CN113750259A - 一种具有靶向激活能力的dna纳米系统及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体公开了一种具有靶向激活能力的DNA纳米系统及其构建方法和应用。包括:由四条DNA单链构成的DNA四面体框架;核酸适体插入分裂的i‑motif序列中,并在两端延伸出与构成DNA四面体框架的其中一条DNA单链P1链互补配对的部分序列;形成的功能核酸链通过与P1链互补配对的部分序列偶联到DNA四面体框架上形成具有靶向激活能力的DNA纳米系统。实验证明,本发明的DNA纳米系统具有肿瘤微环境响应、可控的靶向功能、尺寸可变的空间结构,并能够协助阿霉素进入肿瘤细胞发挥治疗作用,提高抗肿瘤药物的靶向效率和疗效,降低毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,提供了一种具有靶向激活能力的DNA纳米系统及其构建方法和应用。
背景技术
肿瘤靶向治疗往往是通过EPR效应的被动靶向以及能与肿瘤细胞膜蛋白的特异性结合的抗体主动靶向来实现的,但抗体的分子量大、具有潜在的免疫原性、稳定性差且难以修饰等,限制了其应用。核酸适体(apt)是一类具有特异性识别功能的单链DNA或者RNA核酸分子,其作用的本质是核酸分子折叠形成特定三维结构而与生物靶标高亲和力、高特异性结合,因此核酸适体在肿瘤的靶向治疗中具有良好的应用前景,但核酸适体仍存在和正常细胞非特异性结合的能力,且单纯的核酸适体容易被复杂生理环境中的核酶降解,往往需要在转染试剂的帮助下才能通过细胞膜,这限制了核酸适体在递药系统中的应用。DNA四面体是一种通过寡核苷酸链互补配对而搭建起来的刚性纳米结构,是一种安全、生物相容性好、稳定性高的高效生物载体。
肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)是指肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌所形成的促进肿瘤生长和发展的微环境,和正常组织相比,肿瘤组织等病理部位通常表现为血管异常、弱酸性、温度异常、特定酶过表达、缺氧等。如正常组织的pH一般约为7.4,而肿瘤组织的pH范围一般约为6.5-6.8。我们设想利用这些差异可作为调控核酸适体靶向能力的“刺激”因素,诱导核酸适体在肿瘤微环境下形成特定的空间结构,从而高特异性地与肿瘤细胞表面过表达的靶蛋白结合。近年来,研究发现胞嘧啶在偏酸性条件可以发生质子化,基于此设计出pH 响应型DNA纳米结构。其中i-motif是一种在DNA纳米结构中应用广泛的pH敏感响应模块,其原理是质子化的胞嘧啶碱基和未质子化的胞嘧啶碱基通过氢键相互作用形成稳定的平行双螺旋,并彼此交替排列形成四聚体i-motif结构。有研究表明,能够通过i-motif序列的作用调节核酸适体与靶标结合的能力。若以 sgc8为例,将该核酸适体插入i-motif序列中,在血液循环中,i-motif为无规则的链状结构,使得核酸适体不能形成环状结构,于是,阻碍了递药系统和正常细胞膜表面酪氨酸激酶(PTK-7)的结合;而在受到肿瘤偏酸性环境的刺激后,i-motif 自组装成四聚体的结构,促使适体形成环状结构,适体的靶向能力被激活,获得与肿瘤细胞表面过表达的PTK-7特异性结合的靶向能力。随后在四面体框架的作用下,通过小窝蛋白介导的内吞机制帮助递药系统进入肿瘤细胞,协助抗肿瘤药物发挥有效治疗作用;同时肿瘤微环境响应的结构转变能够使DNA纳米系统的尺寸有所减小,有利于递药系统在肿瘤组织部位向更深层组织的渗透,对肿瘤的检测和治疗具有重要意义。
发明内容
根据上述背景技术,本发明的目的之一是提供具有靶向激活能力的DNA纳米系统,能够受肿瘤偏酸性环境的刺激发生结构转变,激活靶向能力,实现对肿瘤部位的成像,以及可控、精准的靶向治疗。
一种具有靶向激活能力的DNA纳米系统,包括:
(1)由四条DNA单链构成的DNA四面体框架;
(2)核酸适体插入分裂的i-motif序列中,并在两端延伸出与构成DNA四面体框架的其中一条DNA单链P1链互补配对的部分序列,构成功能核酸链;
(3)功能核酸链通过步骤(2)所述的互补配对的部分序列偶联到DNA四面体框架上形成具有靶向激活能力的DNA纳米系统。
进一步地,所述的DNA纳米系统,P1链的两端修饰荧光基团。
更进一步地,P1链5’端和3’端分别修饰荧光基团Cy3,Cy5。
进一步地,所述的DNA纳米系统,所述的核酸适体插入分裂的i-motif序列中间,形成的复合序列两端均连接有10-15个碱基与DNA四面体框架中的P1 链两端序列互补配对。
进一步地,所述的DNA纳米系统,所述的DNA四面体框架是由四条DNA 单链两两部分序列互补配对组装得到,四条DNA链序列如下:
P1
5’-Cy3-CAA TTC TCA TAT GAT TCA ACT GCC TGG TGA AGA AAC GAT ATT ACGTGT TAA GTT TAT GAT CGA GTC-Cy5-3’,如SEQ ID NO.1所示;
P2
5’-GAT CGC TAC CTT ATC ACT ATG GCG CCT CTT CTT ACT TCA CCA GGC AGTTGA ATC TGT CAG ACA GTA-3’,如SEQ ID NO.2所示;
P3
5’-GTA ATA TCG TGC AGA AGA GGC GCC ATA GTG ATT CGA TAG AAG TGA TGCTTT CGT ACA ACT TAA CAC-3’,如SEQ ID NO.3所示;
P4
5’-ACG AAA GCA TCA CTT CTA TCT CGG TAG CGA TCT ACT GTC TGA-3’,如SEQID NO.4所示。
本发明制备的DNA四面体不仅限于上述具体的序列,只要满足制备DNA 四面体的序列均可。
进一步地,所述的DNA纳米系统,以sgc8为例,核酸适体链碱基序列为: 5’-TAACTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA-3’,如SEQ ID NO.5所示;
本发明实现目的的技术方案包括但不限于上述核酸适体sgc8,能够用于靶向和/或治疗的核酸适体均可。
进一步地,所述的DNA纳米系统,所述的分裂i-motif序列为:5’-CCC CCT TTT CCCCCA//ACC CCC TTT TCC CCC-3’,如SEQ ID NO.6所示。
本发明实现目的的技术方案包括但不限于上述i-motif序列,能够插入核酸适体,并响应酸性pH环境形成四聚体结构的i-motif序列均可。
进一步地,所述的DNA纳米系统,所述的插入分裂的i-motif序列中的核酸适体sgc8,且两端连接有与P1互补配对序列的功能核酸链命名为P5-1链,碱基序列为:
5’-ATG AGA ATT GCC CCC TTT TCC CCC ATA ACT GCT GCG CCG CCG GGA AAATAC TGT ACG GTT AAC CCC CTT TTC CCC CGA CTC GAT CA-3’如SEQ ID NO.7所示;
P5-1链两端含有与P1链部分序列5’-CAA TTC TCA T-3’(如SEQ ID NO.8 所示)互补配对的序列5’-ATG AGA ATT G-3’(如SEQ ID NO.9所示),以及与 P1链部分序列5’-TGAT CGA GTC-3’(如SEQ ID NO.10所示)互补配对的序列 5’-GA CTC GAT CA-3’(如SEQ IDNO.11所示)。
本发明所述的功能核酸链P5-1,在生理pH环境下,i-motif为无规则的链状, sgc8不能形成环状结构,没有靶向能力。在肿瘤偏酸性环境下的刺激下,i-motif 自组装成四聚体结构,促使sgc8形成发夹结构,激活其靶向能力,进而能够与受体发生特异性结合。
同时,i-motif四聚体结构的形成介导P1链两端荧光基团距离拉近,发生 FRET效应,产生荧光信号,指示肿瘤部位,实现肿瘤微环境响应的靶向成像。
此外,本发明DNA纳米系统具有尺寸可变的特性,在未达到肿瘤部位之前,较大尺寸有利于血液长循环,到达肿瘤部位后,i-motif四聚体结构的形成介导 DNA纳米系统形成相对更紧凑的空间构型,使得尺寸减小,有利于递药系统在肿瘤组织部位向更深层组织的渗透。
本发明第二个目的是提供所述的DNA纳米系统的构建方法,包括以下步骤:
(1)合成DNA四面体框架TDNs
将四条等摩尔量的DNA单链P1、P2、P3及P4混匀后用缓冲液稀释,置于 PCR热循环仪中加热至90-95℃,持续反应5-10min后,置于冰上快速冷却7min;
优选地,所述缓冲液为PBS缓冲液,0.1M,pH 7.4。
优选地,在PCR仪中95℃下加热变性5min。
(2)偶联功能核酸链以形成DNA纳米系统apt/TDNs
向已构建好的TDNs中加入等摩尔量的功能核酸链P5-1,将反应液均匀后置于室温下过夜反应,即形成apt/TDNs。
本发明的第三个目的是提供所述的DNA纳米系统的应用,用于靶向递送药物,或者靶向成像。
具体的,靶向递送药物时,将药物溶液与制备的DNA纳米系统于缓冲液中摇匀,得DNA纳米递药系统。
优选地,所述缓冲液为PBS缓冲液,0.1M,pH 7.4。
所述的药物为阿霉素Dox。
进一步地,将Dox和apt/TDNs以25:1-167:1的摩尔比加于pH 7.4的PBS 缓冲液,避光条件下,置于摇床上摇晃3-6h得到DNA纳米递药系统apt/TDNs@Dox。
优选地,Dox和apt/TDNs的摩尔比例为50:1。
优选地,置于摇床上摇晃3h得到DNA纳米递药系统。
本发明有益效果
1.本发明所构建的DNA纳米系统具有肿瘤微环境响应、可控的靶向功能,并能够协助药物进入肿瘤细胞发挥有效的治疗作用,提高抗肿瘤药物的靶向效率和疗效,降低药物毒副作用;
2.本发明所构建的DNA纳米系统能够响应偏酸性环境发生FRET效应,产生荧光信号,指示肿瘤部位,且产生的荧光指示信号具有良好的pH响应、循环性能,可作为肿瘤微环境指示探针,实现肿瘤微环境响应的靶向成像。
3.本发明所构建的DNA纳米系统具有尺寸可变的特性,在未达到肿瘤部位之前,较大尺寸有利于血液长循环,到达肿瘤部位后i-motif四聚体结构的形成介导DNA纳米系统形成相对更紧凑的空间构型,使得尺寸减小,有利于递药系统在肿瘤组织部位向更深层组织的渗透;
4.本发明所构建的DNA纳米递药系统在减少对正常组织细胞蛋白受体的靶向、降低药物毒副作用、提高稳定性和细胞摄取率等方面具有重要的实际应用前景,目前尚未有相关研究进行报道。
附图说明
图1是本发明中DNA纳米系统apt/TDNs响应酸性环境发生结构变化的工作原理图。
图2是本发明中TDNs的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图(A)及apt/TDNs的表征图(B)。
图2(A)中Lane 1代表TDNs(P1+P2+P3+P4),Lane 2代表P1+P2+P3,Lane 3代表P1+P2,Lane 4代表单链P1。
图2(B)中Lane 1代表TDNs(P1+P2+P3+P4),Lane 2代表apt/TDNs (P1+P2+P3+P4+P5-1),Lane 3代表单链P5-1。
图3是本发明中TDNs,apt/TDNs及对照组c-apt/TDNs的粒径表征图。
图4是本发明中apt/TDNs的原子力显微镜图像。
图5是本发明中apt/TDNs的pH响应荧光性能图(A)及对照组c-apt/TDNs 的pH响应荧光性能图(B)。
图6是本发明中apt/TDNs响应酸、碱环境的荧光信号图。
图7是本发明中apt/TDNs及对照组c-apt/TDNs在不同pH条件下的细胞摄取图。
图8是本发明中apt/TDNs在不同pH环境中的稳定性图。
图9是本发明中apt/TDNs的载药曲线图。
图10是体外抗肿瘤活性CCK-8实验图。
图10(A)为DNA纳米系统apt/TDNs,c-apt/TDNs及DNA纳米递药系统 apt/TDNs@Dox,c-apt/TDNs@Dox在不同pH(6.5和7.4)下对阳性细胞Hela 细胞的毒性。
图10(B)为DNA纳米系统apt/TDNs,c-apt/TDNs及DNA纳米递药系统 apt/TDNs@Dox,c-apt/TDNs@Dox在不同pH(6.5和7.4)下对阴性细胞L02细胞的毒性。
图11是本发明中apt/TDNs@Dox,c-apt/TDNs@Dox在不同pH(6.5和7.4) 下对阳性Hela细胞及阴性L02细胞的体外抗肿瘤活性Calcein-AM/PI双染实验图。
文中简写:
(a)TDNs,代表P1,P2,P3及P4四条DNA单链两两部分序列互补配对组装形成的DNA四面体框架;
(b)apt/TDNs,代表功能核酸链P5-1偶联TDNs组装形成的DNA纳米系统;
(c)apt/TDNs@Dox,代表负载抗肿瘤药物阿霉素Dox后的DNA纳米递药系统;
(d)c-apt/TDNs,代表对照核酸链P5-2偶联TDNs组装形成的对照组DNA 纳米系统;
(e)c-apt/TDNs@Dox,代表负载抗肿瘤药物阿霉素Dox后的对照组DNA 纳米递药系统。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本说明做进一步的详细说明。
本发明所用的核苷酸链如下:
本发明的核苷酸链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供。
实施例1:
一种具有靶向激活能力的DNA纳米系统的构建方法:
(1)DNA四面体框架TDNs的合成
将4条DNA单链P1,P2,P3及P4按等摩尔比例混合,并加入1×PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至需要的浓度,涡旋混匀后在PCR仪中95℃下变性反应5min, 程序降温至室温后置于冰上,放置7min。从冰上取出试管,将DNA混合液置于室温放置10min,即形成DNA四面体TDNs。合成的TDNs置于4℃下保存备用。
(2)功能核酸链偶联DNA四面体框架以形成DNA纳米系统apt/TDNs
向已构建好的TDNs溶液中加入等摩尔量的P5-1链,将反应液涡旋均匀后置于室温下过夜反应,即形成apt/TDNs。合成的apt/TDNs置于4℃下保存备用。
对照组c-apt/TDNs以相同的方式制备,将P5-1链替换成P5-2链。
P5-2链为不含i-motif序列,即不具有pH响应的对照链,其序列为:5’-ATG AGAATT GTT TTT TTTTTTTTT TTA ACT GCT GCG CCG CCG GGA AAA TAC TGT ACG GTT ATT TTTTTTTTTTTT TGA CTC GAT CA-3’(如SEQ ID NO.12 所示)。以此P5-2链偶联DNA四面体框架TDNs形成的DNA纳米结构称作对照组c-apt/TDNs。
效果实施例1:实施例1的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征
采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%N-PAGE)来表征TDNs及apt/TDNs的合成。首先配置8%的聚丙烯酰胺凝胶,依次加入30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 (19:1)1.6mL,纯水3.2mL,5×TBE缓冲溶液1.2mL,TEMED 7μL,10%过硫酸铵35μL。涡旋使溶液充分混匀,将上述混合液注入玻璃板中并插入梳子,室温下放置30min使胶充分凝固。将制得的凝胶转移至电泳槽中,加入新鲜配置的1×TBE电泳液,使加样孔完全浸入电泳液中。在待上样品中加入loading buffer (稀释为1×),混合均匀后,取12μL上样。取3μL DNA分子量标准Marker上样。在100V的条件下进行约60min,至溴酚蓝距离凝胶边缘约1cm时停止电泳。电泳结束后将凝胶从玻璃板中完整取出并置于Gel Red中染色40min,再放入1×TBE溶液中漂洗10min,于凝胶成像系统中成像。
结果如图2中显示:
图2(A)中Lane 1代表TDNs(P1+P2+P3+P4),Lane 2代表P1+P2+P3, Lane 3代表P1+P2,Lane 4代表单链P1。
图2(B)中Lane 1代表TDNs(P1+P2+P3+P4),Lane 2代表apt/TDNs (P1+P2+P3+P4+P5-1),Lane 3代表单链P5-1。
结果图2(A)显示随着单链的不断增加,凝胶条带的位置不断上移,TDNs 的凝胶条带最靠近加样孔,条带位置与理论分子量基本一致,验证了TDNs的成功合成。图2(B)表明,apt/TDNs的DNA条带与TDNs相比稍有上移,且apt-TDNs 孔中没有出现原料P5-1的条带,证明了功能核酸链P5-1与TDNs的成功偶联形成apt/TDNs。
效果实施例2:实施例1的粒径表征
用PBS缓冲液将待测样品稀释至终浓度为100nM,置于测量粒径的石英皿中,在动态光散射仪下测量粒径。
实验结果如图3所示,TDNs的平均粒径大小为15.77nm,apt/TDNs的为 14.38nm,c-apt/TDNs的为14.08nm。偶联P5-1或P5-2链后的DNA纳米结构比四面体框架TDNs的平均粒径小,分析为偶联P5-1或P5-2链后使纳米结构的空间位置受到压缩,粒径有所减小。粒径测得结果和四面体的理论粒径接近,证明了TDNs,apt/TDNs,c-apt/TDNs的成功合成。
效果实施例3:实施例1的原子力显微镜表征
用移液枪取10μLapt/TDNs样品溶液滴于新鲜制备的云母片上,反应5min 后置于原子力显微镜中检测,使用接触扫描模式成像。结果如图4所示,纳米结构的高度在1.5nm左右,粒径大小约为15nm。
效果实施例4:实施例1的体外pH响应荧光性能考察
为了探索apt/TDNs的体外pH响应性能,在P1链5'和3'端分别设计标记荧光基团Cy3和Cy5。实验设置不具有pH响应i-motif结构的P5-2链作为对照链, P5-2偶联TDNs形成的DNA纳米系统称作c-apt/TDNs,作为本发明不具备pH 响应的对照组纳米系统。将apt/TDNs分散于pH 6.5和7.4的PBS缓冲液中。以 532nm波段激发,用荧光分光光度计在不同pH下对apt/TDNs的荧光值进行检测,通过检测570nm处的荧光度值指示Cy3的荧光信号变化,通过检测670nm 处的荧光度值指示Cy5的荧光信号变化。
结果如图5所示,apt/TDNs在酸性条件pH 6.5下Cy3的吸收峰值降低,Cy5 的吸收峰值升高,证明偏酸性环境能诱导i-motif形成四聚体结构,从而拉近P1 链两端两荧光团的距离,发生FRET效应,也即apt/TDNs能够成功响应酸性pH 环境发生结构转变。而对照组c-apt/TDNs由于不具备i-motif结构,无法形成四聚体,没有发生FRET效应。
进一步地,为了更好地表征apt/TDNs响应酸、碱环境的能力,通过加入酸、碱溶液调整apt/TDNs水分散液的pH值,混合均匀后用荧光分光光度计检测 670nm处Cy5荧光信号的荧光度值变化。
结果如图6所示,当apt/TDNs的水分散液为酸性时,Cy5荧光信号被激发,荧光强度增强;当apt/TDNs的水分散液为碱性时,Cy5荧光信号减弱;当溶液 pH重新调整为酸性时,Cy5荧光信号能够再次被激发,结果表明apt/TDNs的pH 响应性能为可逆的,且至少能够重复5个循环。
效果实施例5:实施例1的pH依赖的靶向摄取差异
选用PTK-7高表达的Hela细胞作为本发明中DNA纳米系统的阳性细胞。将对数生长期的Hela细胞以1×105cells/well的密度接种到24孔细胞培养板内,在培养箱中放置24h。将apt/TDNs稀释于不含血清的DMEM培养基中,使终浓度为100nM,避光孵育25min后吸出,用PBS缓冲液冲洗3次,加入 200μL胰酶消化3min,加300μL含10%FBS的DMEM培养基终止消化,收集细胞悬液,于1500rpm、4℃条件下离心,弃上清,再向其中加200-400μLPBS 缓冲液重新分散,于流式细胞仪中测定Cy5的荧光信号强度。
结果如图7所示,经apt/TDNs处理的Hela细胞,在pH 6.5条件下的摄取显著强于pH7.4条件下的摄取,二者荧光强度呈现明显的pH差异,证明apt/TDNs 能够响应pH酸性环境发生结构改变,发生FRET效应,同时激活其靶向功能,进而被靶癌细胞高特异性摄取。而经c-apt/TDNs处理的Hela细胞在pH 6.5 和7.4下的荧光强度都较弱,且二者的荧光强度几乎没有差异,表明c-apt/TDNs 无法实现构型转变,与癌细胞结合能力受到抑制,也无法有效区分两种pH环境。而基于以上分析可知,apt/TDNs能够响应偏酸性环境发生构型转变,获得靶向能力进而结合肿瘤细胞,实现pH依赖的差异性摄取。
效果实施例6:实施例1的血清稳定性
用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征apt/TDNs在不同pH(6.5和7.4)含10%FBS 的DMEM培养基中的血清稳定性。即将apt/TDNs与含10%FBS的DMEM培养基(pH 6.5和7.4)中混合均匀,温度设置为37℃的培养箱中分别孵育0h, 6h,12h,24h,36h,48h。样品从培养箱中取出后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳表征apt/TDNs的结构的完整性。
如图8所示,apt/TDN在pH 6.5和pH 7.4下经过48h孵育后条带仍然很明显,无明显降解,证明DNA四面体框架具有良好的抗核酸酶降解能力,能显著提高核酸适体的稳定性。
实施例2:负载化疗药物Dox以合成DNA纳米递药系统apt/TDNs@Dox
将阿霉素Dox溶解在去离子水中混匀制成100μM的药物储备液。将Dox溶液和apt/TDNs或c-apt/TDNs以不同摩尔比混匀,避光条件下,置于摇床上摇晃得到DNA纳米递药系统apt/TDNs@Dox及对照组c-apt/TDNs@Dox。
效果实施例1:实施例2的Dox装载量的确定
当Dox成功载入DNA双链后,会发生荧光猝灭,因此用荧光分光光度计测量Dox的荧光强度来确定apt/TDNs的最优载药摩尔比。(Dox:λex=495nm和λem=560nm)。将不同浓度(30至200nM)的apt/TDNs与Dox(5μM)在避光条件下于室温(24-26℃)中置于摇床上摇晃3h。结果如图9所示,当Dox 与apt/TDNs的摩尔量比例为50:1时,Dox所产生的红色荧光因为Dox嵌入到DNA结构中而淬灭。也即每一分子的apt/TDNs可以负载的50个Dox分子。效果实施例2:实施例2的体外抗肿瘤活性CCK-8实验
Enhanced Cell Counting Kit-8是一种基于WST-8而广泛应用于细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。在电子耦合试剂存在的情况下,WST-8可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan,细胞毒性越大,则颜色越浅。基于此原理来考察本发明中DNA纳米递药系统的细胞毒性,评估其体外抗肿瘤效果。将Hela及L02细胞以1×104cells/well的密度按照每孔100微升培养液接种到96孔板中,在培养箱中孵育24h后,分别与apt/TDNs@Dox(pH 6.5和 pH7.4)及c-apt/TDNs@Dox(pH 6.5和pH7.4)继续孵育24h,其中,Dox浓度设置为0.00μM,0.31μM,0.63μM,1.25μM,2.50μM,5.00μM。孵育结束后,每孔中加100μL CCK-8试剂,加入时确保每个孔内没有气泡,在细胞培养箱内继续孵育2h,最后用酶标仪检测在450nm处的OD值。设置加了相应量细胞培养液和增强型CCK-8溶液而没有加药的细胞孔作为对照组,设置加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。存活率计算公式为:存活率=(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。
如图10所示,本发明首先考察了两种没有装载药物的DNA纳米系统 apt/TDNs及c-apt/TDNs对Hela和L02细胞的毒性,结果显示,当空白载体浓度达200nM时,Hela和L02细胞的存活率仍高于80%,表明未载药的DNA纳米系统的毒性较小。经apt/TDNs@Dox孵育24h的Hela细胞,apt/TDNs@Dox 在Dox浓度达5μM时,Hela细胞在pH 6.5条件下的活性明显下降,其产生的细胞毒性可与同浓度游离Dox的毒性相当;而pH 7.4条件下仍保持较高活性,两pH条件下的细胞活性存在显著差异;而c-apt/TDNs@Dox在两种pH环境下对Hela细胞的毒性均不明显。对于阴性细胞L02细胞组,apt/TDNs@Dox及 c-apt/TDNs@Dox在两个pH环境下对L02细胞的毒性均较弱(图10B)。以上结果表明,apt/TDNs@Dox能够实现肿瘤微环境响应的药物递送,选择性地被pH 6.5条件下的靶癌细胞摄取,并发挥有效的抗肿瘤作用。
效果实施例3:实施例2的体外抗肿瘤活性Calcein-AM/PI双染实验
Calcein AM本身并没有荧光,进入细胞后被活细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素(Calcein),发出强绿色荧光,仅活细胞会被染色,死细胞不能被染色或者染色非常弱。核酸红色荧光染料碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)由于不能穿透活细胞的细胞膜,而只能染色细胞膜完整性被破坏的死细胞。将对数生长期的Hela和L02细胞以1×104cells/well 的密度接种于96孔板中,在培养箱内孵育,24h后每孔加入不同pH的 apt/TDNs@Dox及c-apt/TDNs@Dox(Dox浓度5μM)继续在37℃下孵育24h。孵育结束后将药物吸出并用PBS缓冲液冲洗1次,每孔中加100
μLCalcein-AM/PI染色工作液(稀释至1×),37℃下避光孵育30min,之后采用高内涵成像仪检测荧光信号。Calcein AM为绿色荧光,Ex/Em=494/517nm;PI 为红色荧光,Ex/Em=535/617nm)。
如图11所示,经apt/TDNs@Dox孵育的Hela细胞在pH 6.5的条件下,显示大比例的红色荧光,细胞形态由贴壁紧密的梭形变成半贴壁、离散的圆形,表明大部分Hela细胞已死亡;在pH 7.4的条件下,大部分Hela细胞呈现绿色荧光,也即经apt/TDNs@Dox处理后的Hela细胞在两种pH环境中的存活率存呈在明显差异;而经c-apt/TDNs@Dox处理的Hela细胞在两种pH环境中均呈现大比例的绿色荧光,表明细胞存活率较高,无明显pH毒性差异。此外,经apt/TDNs@Dox及c-apt/TDNs@Dox孵育后的阴性L02细胞在两种pH条件下均呈现大比例的绿色荧光,表明本发明的DNA纳米递药系统对L02细胞仅存在微弱的毒性。上述结果与CCK-8毒性实验结果一致,Calcein-AM/PI双染实验进一步证明了apt/TDNs@Dox具有优良的肿瘤微环境响应的靶向性能,能够协助阿霉素高特异性地进入肿瘤细胞发挥有效的治疗作用。
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种具有靶向激活能力的DNA纳米系统及其构建方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caattctcat atgattcaac tgcctggtga agaaacgata ttacgtgtta agtttatgat 60
cgagtc 66
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcgctacc ttatcactat ggcgcctctt cttacttcac caggcagttg aatctgtcag 60
acagta 66
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaatatcgt gcagaagagg cgccatagtg attcgataga agtgatgctt tcgtacaact 60
taacac 66
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgaaagcat cacttctatc tcggtagcga tctactgtct ga 42
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
taactgctgc gccgccggga aaatactgta cggtta 36
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccccttttc ccccaacccc cttttccccc 30
<210> 7
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgagaattg cccccttttc ccccataact gctgcgccgc cgggaaaata ctgtacggtt 60
aacccccttt tcccccgact cgatca 86
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caattctcat 10
<210> 9
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgagaattg 10
<210> 10
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgatcgagtc 10
<210> 11
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gactcgatca 10
<210> 12
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgagaattg tttttttttt ttttttaact gctgcgccgc cgggaaaata ctgtacggtt 60
attttttttt ttttttgact cgatca 86
Claims (10)
1.一种具有靶向激活能力的DNA纳米系统,其特征在于,包括:
(1)由四条DNA单链构成的DNA四面体框架;
(2)核酸适体插入分裂的i-motif序列中,并在两端延伸出与构成DNA四面体框架的其中一条DNA单链P1链互补配对的部分序列,构成功能核酸链;
(3)功能核酸链通过步骤(2)所述的互补配对的部分序列偶联到DNA四面体框架上形成具有靶向激活能力的DNA纳米系统。
2.根据权利要求1所述的DNA纳米系统,其特征在于,P1链的两端修饰荧光基团;进一步地,P1链5’端和3’端分别修饰荧光基团Cy3,Cy5。
3.根据权利要求1所述的DNA纳米系统,其特征在于,所述的核酸适体插入分裂的i-motif序列中间,且两端均连接有10-15个碱基与DNA四面体框架中的其中一条DNA单链P1链两端序列互补配对。
4.根据权利要求1所述的DNA纳米系统,其特征在于,所述的DNA四面体框架是由四条DNA单链两两部分序列互补配对组装得到,四条DNA链序列如下:
P1
5’-Cy3-CAA TTC TCA TAT GAT TCA ACT GCC TGG TGA AGA AAC GAT ATT ACG TGTTAA GTT TAT GAT CGA GTC-Cy5-3’
P2
5’-GAT CGC TAC CTT ATC ACT ATG GCG CCT CTT CTT ACT TCA CCA GGC AGT TGAATC TGT CAG ACA GTA-3’
P3
5’-GTA ATA TCG TGC AGA AGA GGC GCC ATA GTG ATT CGA TAG AAG TGATGC TTT CGTACA ACT TAACAC-3’
P4
5’-ACG AAA GCA TCA CTT CTA TCT CGG TAG CGA TCT ACT GTC TGA-3’。
5.根据权利要求1所述的DNA纳米系统,其特征在于,所述的核酸适体为sgc8,碱基序列为:5’-TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA-3’。
6.根据权利要求1所述的DNA纳米系统,其特征在于,所述的分裂i-motif序列为:5’-CCC CCT TTT CCC CCA //ACC CCC TTT TCC CCC-3’。
7.根据权利要求3所述的DNA纳米系统,其特征在于,所述的核酸适体插入分裂的i-motif序列中,并在两端连接有与P1互补配对序列的功能核酸链命名为P5-1链,碱基序列为:
5’-ATG AGA ATT GCC CCC TTT TCC CCC ATA ACT GCT GCG CCG CCG GGA AAATAC TGTACG GTT AAC CCC CTT TTC CCC CGA CTC GAT CA-3’;
P5-1链两端含有与P1链部分序列5’-CAA TTC TCA T-3’互补配对的序列5’-ATG AGAATT G-3’,以及与P1链部分序列5’-TGAT CGA GTC-3’互补配对的序列5’-GA CTC GAT CA-3’。
8.权利要求1-7中任一项所述的DNA纳米系统的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)合成DNA四面体框架TDNs
将四条等摩尔量的DNA单链P1、P2、P3及P4混匀后用缓冲液稀释,置于PCR热循环仪中加热至90-95℃,持续反应5-10min后,置于冰上快速冷却7min;
(2)偶联功能核酸链以形成DNA纳米系统apt/TDNs
向已构建好的TDNs中加入等摩尔量的功能核酸链P5-1链,将反应液混合均匀后置于室温下过夜反应,即形成apt/TDNs。
9.权利要求1-7任一项所述的DNA纳米系统,或者权利要求8所述的方法构建的DNA纳米系统的应用,其特征在于,用于靶向递送药物,或者靶向成像。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,靶向递送药物时,将药物溶液与制备的DNA纳米系统于缓冲液中摇匀,得DNA纳米递药系统。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114181935A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-15 | 中国药科大学 | 自组装dna四面体及肽疫苗递送系统 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106540268A (zh) * | 2016-11-02 | 2017-03-29 | 四川大学 | 一种TDNs‑AS1411‑核酸药物复合纳米材料载药系统及其制备方法 |
CN107050464A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-08-18 | 中国药科大学 | 一种载有阿霉素的适配体修饰dna纳米笼及其制备方法 |
CN109295205A (zh) * | 2018-10-17 | 2019-02-01 | 南京宁贝欣医疗科技有限公司 | 一种可以快速同时检测多种miR的方法 |
US20190101543A1 (en) * | 2017-08-09 | 2019-04-04 | Boise State University | Dna ink - near-field absorption coupling for colorimetric detection, dna ink, chromic photoswitches, and chromic molecular ruler |
CN109897887A (zh) * | 2019-01-04 | 2019-06-18 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 基于fret的端粒酶活性检测方法 |
CN110702911A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-01-17 | 南通大学 | 一种银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤标志物的靶向检测方法 |
CN112190716A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-01-08 | 四川大学 | 一种基于dna四面体的动态载药复合物 |
CN112345507A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-02-09 | 济南大学 | 一种基于dna三棱柱结构构象变化靶向癌细胞的生物传感器 |
CN112779251A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-05-11 | 中南大学 | 一种用于抑制核酸适配体靶向能力的dna链、纳米递药系统及制备方法 |
-
2021
- 2021-08-05 CN CN202110895756.7A patent/CN113750259A/zh active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106540268A (zh) * | 2016-11-02 | 2017-03-29 | 四川大学 | 一种TDNs‑AS1411‑核酸药物复合纳米材料载药系统及其制备方法 |
CN107050464A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-08-18 | 中国药科大学 | 一种载有阿霉素的适配体修饰dna纳米笼及其制备方法 |
US20190101543A1 (en) * | 2017-08-09 | 2019-04-04 | Boise State University | Dna ink - near-field absorption coupling for colorimetric detection, dna ink, chromic photoswitches, and chromic molecular ruler |
CN109295205A (zh) * | 2018-10-17 | 2019-02-01 | 南京宁贝欣医疗科技有限公司 | 一种可以快速同时检测多种miR的方法 |
CN109897887A (zh) * | 2019-01-04 | 2019-06-18 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 基于fret的端粒酶活性检测方法 |
CN110702911A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-01-17 | 南通大学 | 一种银纳米团簇印迹聚合物对肿瘤标志物的靶向检测方法 |
CN112190716A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-01-08 | 四川大学 | 一种基于dna四面体的动态载药复合物 |
CN112345507A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-02-09 | 济南大学 | 一种基于dna三棱柱结构构象变化靶向癌细胞的生物传感器 |
CN112779251A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-05-11 | 中南大学 | 一种用于抑制核酸适配体靶向能力的dna链、纳米递药系统及制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HAO PEI ET AL: "Reconfigurable Three-Dimensional DNA Nanostructures for the Construction of Intracellular Logic Sensors", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 * |
LONG LI ET AL: "Modulating aptamer specificity with pH-responsive DNA bonds", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114181935A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-15 | 中国药科大学 | 自组装dna四面体及肽疫苗递送系统 |
CN114181935B (zh) * | 2021-12-15 | 2023-12-22 | 中国药科大学 | 自组装dna四面体及肽疫苗递送系统 |
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