蛋白及细胞检测领域引起了广泛的关注，然而，到目前为止，还没有分裂适配体用于肿瘤外泌体检测的报道。
发明内容
发明的目：针对现有技术存在的问题，尤其是检测外泌体的复杂过程，本发明提供一种基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，该电化学传感器可以采用简便的电化学传感方法，该方法将分裂型适配体和近距离杂交原理有机结合，方法操作简单、成本低等优点，对于癌细胞来源的外泌体进行定量检测。
本发明还提供基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，由捕获DNA链通过巯基修饰在电极表面，再将电极孵化在含有分裂适配体DNA链的外泌体溶液中孵化形成。
具体的，由于细胞外泌体和带有适配体的DNA链的加入，靶诱导的近距离杂交将外泌体捕获在金电极表面。其中，细胞外泌体和带有适配体的DNA链与捕获DNA链修饰后的电极孵化，近距离杂交的影响会将外泌体捕获在金电极表面，其中捕获DNA链是通过巯基修饰在电极表面的。
其中，所述捕获DNA序列为(SEQ ID NO.1)5’-ATC CTC AGC AAC CTC AGC AGC G-SH-3’，所述分裂型适配体DNA链包含分裂适配体的序列S1(SEQ ID NO.2)为5’-GCT GAGGTT ATC AAG ACT TTT TTT ATC ACA TCA GGC TCT AGC GTA TGC TAT TGC TGT ACG GTTAGA-3’，分裂适配体的序列S2(SEQ ID NO.3)为5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAAAAT ACG TCC AGA ACT TTA CCA AAC CAC ACC CTT TT T TTG TCT TGG CTG AGG AT-3’。
作为优选，所述传感器以三氯化六氨合钌(RuHex)作为电活性物质，以捕获DNA链及分裂型适配体DNA链作为识别元素。
其中，所述电极为金电极，所述外泌体为肿瘤细胞分泌的外泌体，尤其是含有PTK7蛋白的肿瘤细胞分泌的外泌体，如人宫颈癌(HeLa)细胞或者人急性淋巴白血病(CEM)细胞等分泌的外泌体。
本发明所述的基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，包括如下步骤：
将捕获DNA、三(2-甲酰乙基)磷酸盐(TCEP)和三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液共同孵育后断开二硫键进行巯基化；巯基化捕获DNA链滴在电极表面孵化，连接到电极表面；然后用6-巯基-1-己醇(MCH)封闭未结合的特异性位点，随后电极在包含分裂适配体和细胞分泌的外泌体溶液中孵化得到。
进一步地，所述细胞分泌的外泌体溶液包括不同浓度2.375×106，4.75×106，9.5×106，2.375×107，4.75×107，9.5×107，4.75×108，9.5×108particles/mL，具体由人宫颈癌(HeLa)细胞或者人急性淋巴白血病(CEM)细胞等分泌的外泌体溶液等分泌的外泌体溶液。
本发明所述的基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器在检测外泌体中的应用。
其中，所述基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器在检测含有PTK7蛋白的肿瘤细胞(如HeLa细胞、CEM细胞等)分泌的外泌体中的应用。
作为优选，所述基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器在检测外泌体时工作电极为金，参比电极为饱和甘汞，辅助电极为铂。
其中，所述基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器在检测外泌体时使用三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)(pH＝7.4)缓冲液作为检测液，三氯化六氨合钌(RuHex)作为电活性物质。
本发明所述的基于近距离杂交的分裂适配体检测肿瘤外泌体的电化学传感方法可应用于对不同细胞分泌外泌体的分析检测。
本发明所述的基于近距离杂交的分裂适配体检测肿瘤外泌体的电化学传感方法可用于对复杂生物样品中外泌体的分析检测。
作为优选，基于近距离杂交的分裂适配体检测肿瘤外泌体的电化学传感制备方法和检测方法，包括以下步骤：
(1)电化学传感器的制备
选用金电极作为适配体传感器平台，三氯化六氨合钌(RuHex)为电活性物质，对金电极进行预处理，将6μL 10μM的捕获DNA、6μL 10mM三(2-甲酰乙基)磷酸盐(TCEP)和48μL三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液共同孵育2小时断开二硫键进行巯基化。10μL 0.1μM巯基化的捕获DNA滴在金电极表面在4℃下孵化3小时，以金-硫键的方式将捕获DNA连接到金电极表面。然后，在室温下2小时，将电极浸泡在6-巯基-1-己醇(MCH)溶液中，目的是占据金电极表面空余的位点，对未结合的特异性位点进行封闭。最后，电极在50μL包含40nM S1、40nM S2和不同浓度的外泌体的溶液中4℃下孵化1小时。每一步结束后，用10mM PBS(pH＝7.4)缓冲溶液清洗修饰后的电极，洗脱非特异性吸附的物质。
(2)癌细胞来源外泌体的检测
捕获DNA链修饰的电极在50μL包含40nM S1、40nM S2和不同浓度的外泌体的溶液中4℃下孵化1小时，靶诱导的近距离杂交将外泌体捕获在金电极表面。自组装的DNA可吸附较多的三氯化六氨合钌(RuHex)，产生较高的峰值电流，从而实现对外泌体的定量分析。
步骤(1)(2)中捕获孵化外泌体的最佳温度为4℃，最佳时间为60分钟。
(3)不同癌细胞来源外泌体的检测
在同一浓度下，取不同癌细胞来源的外泌体，每个样品用六根电极做平行试验，操作步骤如上述(1)和(2)，实现对不同细胞来源的外泌体的检测分析。
所述不同癌细胞来源外泌体包括人宫颈癌(HeLa)细胞、人急性淋巴白血病(CEM)细胞外泌体等。
本发明的工作原理是：首先通过在金电极表面修饰上捕获DNA，之后将目标外泌体和带有适配体的DNA链加入，靶诱导的近距离杂交将外泌体捕获在金电极上。自组装的DNA可吸附较多的三氯化六氨合钌(RuHex)，从而产生较高的峰值电流，通过分析实现传感器的灵敏电化学信号转导及其定量关系构建。本发明需要在含有细胞的外泌体溶液中孵育，分裂的适配体才能够由于近距离杂交去识别外泌体表面的蛋白，组装在电极表面形成传感器；如果没有外泌体存在，这两条带有分裂适配体的链无法组装在电极表面。
步骤(1)(2)(3)中，电化学活性物质为三氯化六氨合钌(RuHex)，检测溶液为10mMTris-HCl(pH＝7.4)缓冲液，信号记录方式为示差脉冲伏安法(DPV)。
本发明适配体传感器利用近距离杂交和分裂适配体的优势对外泌体进行定量分析。本发明通过将巯基修饰的捕获DNA固定在金电极表面，将含有能够特异性识别PTK7蛋白的适配体及能够与捕获DNA链杂交的DNA序列分裂成两段，三氯化六氨合钌(RuHex)作为电活性物质。在目标含有PTK7蛋白的肿瘤细胞分泌的外泌体和这两段DNA链存在的情况下，外泌体诱导的近距离杂交将外泌体捕获在金电极上，靶诱导的近距离杂交将外泌体捕获在金电极上。自组装的DNA可吸附较多的三氯化六氨合钌(RuHex)，从而产生较高的峰值电流。本发明的适配体传感器在2.375×106～9.5×108个/mL范围内，对人宫颈癌(HeLa)细胞等分泌的外泌体检测具有较好的线性关系，检出限为6.607×105个/mL。本发明的适配体传感器制备过程简单，该适配体传感器可以完成对复杂生物样品中外泌体的检测，且具有很好的特异性，能够实现对多种细胞分泌的外泌体表面蛋白含量进行分析，具有好的选择性，能够对区分含有不同量的PTK7蛋白的外泌体，实现了含有PTK7蛋白的外泌体的选择性检测，表示本发明的适配体传感器在临床诊断中具有较好的应用前景。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明构建的适配体传感器可以方便、简洁、快速地对癌细胞来源的外泌体进行定量检测。相比于现有技术方法，构建的传感器有以下优点：(1)利用分裂适配体和近距离杂交的原理实现对外泌体的定量分析，过程简便，特异性强；(2)使用适配体代替抗体与目标结合，提高了系统的灵敏度和稳定性；(3)避免了因为使用抗体，需要复杂的标记处理过程，操作简单、快速；(4)适配体比抗体稳定，不易受外界环境因素的影响，例如：温度、pH等；(5)本发明使用的分裂适配体能够特异性检测PTK-7蛋白；(6)本发明的基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器制备简单，使用方便，检测范围宽，检测限低，效果显著，可以大规模生产使用。
附图说明
图1是本发明提出的一种基于近距离杂交和分裂适配体的优势对外泌体进行定量分析的电化学方法检测原理示意图；
图2是电化学传感器可行性分析示意图；
图3是电化学传感器检测外泌体含量的结果示意图；
图4是本发明在复杂生物样品中外泌体的检测示意图；
图5是本发明对不同细胞外泌体表面蛋白PTK7的检测分析示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明提出的一种基于近距离杂交和分裂适配体的优势对外泌体进行定量分析的电化学方法检测原理示意图，具体原理如下：
如图1所示，裸的金电极作为工作电极(如图1A)，巯基修饰以后的捕获DNA链被固定在金电极表面，修饰后的电极用6-巯基-1-己醇(MCH)封闭未反应的活性位点(如图1B)，三氯化六氨合钌(RuHex)作为电活性物质。在无外泌体存在下，带有适配体的DNA链无法与电极表面的捕获DNA杂交(如图1C)；目标外泌体和带有适配体的DNA链的加入，靶诱导的近距离杂交将外泌体捕获在金电极表面(如图1D)。
实施例1
如图1所示步骤，制备电化学适配体传感器。
(1)制备实验体系所需的缓冲溶液和DNA缓冲溶液；
(2)制备捕获DNA修饰的电极；
(3)加入S1、S2和待测外泌体溶液；
(4)使用三电极体系，在电化学工作站上对信号进行记录。
步骤(1)中制备的缓冲液为10mM三羟甲基氨基甲烷Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液用于作为检测液及DNA链的储存液。
步骤(2)中，对金电极进行预处理。将6μL 10μM的捕获DNA、6μL 10mM三(2-甲酰乙基)磷酸盐(TCEP)和48μL 10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液共同孵育2小时断开二硫键。10μL 0.1μM巯基化的捕获DNA滴在金电极(GE)表面在4℃下孵化3小时，以金-硫键的方式连接到金电极表面。然后，用6-巯基-1-己醇(MCH)封闭未结合的特异性位点，在室温下2小时。
步骤(3)中将步骤(2)得到的电极在50μL包含40nM S1、40nM S2和9.5×108particles/mL HeLa细胞产生的外泌体在4℃下与捕获DNA链孵化1小时，制备得到电化学适配体传感器。步骤(1)(2)(3)中每一步结束后，用10mM PBS(pH＝7.4)清洗修饰后的电极，洗脱非特异性吸附的物质。
捕获DNA序列为5’-ATC CTC AGC AAC CTC AGC AGC G-SH-3’，所述分裂型适配体DNA链包含分裂适配体的序列S1为5’-GCT GAG GTT ATC AAG ACT TTT TTT ATC ACA TCAGGC TCT AGC GTA TGC TAT TGC TGT ACG GTT AGA-3’，分裂适配体的序列S2为5’-ATC TAACTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACG TCC AGA ACT TTA CCA AAC CAC ACC CTT TT T TTGTCT TGG CTG AGG AT-3’。
所用到的外泌体的制备过程：肿瘤细胞系在含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养，细胞培养的最适温度和气体环境分别为37℃与5％CO2。当细胞密度为整个细胞培养瓶的80-90％的时候，将它们在不含10％胎牛血清(FBS)的DMEM的培养基中饥饿培养48小时。收集的培养液在4℃，300g RCF下离心10分钟，接着在2000g RCF下离心20分钟，去除多余的细胞、细胞碎屑，11000g RCF下离心30分钟，然后用0.22μm滤头将培养液过滤。上层清液在110000g RCF下超速离心120分钟，得到外泌体沉淀。得到的外泌体颗粒被重悬浮于PBS(pH7.4)中，并在-20℃保存。首先，用无菌的PBS(pH 7.4)缓冲液稀释得到的外泌体颗粒，用纳米粒子追踪分析(NTA)的原理对外泌体进行定量检测。人宫颈癌(HeLa)细胞的外泌体浓度为9.5×108particles/μL，所获得的外泌体颗粒保存在-20℃下以供进一步使用。
步骤(4)中在CHI 760C电化学工作站(中国，上海)上对电化学信号进行记录。实验采用三电极体系：工作电极为已经修饰的金电极，对电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极。DPV的实验参数设置如下：电压扫描范围为-0.5V–+0.1V；振幅为0.5V；脉冲宽度为0.01s；脉冲周期为0.2s。电化学检测在含有5μM三氯化六氨合钌(RuHex)的10mM Tris-HCl(pH＝7.4)检测液中进行。
如图2所示，捕获DNA显示较低的电化学信号(曲线a)，而在没有外泌体存在的情况下(以等量不含外泌体的PBS代替)，捕获DNA与S1和S2孵育后，电化学信号几乎没有增加(曲线b)，表明S1、S2与捕获DNA在无外泌体存在的情况下无法组装在电极表面。然而在目标外泌体存在下，由于近距离杂交的影响，电化学信号显著增加(曲线c)，信号强度的变化取决于外泌体的浓度。通过比较有无目标外泌体存在的情况下测量得到的信号差值，可以用该传感器来对外泌体进行定量分析和检测。
实施例2
本发明的适配体传感器对不同浓度的外泌体进行分析检测
利用本发明的实施例1制备的适配体传感器，按照上述实施例1的步骤和检测，在步骤(3)中加入不同浓度2.375×106，4.75×106，9.5×106，2.375×107，4.75×107，9.5×107，4.75×108，9.5×108particles/mL，对HeLa细胞分泌的外泌体进行分析检测。
结果如图3所示，该适配体传感器的检测范围为2.375×106～9.5×108particles/mL内，检出限为6.607×105particles/mL。
图3A所示，DPV的信号强度随着外泌体浓度从2.375×10 6particles/mL-9.5×108particles/mL增加而增强。在图3B所示的外泌体浓度的对数范围内，可以观察外泌体浓度的对数与ΔI(ΔI＝I-I0,I、I0分别是在有外泌体和无外泌体存在下的DPV峰值电流)之间具有一个线性相关方程。线性回归方程为I(μA)＝-2.95097+0.54817logC(particles/mL)，相关系数(R)为0.99197，检出限为6.607×10 5particles/mL。结果表明，所制备的适配体传感器具有检测限低、具有合理的相对标准偏差和灵敏度高等特点，表明该适配体传感器在外泌体检测的过程中拥有广阔的分析应用前景。
实施例3
本发明的适配体传感器对复杂生物样品中外泌体进行分析检测
利用本发明实施例1制备的适配体传感器，按照上述实施例1的步骤和检测，在步骤(3)中将得到的人宫颈癌(HeLa)细胞外泌体(4.75×108particles/mL)在PBS(pH＝7.4)和含15％、65％UC FBS(超速离心的FBS)的PBS(pH＝7.4)溶液中进行实验。通过在PBS和含(15％和65％)UC FBS的PBS中加入相同数量的外泌体来比较信号强度。这三个获得的信号强度没有显著差异。因此，所制备的适配体传感器在复杂的生物样品中具有很好的稳定性，结果如图4所示。
实施例4
本发明的适配体传感器对不同细胞外泌体进行分析检测
利用本发明的实施例1制备的适配体传感器，按照上述实施例1的步骤和检测，在步骤(3)中加入不同细胞HeLa细胞、Ramos细胞和CEM细胞外泌体(浓度均为4.75×108particles/mL)进行分析检测。本发明研究了适配体传感器对HeLa细胞、Ramos细胞和CEM细胞外泌体的选择性。如图5所示，相同浓度CEM细胞和HeLa细胞产生的外泌体表面PTK7蛋白的含量有显著差异。检测的信号CEM细胞明显高于HeLa细胞分泌的外泌体，说明PTK7在CEM细胞外泌体的表达高于HeLa细胞分泌的外泌体。然而，检测的Ramos细胞分泌的外泌体信号值较低，表明在Ramos细胞来源的外泌体表面PTK7蛋白含量较低，这些结果与亲本细胞表面PTK7蛋白的含量一致。为了证明外泌体的选择性，对CEM细胞和Ramos细胞外泌体混合物中的CEM细胞外泌体进行检测(混合物中CEM细胞和Ramos细胞稀释在单独检测相同体积的溶液中，稀释后的外泌体浓度与单独检测时的一致)，电流强度与单独对CEM细胞外泌体检测的电流强度几乎相同。因此，实验结果表明本发明的传感器可以对HeLa细胞、CEM细胞外泌体均可以定量检测，并且能够特异性检测不同细胞外泌体表面的PTK-7蛋白。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcctcagca acctcagcag cg 22
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgaggtta tcaagacttt ttttatcaca tcaggctcta gcgtatgcta ttgctgtacg 60
gttaga 66
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatacg tccagaactt taccaaacca cacccttttt 60
ttgtcttggc tgaggat 77
Claims (10)
1.一种基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，其特征在于，由捕获DNA链通过巯基修饰在电极表面，再将电极孵化在含有分裂适配体DNA链的外泌体溶液中孵化形成。
2.根据权利要求1所述的基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，其特征在于，所述捕获DNA链序列为5’-ATC CTC AGC AAC CTC AGC AGC G-SH-3’，所述分裂型适配体DNA链包含分裂适配体的序列S1为5’-GCT GAG GTT ATC AAG ACT TTT TTT ATC ACA TCA GGCTCT AGC GTA TGC TAT TGC TGT ACG GTT AGA-3’，分裂适配体的序列S2为5’-ATC TAA CTGCTG CGC CGC CGG GAA AAT ACG TCC AGA ACT TTA CCA AAC CAC ACC CTT TT T TTG TCTTGG CTG AGG AT-3’。
3.根据权利要求1所述的基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，其特征在于，所述传感器以三氯化六氨合钌(RuHex)作为电活性物质，以捕获DNA链及分裂型适配体DNA链作为识别元素。
4.根据权利要求1所述的基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，其特征在于，所述电极为金电极。
5.根据权利要求1所述的基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，其特征在于，所述外泌体为肿瘤细胞分泌的外泌体，优选包括人宫颈癌(HeLa)细胞或人急性淋巴白血病(CEM)细胞外泌体。
6.一种权利要求1所述的于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器，其特征在于，包括如下步骤：
将捕获DNA、三(2-甲酰乙基)磷酸盐(TCEP)和三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液共同孵育后断开二硫键进行巯基化；巯基化的捕获DNA链滴在电极表面在孵化，连接到电极表面；然后用6-巯基-1-己醇(MCH)甲基丙烯酸甲酯封闭未结合的特异性位点，随后电极在包含分裂适配体DNA链和的细胞分泌的外泌体溶液中孵化得到。
7.一种权利要求1所述的基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器在检测外泌体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器在检测含有PTK7蛋白的肿瘤细胞分泌的外泌体中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器在检测外泌体时工作电极为金，参比电极为饱和甘汞，辅助电极为铂。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基于分裂型适配体近距离杂交的电化学传感器在检测外泌体时使用三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)(pH＝7.4)缓冲液作为检测液，三氯化六氨合钌(RuHex)作为电活性物质。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200626 |
|
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