CN112779251B - 一种用于抑制核酸适配体靶向能力的dna链、纳米递药系统及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链、纳米递药系统及制备方法。本发明还提供了所述的可控适配体在精准靶向治疗癌症的纳米递药系统中的应用。实验证明，本发明的抑制链可控制适配体的靶向功能，提高适配体的靶向肿瘤细胞的精准度。并通过制备了基于DNA结构的纳米递药系统，将抗癌药物精准递送到肿瘤细胞，减轻对正常细胞的伤害。

Description

一种用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链、纳米递药系统及 制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，提供了一种用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链、核酸适配体介导的精准靶向肿瘤细胞的纳米递药系统及制备方法。
背景技术
目前癌症常用的治疗方法有手术治疗，放射治疗和药物治疗，其中手术治疗是主要的治疗手段，然而大部分病人被确诊时已进入中晚期，单纯手术治疗作用有限，因此药物治疗在肺癌治疗中占有极其重要的地位。然而目前的研究表明，当前化疗药物的使用并没有使患者的中位生存期有明显的延长，且目前的化疗药物均存在较大的毒副作用，因此，如何减小化疗药物的毒副作用是一个非常重要的问题。
受体介导的主动靶向技术是增加药物靶向性，降低药物毒副作用的主要技术手段。核酸适配体因热稳定性好，易于合成，无免疫原性，易于修饰等优点成为主动靶向分子的研究热点。适配体AS1411是一条拥有规则碱基排列顺序的富含鸟嘧啶(G)寡核苷酸链，能够形成G-四链体结构使其在体内不易被血清酶降解。四链体的稳定构象使AS1411能够以高亲和力和特异性与肿瘤标志物核仁素结合。因此，AS1411在递药系统中被广泛应用，以提高递药系统的靶向能力。但是，大多数肿瘤标志物并不是只在肿瘤细胞上表达，它在正常细胞中也有所表达。因此，尽管给载体修饰了靶向分子，在癌症治疗中，对正常细胞产生的杀伤作用依然值得重视。
由于缺氧环境和呈现酸性的细胞器，肿瘤细胞会产生乳酸使得pH值比正常组织周围低。正常生理pH值在7.4左右，肿瘤组织周围pH值在6.4-7.2之间。I-motif是一条碱基序列规则的富含胞嘧啶(C)的寡核苷酸链，其序列特征为连续的C序列(Cn)和A、T碱基序列(T-loop)交替规则排列。在满足pH范围的条件下，Cn序列中的C的氨基被质子化，两个C之间可形成半质子化碱基对C-H+-C，4段Cn序列之间则可形成C-四链体构型，而且i-motif的pH响应范围可以通过调整Cn序列中C的个数和T-loop中A和T的个数和顺序来改变。
利用i-motif和靶向肿瘤标志物核仁素的适配体AS1411的碱基序列的特殊性，i-motif可以与AS1411结合，抑制AS1411在正常生理环境中的靶向能力，减少药物对正常细胞产生的杀伤。在肿瘤细胞酸性环境下i-motif结构变化，形成C-四链体结构，从而与AS1411解离，使得AS1411恢复靶向核仁素的能力，从而达到精准靶向肿瘤细胞的效果。
发明内容
针对上述背景技术中的问题，本发明的目的之一是提供用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链，旨在提高AS1411靶向肿瘤细胞的精准度，而不会对正常组织或者细胞产生较大的伤害。
用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，满足以下要求：
(1)含i-motif结构；
(2)在pH值6.4-7.0体系范围内，i-motif会形成C-四链体构型；
(3)含有与核酸适配体部分序列互补配对的序列。
i-motif是富含胞嘧啶(C)的寡核苷酸链，其序列特征为连续的C序列(Cn)和A、T碱基序列(T-loop)交替规则排列；
在pH值6.4-7.0体系范围内，i-motif会形成C-四链体构型，而且其pH响应范围可以通过调整Cn序列中C的个数和T-loop中A和T的个数和顺序来改变。
所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，其中i-motif序列为5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCC-3’，见SEQ ID NO.1。
所述的核酸适配体为AS1411，命名链S-A，序列为5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’，见SEQ ID NO.2。
所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链，还包含与核酸适配体AS1411部分序列5’-GGTGGTGGT-3’(见SEQ ID NO.3)互补的序列5’-ACCACCACC-3’(见SEQ ID NO.4)。
所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，碱基序列为5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCCACCACCACC-3’，见SEQ ID NO.5。
所述的DNA链S-I应用时，和含核酸适配体AS1411的DNA结构结合形成载体A-I-Duplex，A-I-Duplex由链S-D-A、S-D、S-I三条链组装而成；序列分别如下：
S-D-A：
5’-CATTGGTACAGAATCGCATGGATGCTGACTGGGGGGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’；见SEQ ID NO.6，
S-D：
5’-AGTCAGCATCCATGCGATTCTGTACCAATG-3’，见SEQ ID NO.7。
S-D-A是在S-A的5端延长了35个碱基而成的。
本发明的目的之二是提供上述的DNA链在制备核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种精准的核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统，包含上述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链和上述的核酸适配体AS1411的DNA结构，以及药物。
所述的核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统中的药物包括：盐酸多柔比星、亚甲基蓝、放线菌素D中的至少一种。药物负载在核酸适配体AS1411的DNA双螺旋中。
本发明的第四个目的是提供所述的精准的核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成A-I-Duplex
在PBS缓冲溶液中依次加入三条链S-I、S-D-A和S-D，混匀后，置于PCR热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下持续5min后，置于冰上快速冷却至0℃，最后于4℃冰箱静置过夜；
(2)负载药物
将药物溶液和A-I-Duplex溶液加于PBS缓冲液，摇匀负载，即得到核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统。
进一步的，所述的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成A-I-Duplex
在0.1M，pH 7.4的PBS缓冲溶液中加入等量相同浓度的三条链S-I、S-D-A和S-D，涡旋30s-1min后，置于PCR热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下持续5min后，置于冰上快速冷却至0℃，最后于4℃冰箱静置过夜；
(2)负载抗癌药物Dox·HCl
将Dox·HCl溶液和A-I-Duplex以1:1-12.5:1(优选12.5:1)的摩尔比加于0.1M，pH7.4的PBS缓冲液，避光条件下，置于摇床上摇晃3h-24h(优选3h)即得到递药系统A-I-Duplex@Dox。
配制盐酸多柔比星溶液(即Dox·HCl)时，具体方法如下：
将固体盐酸多柔比星(Dox·HCl,5.8mg,10mmol)溶解在1mL纯水中，然后稀释100倍制成浓度为100μM的Dox·HCl溶液。
A-I-Duplex@Dox载药体系获得，具体方法如下：
Dox·HCl溶液(100μM)和A-I-Duplex(10μM)以12.5:1的摩尔比加于PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)，避光条件下，置于摇床上摇晃3h即得到递药系统A-I-Duplex@Dox。
本发明中，在载药体系中，Dox·HCl和A-I-Duplex的摩尔比例12.5:1是基于百分之百的载药比，即载药完成后，体系中几乎不存在游离的Dox·HCl和A-I-Duplex。
所述的核酸适配体AS1411，碱基序列为5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。其碱基序列与S-I链配对超过16个碱基的情况下，AS1411的靶向能力会被大大抑制，配对少于16个碱基则会保留靶向能力。在正常生理条件下，S-I与AS1411配对超过16个碱基，AS1411靶向能力被大大抑制；在肿瘤酸性环境中S-I与AS1411配对少于16个碱基，AS1411靶向能力恢复。
有益效果
1.本发明选用抗癌性能良好的盐酸多柔比星，对肿瘤细胞的的杀伤效果明显，且盐酸多柔比星可以直接负载在DNA双螺旋中。
2.本发明设计了专门调控适配体AS1411靶向能力的抑制链，能提高适配体靶向肿瘤细胞的精准度。
3.本发明提供的可控核酸适配体介导的精准靶向肿瘤细胞的纳米递药系统的制备方法简单，能有效提高抗癌药物的靶向性，减少药物对正常细胞的伤害，增加药物在肿瘤部位的富集，进而增强对肿瘤的杀伤力。
附图说明
图1是抑制链与适配体结合产物A-I的聚丙烯酰胺凝胶成像图(a)和圆二色谱图(b)；
图1a中Lane1代表单链S-I，Lane2代表单链S-A，Lane代表双链A-I。
图2是A-I的酸响应和核仁素响应原理示意图。
图3是A-I在酸性环境中的稳定性图。
图4是DNA纳米结构A-I-Duplex的结构示意图(a)和聚丙烯酰胺凝胶成像图(b)；
图4b中Lane1代表单链S-D，Lane 2代表单链S-D-A，Lane3代表S-D-A与S-D的结合形成的双链，Lane4代表A-I-Duplex。
图5是DNA纳米结构A-I-Duplex的载药曲线图和释药曲线图。
图6是A549和L02细胞对A-I-Duplex@Dox的摄取荧光定性对比图。
图7是递药系统A-I-Duplex@Dox对A549和L02细胞的细胞毒性图；
图7中FreeDox即仅添加Dox，且与A-I-Duplex@Dox-pH7.4、A-I-Duplex@Dox-pH6.5中的Dox浓度相同；A-I-Duplex、A-I-Duplex@Dox-pH 7.4、A-I-Duplex@Dox-pH 6.5三者中A-I-Duplex的浓度相同。
图8是递药系统A-I-Duplex@Dox对A549和L02细胞的Calcein-AM/PI双染图；
图8中FreeDox即仅添加Dox，且与A-I-Duplex@A-I-Duplex-pH 7.4、A-I-Duplex@Dox-pH6.5中的Dox浓度相同；A-I-Duplex、A-I-Duplex@A-I-Duplex-pH7.4、A-I-Duplex@Dox-pH6.5三者中A-I-Duplex的浓度相同。
具体实施方式
为了更好地阐述本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1抑制链的筛选
各取10μL浓度均为10μM的抑制链S-I：5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCCACCACCACC-3’和适配体AS1411链S-A(5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’)，分散于100μL PBS缓冲溶液(0.1M，pH 7.4)，涡旋30s-1min，置于PCR热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下保持5min后，置于冰上快速冷却至0℃，最后于4℃冰箱静置过夜得到抑制链和AS1411的结合产物A-I。
A-I的凝胶图和A-I在酸性条件下的稳定性图谱和圆二色谱图如图1所示。用20％聚丙烯酰胺凝胶电泳表征A-I的合成。Lane 3条带明显比两条单链条带Lane 1和2的位置要高(图1a)，这表示A-I的成功合成，条带清晰表示合成率很高。在圆二色谱图中，pH 7.4PBS中A-I在265nm和238nm处分别出现一个正峰和负峰(图1b)。而在pH6.5PBS中，A-I的特征峰发生了偏移，其正峰在280nm,负峰在238nm。特征峰发生偏移表示A-I在pH 6.5的环境中结构发生了变化，说明抑制链中的i-motif在酸性环境中发生了酸响应形成四链体结构导致A-I结构变化。这意味着A-I中的i-motif在肿瘤酸性环境中可以进行酸响应使得AS1411恢复靶向能力。
实施例2A-I在酸性条件下的稳定性测试
为了检测A-I在酸性条件下的稳定性，S-I的3’端和S-A的5’端分别用淬灭基团BHQ2和荧光基团Cy5标记，合成之后在pH 6.5的PBS中放置不同时间。如图2，S-I与S-A结合之后Cy5发生荧光淬灭，在酸性条件下，S-I中的i-motif形成C四链体与S-A部分解离。若在核仁素也同时满足的情况下，S-A会继续与核仁素结合导致S-I与S-A完全解链，BHQ2和Cy5分开，则Cy5荧光恢复。如图3所示，pH 7.4PBS中A-I发生了明显的荧光猝灭现象，这说明S-I和S-A的成功合成。而且从图3可以看出A-I在pH 6.5PBS中的荧光强度没有随着时间的增长发生变化，与pH 7.4PBS中A-I的荧光强度保持一致，说明在只满足酸性条件而无核仁素的条件下，S-I与S-A没有完全解链，即A-I在酸性环境中的稳定性较好。
实施例3A-I-Duplex的合成
各取10μL浓度均为10μM的三条链
S-I(5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCCACCACCACC-3’)、
S-D-A(5’-CATTGGTACAGAATCGCATGGATGCTGACTGGGGGGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’)和
S-D(5’-AGTCAGCATCCATGCGATTCTGTACCAATG-3’)分散于100μL PBS缓冲溶液(0.1M,pH7.4)，涡旋30s-1min，置于PCR热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下保持5 min后，置于冰上快速冷却至0℃，最后于4℃冰箱静置过夜即得A-I-Duplex。
A-I-Duplex的结构示意图如图4a所示。在A-I-Duplex的凝胶电泳图中，Lane1和Lane 2分别表示单链S-D和S-D-A，Lane 3条带表示S-D-A与S-D的结合(图4b)。Lane3条带位置高于Lane1和Lane 2条带，说明S-D-A与S-D结合成功。Lane 4条带的位置比Lane3稍高一点，说明载体A-I-Duplex的成功合成，条带清晰说明合成效率较高。
实施例4负载抗癌药物递药系统A-I-Duplex@Dox的制备
将A-I-Duplex(10μM)与盐酸多柔比星溶液(100μM)以1：12.5的摩尔比混合在PBS缓冲溶液(0.1M，pH 7.4)中，室温避光条件下，置于摇床上3h即得到A-I-Duplex@Dox。
载药曲线图如图5a所示。Dox自带荧光，负载在DNA双螺旋中以后，会发生荧光猝灭。以10 μM Dox的荧光值为参考，载药体系的荧光强度随着A-I-Duplex的浓度的增加而降低。当A-I-Duplex的浓度增加到0.8μM和1.0μM时，载药体系的荧光值基本没有再发生变化，这说明在Dox浓度为10μM的载药体系中，0.8μM的A-I-Duplex已经达到载药饱和点，即百分百载药率时A-I-Duplex和Dox的摩尔比为1:12.5。
实施例5：A-I-Duplex@Dox的累计药物释放量测定
以0.1M pH 5.0、pH 6.0、pH7.4的PBS缓冲溶液作为释放介质，分别将等量的实施例4制备的百分百载药率的A-I-Duplex@Dox分散在相应pH的PBS缓冲液中，在37℃恒温水浴锅中进行药物释放。分别于0、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48 h规定的时间点取样100μL，采用荧光分光光度计法测定样品中多柔比星的荧光值，计算不同时间段内的药物释放量，绘制累计释放量对时间的体外释放曲线。
A-I-Duplex@Dox的释药曲线图如图5b所示，药物释放在24h基本达到平衡。在pH7.4条件(生理环境)下48h,A-I-Duplex释放Dox的量不足10％，pH6.0(肿瘤细胞内部)下释放Dox的量约为20％。在pH为5.0的环境中，接近肿瘤细胞溶酶体的pH值，48h时内药物释放效率达到48％左右，说明随着肿瘤细胞的内化和溶酶体的吞噬，药物释放量逐渐增加。
实施例6A-I-Duplex@Dox的细胞摄取实验
以肺癌细胞A549作为阳性细胞，以人类正常肝细胞L02作为阴性细胞。将A549/L02细胞以8×103个细胞/孔的密度接种到96孔板里，37℃，5％CO2，饱和湿度下，用完全培养基(DMEM+10％FBS+1％双抗)培养细胞24h，随后吸出培养液，加入含实施例4制备的百分百载药率的A-I-Duplex@Dox的PBS(pH 7.4和pH6.5)溶液(A-I-Duplex@Dox的浓度为500nM)，孵育30min后，用37℃的PBS洗涤细胞三遍后，每孔加入100μL PBS缓冲溶液，通过高内涵成像仪进行细胞荧光成像。
如图6所示，在用A-I-Duplex@Dox孵育的实验组，pH 6.5条件下，A549细胞里的Dox的荧光强度明显高于pH 7.4条件下的荧光强度。在不同pH条件下，L02细胞对A-I-Duplex@Dox的摄取量均很弱，而且摄取量并没有随着pH的改变而表现出明显差异。这说明只有在满足pH和核仁素两个条件下，i-motif进行质子响应，与AS1411部分解离使得AS1411恢复靶向能力，A-I-Duplex@Dox通过核仁素介导的内吞作用进入肺癌细胞。这就实现了适配体AS1411的靶向准确度的提升，也使得A-I-Duplex能精准靶向A549肺癌细胞。
实施例7:A-I-Duplex@Dox的抗肿瘤活性实验
(1)细胞毒性实验
实施例4制备的百分百载药率的A-I-Duplex@Dox的抗肿瘤活性实验同样以A549作为阳性细胞，以人类正常肝细胞L02作为阴性细胞。设置4个实验组，A-I-Duplex、FreeDox、A-I-Duplex@Dox-pH7.4、A-I-Duplex@Dox-pH 6.5。以Dox的浓度计算，设置6个浓度梯度，0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM，将A549细胞(或L02细胞)以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板中，加入含有10％FBS的DMEM培养液孵育24小时，随后加入药物，孵育24小时后，将药取出，加入CCK-8溶液继续孵育2小时，CCK-8可对活细胞线粒体里的琥珀酸脱氢酶进行染色。最后将96孔板置于酶标仪中测定450nm处的吸光度值。
如图7所示，载体A-I-Duplex对细胞几乎没有毒性作用，在载体浓度达到8μM时，两种细胞存活率仍在90％以上。另外，从图中可以看出，A-I-Duplex@Dox-pH6.5对A549细胞的杀伤力明显高于A-I-Duplex@Dox-pH7.4，而A-I-Duplex@Dox-pH7.4、A-I-Duplex@Dox-pH6.5两组对L02细胞的的杀伤力没有明显区别，而且也比对A549细胞的杀伤力弱。结果表明，A-I-Duplex@Dox能更加精准靶向肿瘤细胞，增加药物在肿瘤部位的富集，增加药物的杀伤力，减轻对正常细胞的伤害。
(2)Calcein-AM/PI双染实验
将A549和L02细胞接种到96孔板中(1×104个/孔)，在细胞培养箱中培养24h。每孔加入100μL相同浓度的(4μM)的样品(A-I-Duplex，Free Dox，A-I-Duplex@Dox-pH7.4，A-I-Duplex@Dox-pH 6.5)孵育24h，弃去培养液，每孔加入100μL Calcein-AM/PI双染试剂的PBS溶液(2μMCalcein-AM，4μM PI)，在细胞培养箱内孵育15min，用倒置荧光显微镜进行荧光成像，其中Calcein-AM对活细胞进行染色显绿色，PI对死细胞进行染色显红色。
活细胞显示具有不规则轮廓，而死细胞呈现圆形。如图8所示，用A-I-Duplex@Dox-pH6.5处理的A549细胞，其死细胞/活细胞的比例明显要高于用A-I-Duplex@Dox-pH7.4的A549细胞。而A-I-Duplex@Dox-pH 7.4和A-I-Duplex@Dox-pH6.5对L02细胞的杀伤力也没有明显区别，细胞死亡率均很低。Ctrl组表示没有用样品处理的空白细胞组。双染实验结果与细胞毒性实验结果基本保持一致，进一步验证了A-I-Duplex靶向准确度的提高。
以上实施例为本发明的优选实施方式，仅用于说明本发明的技术方案而非限制，应当理解在不脱离本发明原理的范围内还存在多种替换方案，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链、纳米递药系统及制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccccttaccc cttacccctt acccc 25
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
<210> 3
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtggtggt 9
<210> 4
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accaccacc 9
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccccttaccc cttacccctt accccaccac cacc 34
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cattggtaca gaatcgcatg gatgctgact gggggggtgg tggtggttgt ggtggtggtg 60
g 61
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtcagcatc catgcgattc tgtaccaatg 30

Claims (4)

1.一种核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统，其特征在于，
即载体A-I-Duplex以及药物，A-I-Duplex由链S-D-A、S-D、S-I三条链组装而成；序列分别如下：
S-I：5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCCACCACCACC-3’；
S-D-A：
5’-CATTGGTACAGAATCGCATGGATGCTGACTGGGGGGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’；
S-D：
5’-AGTCAGCATCCATGCGATTCTGTACCAATG-3’。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统，其特征在于，药物包括：盐酸多柔比星、亚甲基蓝、放线菌素D中的至少一种。
3.权利要求1中所述的A-I-Duplex在制备核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统中的应用。
4.权利要求1或2所述的核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）合成A-I-Duplex
在PBS缓冲溶液中依次加入三条链S-I、S-D-A和S-D，混匀后，置于PCR 热循环仪中加热至 95℃，在95℃条件下持续5 min后，置于冰上快速冷却至0℃，最后于4℃冰箱静置过夜；
（2）负载药物
将药物溶液和A-I-Duplex加于 PBS缓冲液中，摇匀负载，即得到核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统。
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