CN110702911B - 一种银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤标志物的靶向检测方法 - Google Patents

一种银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤标志物的靶向检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种银纳米团簇印迹聚合物及其在肿瘤标志物靶向检测中的应用，以设计获得的PSA智能适配体为基础，对其优化改造提高特异性结合能力，并以其为模板合成银纳米团簇，结合印迹聚合物的特异性识别优势制备银纳米团簇印迹聚合物，探究银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤组织中PSA的靶向识别应用。本发明有望为提高肿瘤标志物的靶向识别提供新的研究思路，对临床上癌症的靶向诊断和治疗具有重要意义。

Description

一种银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤标志物的靶向检测方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种银纳米团簇印迹聚合物及其在肿瘤标志物靶向检测中的应用。
背景技术
目前，对肿瘤标志物的靶向识别是癌症靶向诊断与治疗中的重要环节，对于降低癌症死亡率具有重要意义。传统的靶向识别技术因生物抗体的来源问题在应用上受到极大限制。核酸适配体因其具有易合成、无毒、易修饰、缺乏免疫原性等优势在特异性分析领域得到广泛应用。然而，由于大多数肿瘤标志物在正常组织中也有表达，因此适配体仍然会靶向于正常组织，所以提高适配体对肿瘤组织中生物标志物的靶向性势在必行。肿瘤组织的弱酸性是区别于正常组织的重要生理特征，在对酸响应的材料中，由于DNA i-motif在酸性环境中具有构象自发且快速转变的能力，在DNA纳米技术中受到广泛关注。已有研究发现利用i-motif功能化可以调节适配体在酸性环境中与肿瘤标志物的特异性结合，但是结合能力相对较弱，因此，还需继续对经i-motif功能化的适配体进行进一步优化改造，从而提高对肿瘤标志物的特异性识别。
发明内容
本发明的目的是提供一种银纳米团簇印迹聚合物，以前期获得的前列腺癌标志物（PSA）智能适配体为基础，对其优化改造提高特异性结合能力，并以其为模板合成银纳米团簇，结合印迹聚合物的特异性识别优势制备银纳米团簇印迹聚合物，探究银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤组织中PSA的靶向识别应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：
一种银纳米团簇印迹聚合物，是在肿瘤标志物智能适配体的胞嘧啶区合成银纳米团簇，然后以银纳米团簇为荧光信号响应基团，通过表面印迹法对肿瘤标志物进行印迹得到具有介孔结构的银纳米团簇印迹聚合物；
所述肿瘤标志物智能适配体包括胞嘧啶区、i-motif区、连接区和适配体区。
进一步地，所述肿瘤标志物为前列腺癌标志物PSA。
进一步地，所述肿瘤标志物PSA的智能适配体序列为NH2 (CH2)3 CCCCCCC GGGCCC CCT TTT CCC CCA CTA ACT AAT TAA AGC TCG CCA TCA AAT AGC GGT TAG ACC CCCTTT TCC CCC（SEQ ID NO. 1）。
上述银纳米团簇印迹聚合物在制备肿瘤标志物靶向识别试剂中的应用，可用于提高肿瘤标志物的靶向识别。
进一步地，所述肿瘤标志物为前列腺癌标志物PSA。
如图1所示，在本发明的一个实施例中，以设计获得的PSA智能适配体为基础，对其优化改造提高特异性结合能力，并以其为模板合成银纳米团簇，结合印迹聚合物的特异性识别优势制备银纳米团簇印迹聚合物，探究银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤组织中PSA的靶向识别应用。本发明有望为提高肿瘤标志物的靶向识别提供新的研究思路，对临床上癌症的靶向诊断和治疗具有重要意义。
有益效果：
（1）对PSA智能适配体优化改造得到在酸性条件下与PSA特异性结合能力较强的智能适配体。
（2）调控反应条件，在不影响智能适配体特异性结合能力的前提下，以其为模板制备得到性质稳定的银纳米团簇。
（3）基于银纳米团簇制备得到PSA印迹的银纳米团簇印迹聚合物，提高在酸性环境中对PSA的识别靶向性，并且具备稳定性好、低毒性、灵敏度高、重复性好等优点。
附图说明
图1为本发明的银纳米团簇印迹聚合物的合成及检测示意图。
图2为实施例1中PSA智能适配体的微量热泳动测定结果。
图3为实施例1中银纳米团簇的合成示意图。
图4为实施例1中银纳米团簇印迹聚合物的合成示意图。
图5为实施例1中银纳米团簇印迹聚合物的结构示意图。
具体实施方式
发明人前期基于肿瘤组织的弱酸性特质以及i-motif结构特性，以前列腺癌标志物PSA的适配体为例，对其进行设计改造得到了i-motif功能化的PSA智能适配体，利用智能适配体中i-motif在不同pH下的构象转变来调节适配体的特异性结合能力，初步实验表明，PSA智能适配体可以在酸性环境中与PSA特异性结合，但是结合能力相对较弱，需要对其进行优化改造以获得结合能力较强的智能适配体。
现有研究表明阐明i-motif通过影响连接区状态进而调节适配体区的特异性结合能力，而连接区的碱基序列长度对识别区的结合能力影响较大，因此本发明首先通过设计不同的连接区序列对智能适配体进行优化改造。通过微量热泳动技术（MST）探究连接区序列不同的智能适配体在酸性环境中与PSA的特异性结合能力，分析结果得到结合能力较强的智能适配体。之后基于智能适配体分子中胞嘧啶与Ag+的强相互作用，在不改变智能适配体性质的基础上，以智能适配体为分子模板，通过调控反应条件，比如温度、pH值、浓度、反应时间等，制备得到性质稳定、光学性能优异的银纳米团簇，并对其性能、粒径大小进行表征。最后，为进一步提高银纳米团簇的化学稳定性和检测灵敏度，在不影响银纳米团簇光学性能的前提下，以银纳米团簇为荧光信号响应基团，通过表面印迹法对PSA进行印迹、洗脱得到具有介孔结构的银纳米团簇印迹聚合物，并对其性能、形貌、结构和组分进行表征。
除此之外，将前列腺癌标志物PSA的智能适配体序列改变成其它肿瘤标志物的适配体序列，同样可以实现对其他肿瘤标志物的靶向识别。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1.基于智能适配体的银纳米团簇的获得
（1）PSA智能适配体的优化
①智能适配体的改造。由于前期已经获得PSA智能适配体（SP-Apt I），如表1所示，SP-Apt I由四部分组成：胞嘧啶区（CCCCCCC）、i-motif区（CCC CCT TTT CCC, ACC CCC TTTTCC CCC）、连接区（CTA ACT, GGT TAG）和适配体区（AAT TAA AGC TCG CCA TCA AAT AGC）。
表1. SP-Apt I序列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
微量热泳动技术（MST）结果表明SP-Apt I在酸性环境中可以与PSA特异性结合，但是在酸性环境中两者结合能力相对较弱，为提高SP-Apt I与PSA在酸性环境中的特异性结合能力，需要对SP-Apt I进行优化改造。根据文献报道，i-motif通过影响连接区状态进而调节适配体区的特异性结合能力，而连接区的碱基序列长度对适配体区的特异性结合能力影响较大，因此下面通过改变连接区序列长度对SP-Apt I进行改造得到不同智能适配体。
在本实施例中，采用的连接区有：ACT TGG, AACT TTGG, TAACT ATTGG, TCTAACTAGATTGG。
②结合能力测定。通过微量热泳动技术（MST）探究不同的智能适配体与PSA在酸性环境中的特异性结合能力，选取特异性结合能力较强的智能适配体。
具体步骤如下：
a、PSA荧光标记：将电泳纯PSA溶液加入含有缓冲盐的混匀A柱，4℃、3000rpm离心2分钟，即得置换缓冲液蛋白液；标记缓冲液稀释PSA溶液；加入DMSO溶解固体染料，混匀体系使染料充分溶解；按等体积比例混合染料及蛋白，室温避光孵育；向B柱中加入标记缓冲液，依靠重力沉降平衡B柱。将标记反应液加至B柱，冲洗液加入B柱，重复冲洗洗脱收集标记蛋白。
b、络合反应的测定：利用含CaCl2的Tris-HCl缓冲溶液连续梯度稀释PSA智能适配体溶液，将其移至新反应管中，然后将荧光标记的PSA加入至无菌微量EP管中，反复吹打溶液，使反应液混合均匀，孵育5分钟后，用Monolith NT.115仪器测定PSA智能适配体与PSA作用的解离常数（Kd）。
通过微量热泳动技术（MST）分别测定了上述不同连接区的PSA智能适配体在pH=6.5及7.3条件下与PSA之间的结合能力。如图2所示，数据分析表明在pH=6.5条件下，PSA智能适配体与PSA之间的解离常数（Kd）为107.7±2.9 nM；当在pH=7.3条件下，Kd=757±19.1μM。以上结果说明PSA智能适配体与PSA在pH=6.5条件下具有较强的结合能力，验证了PSA智能适配体可以与酸性环境中的PSA进行特异性结合。
（2）银纳米团簇的合成
①由于胞嘧啶与Ag+间存在很强的相互作用，为防止i-motif中的胞嘧啶参与银纳米团簇合成，首先用i-motif的互补碱基链保护i-motif序列。
②银纳米团簇的合成方法如图3所示，将3μM上述智能适配体模板分子与18 μMAgNO3在磷酸钠缓冲液（20 mM , pH 7.5）中混合搅拌1分钟后，在黑暗条件、4℃下反应20分钟，之后加入18 μM新鲜制备的NaBH4溶液（Ag NO3 / NaBH4 / DNA = 6:6:1），在黑暗条件下继续反应2小时后得到Ag NCs。
2.银纳米团簇印迹聚合物的制备
PSA印迹的银纳米团簇印迹聚合物的制备是采用表面印迹法，如图4所示。
具体步骤如下：
① SiO2@AgNCs是通过SiO2与AgNCs中的羧基与氨基缩合反应制备得到。
a、SiO2的表面羧基化修身：首先，将乙醇（3 mL）与超纯水（5 mL）混合，在剧烈搅拌条件下，向混合溶液中分别加入100μL TEOS 和200μL氨水，反应继续搅拌2小时，然后，向体系中加入3-(三乙氧基硅基)丙基琥珀酸酐(10mL)继续反应12h。沉淀经离心、洗涤（水与乙醇混合液）、干燥后得到表面有羧基修饰的SiO2。
b、SiO2@AgNCs的制备：首先，通过EDC和NHS将SiO2表面的羧基进行活化，然后将SiO2（6 mg）分散在MES（pH = 5.2, 0.1 mM, 5 mL）缓冲溶液中，之后将AgNCs（1 mL）溶液逐滴加入，反应在室温、黑暗条件下进行12小时，最终将沉淀经离心、PBS（0.01 M, pH = 7.3）洗涤、干燥得到SiO2@AgNCs。
②介孔印迹聚合物的制备。主要原料为功能单体MAA、交联剂MBA、引发剂APTES、CTAB、TEOS、SiO2@AgNCs、PSA模板分子等，其中，CTAB作为形成介孔结构的模板。首先，将等浓度的PSA与MAA（2 mg）在100μL缓冲溶液（PBS, pH = 7.5，10 mM）中反应，然后向混合溶液中加入SiO2@AgNCs，随后加入MBA（2 mg）、CTAB及TEOS，体系在37°C下反应12小时，之后加入APTES（0.3 μL）进行聚合，反应继续在37°C下进行12小时。最后离心收集沉淀物，在超声条件下，分别用水/乙醇混合液洗去CTAB、用乙酸/SDS混合溶液洗去PSA，制备得到具有介孔结构的银纳米团簇印迹聚合物。银纳米团簇印迹聚合物的剖面结构示意图如图5所示。
3.银纳米团簇及银纳米团簇印迹聚合物的表征
（1）银纳米团簇的表征
采用UV-Vis光谱、荧光光谱、IR光谱等手段对光谱性质进行表征；利用TEM、SEM等对粒径尺寸、形貌进行表征；通过ESI-MS对团簇组分进行分析；利用XPS分析团簇中元素组成及价态。
（2）银纳米团簇印迹聚合物的表征
通过UV-Vis光谱、荧光光谱、IR光谱、CD色谱等手段对光谱性质进行表征；利用SEM对形貌、尺寸进行分析；通过XRD、ESI-MS对结构和组分进行分析。
4. 银纳米团簇印迹聚合物对PSA的靶向识别研究
（1）体外功能分析
①优化检测条件：用PBS缓冲溶液模拟肿瘤环境（pH 6.5），在此条件下，固定银纳米团簇印迹聚合物的浓度不变，调控体系中PSA浓度、盐浓度、响应时间、温度等条件，通过荧光光谱仪监测体系的荧光性能变化，确立最佳检测条件。
②特异性探究：
a、酸性环境特异性：用缓冲溶液模拟肿瘤环境（pH 6.5）和正常生理环境（pH7.3），在①中最佳检测条件下，固定银纳米团簇印迹聚合物和PSA两者浓度，用荧光光谱仪监测两者在不同pH下的荧光性能变化情况。
b、目标分子特异性：在缓冲溶液pH 6.5条件下，在①中最佳检测条件下，选择同浓度的其他肿瘤标志物及常见蛋白质，比如AFP、CEA、HCG、HSA、BSA、CA125、HIgG等，用荧光光谱仪监测不同肿瘤标志物及蛋白质与银纳米团簇印迹聚合物反应的荧光响应情况，并与PSA响应的结果进行对比分析。
③灵敏度探究：在缓冲溶液pH 6.5条件下，在最佳检测条件下，固定银纳米团簇印迹聚合物浓度不变，不断改变PSA浓度，用荧光光谱仪记录荧光变化，以荧光变化值（F-F0）与PSA浓度（[PSA]）做线性拟合，求得银纳米团簇印迹聚合物对PSA的检测限，分析灵敏度。此外，用同样的方法研究银纳米团簇对PSA的检测限，对结果进行对比分析。
（2）体内功能分析
①毒性研究：以没有银纳米团簇印迹聚合物处理的前列腺癌LNCaP细胞株作为空白对照组，将不同剂量的银纳米团簇印迹聚合物对LNCaP细胞株进行处理，用CCK-8方法计算细胞存活率，以银纳米团簇印迹聚合物浓度对数值对抑制率作线性回归，SPSS软件分析半数抑制浓度IC50，并确定细胞存活率最高时银纳米团簇印迹聚合物的浓度。
②体内靶向识别研究：经原位注射50 μL 1 ×107 LNCaP细胞在裸鼠的前列腺左右背外侧叶以构建裸鼠原位移植瘤模型。当肿瘤平均大小为200-350 mm3时，尾静脉分别注射生理盐水和细胞存活率最佳对应浓度的银纳米团簇印迹聚合物，利用生物活体光学成像系统示踪1h、3h、6h、12h、24h不同时间段内银纳米团簇印迹聚合物在小鼠体内的分布情况。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤标志物的靶向检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccccccggg cccccttttc ccccactaac taattaaagc tcgccatcaa atagcggtta 60
gacccccttt tccccc 76

Claims (3)

1.一种银纳米团簇印迹聚合物，其特征在于：是在肿瘤标志物智能适配体的胞嘧啶区合成银纳米团簇，然后以银纳米团簇为荧光信号响应基团，通过表面印迹法对肿瘤标志物进行印迹得到具有介孔结构的银纳米团簇印迹聚合物；
所述肿瘤标志物智能适配体包括胞嘧啶区、i-motif区、连接区和适配体区，其序列如SEQ ID NO. 1所示；
所述肿瘤标志物为前列腺癌标志物PSA。
2.权利要求1所述的银纳米团簇印迹聚合物在制备肿瘤标志物靶向识别试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤标志物为前列腺癌标志物PSA。
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