CN114181935A - 自组装dna四面体及肽疫苗递送系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自组装DNA四面体及肽疫苗递送系统。自组装DNA四面体由四条单链DNA组成。重组自组装DNA四面体由自组装DNA四面体经重组获得。肽疫苗递送系统以重组自组装DNA四面体为主体，该主体各条单链DNA的5’端或3’端分别偶联有辅助性表位肽或肽疫苗。本发明的递送系统能够将疫苗高效驻留到淋巴结，并被DC细胞摄取并递呈，从而有效激活抗原特异性T细胞，抑制肿瘤的生长。
Description
技术领域
本发明涉及一种自组装DNA四面体及肽疫苗递送系统，属于生物医药技术领域。
背景技术
随着肿瘤免疫学、生物信息学以及高通量测序技术的发展，对肿瘤体细胞突变及移码突变进行鉴定，发现了一类在健康细胞中不发生，仅存在于肿瘤中的新抗原，即肿瘤新生抗原。因此，肿瘤新生抗原不受中枢免疫耐受，靶向性良好。这些独特的特性使新抗原成为治疗癌症疫苗的极佳候选药物。但是研究发现绝大多数新生抗原免疫原性较低，对T细胞的激活能力有限。因此，非常需要开发一种能够增强新生抗原产生有效和持久的肿瘤免疫反应的方法。
提高新生抗原肽的免疫反应，首先需要将新生抗原肽有效的递送到淋巴结及抗原递呈细胞中；其次需要借助佐剂产生广泛的免疫反应，刺激多种免疫信号通路的协同调节；而且，新生抗原诱导产生持续、高效的特异性CD8+T细胞，需要CD4+T细胞激活后的有效辅助；此外，多新生抗原表位共同使用以增加疫苗的免疫刺激性，将有利于肿瘤的杀伤。
经检索发现，申请号CN201580020354.5、申请公布号CN106459132A的发明专利申请公开了由自组装的含顶点的固定角度核酸结构形成的核酸多面体，包含含有以固定的角度彼此排列的三个或更多个臂的核酸结构的组合物，其复合材料，例如DNA笼，以及其合成和使用的方法。其技术方案中的复合核酸结构可用于全身递送药剂或递送至局部区域，例如组织或细胞。
本发明的发明人曾于2018年5月2日申请发明专利，专利号CN201810408586.3、授权公告号CN109748952B，公开了辅助性表位肽及其应用，该辅助性表位肽能通用性地增强现有抗原或抗原表位的免疫原性，提高特异性抗体的滴度，具有潜在的辅助激活CTL效应的能力。
基于以上各方面信息，本发明的发明人认为，若能找到适用于偶联上述辅助性表位肽和/或各种抗原、抗原表位的自组装DNA多面体，则意味着能够通过纳米疫苗的形式来增强新抗原对肿瘤免疫治疗的免疫原性，从而提高对肿瘤的杀伤作用。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提出一种自组装DNA四面体，适用于偶联上述辅助性表位肽和/或各种抗原、抗原表位；同时还提供相应的肽疫苗递送系统，能够将疫苗高效驻留到淋巴结，被DC细胞摄取并递呈，从而有效激活抗原特异性T细胞，抑制肿瘤的生长。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种自组装DNA四面体，由四条单链DNA组成，其特征是，第一条单链DNA的序列如SEQ ID NO:10所示，第二条单链DNA的序列如SEQ ID NO:11所示，第三条单链DNA的序列如SEQ ID NO:12所示，第四条单链DNA的序列如SEQ ID NO:13所示。
该自组装DNA四面体是本发明肽疫苗递送系统的骨架，后续内置基序佐剂、偶联辅助性表位肽、偶联肽疫苗均在此骨架上进行拓展。
本发明还提出：
一种重组自组装DNA四面体，其特征是，由前文所述的自组装DNA四面体经重组获得，所述第一条、第二条、第三条、第四条单链DNA中至少有两条单链DNA经预设规则重组成为重组单链DNA；其中，一条重组单链DNA中内置基序佐剂，且其余重组单链DNA中分别内置基序佐剂的互补序列或互补序列的一部分。
该重组自组装DNA四面体内置基序佐剂作为共递送佐剂。
优选地，所述基序佐剂为TLR-9激动剂基序佐剂CpG系列，且基序佐剂的序列如SEQID NO:1-9之一所示。
优选地，所述预设规则包括：
在重组之前，所述第一条、第二条、第三条、第四条单链DNA的序列中，自5’端起第18位和第19位碱基、第37位和第38位碱基分别为折弯处碱基，这些折弯处碱基将各条单链DNA分别划分为3段子序列，每一段子序列分别与其余某条单链DNA中的某一段子序列彼此对应且碱基互补配对；
重组时，先选择一条单链DNA的序列以内置基序佐剂，在该单链DNA的序列中任意选定碱基位置作为起始位置(例如5’端的第1个碱基)，从该起始位置起将该单链DNA的序列替换为预先选定的一条基序佐剂的序列，且当该基序佐剂的序列覆盖折弯处碱基时保持折弯处碱基不变，从而获得内置基序佐剂的重组单链DNA；
根据该内置基序佐剂的重组单链DNA中各段子序列，将其余各条单链DNA中对应的子序列进行碱基调整使之保持碱基互补配对。
优选地，在重组之前以及重组之后，
所述第一条单链DNA的序列结构为：5’-1号子序列-折弯处碱基-2号子序列-折弯处碱基-3号子序列-3’；
所述第二条单链DNA的序列结构为：5’-4号子序列-折弯处碱基-2号子序列的互补序列-折弯处碱基-5号子序列-3’；
所述第三条单链DNA的序列结构为：5’-4号子序列的互补序列-折弯处碱基-6号子序列-折弯处碱基-3号子序列的互补序列-3’；
所述第四条单链DNA的序列结构为：5’-1号子序列的互补序列-折弯处碱基-6号子序列的互补序列-折弯处碱基-5号子序列的互补序列-3’。
本发明还提出：
一种肽疫苗递送系统，其特征是，以前文所述的重组自组装DNA四面体为主体，该主体各条单链DNA的5’端或3’端分别偶联有辅助性表位肽或肽疫苗；所述辅助性表位肽的序列为SEQ ID NO:18-36之一；所述肽疫苗包括抗原或抗原表位。
优选地，该主体中至少一条单链DNA的5’端或3’端偶联有辅助性表位肽，且该主体中至少一条单链DNA的5’端或3’端偶联有肽疫苗；或者，所述抗原为SIINFEKL、HER2、PD-L1、CD47、CD39、CD73、CD24、KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、CTLA-4、NY-ESO-1、P53之一；或者，所述抗原为肿瘤新生抗原；或者，所述抗原表位为TSA、TAA之一。
更优选地，所述肿瘤新生抗原包括Adpgk。
本发明还提出：
含有前文所述肽疫苗递送系统的组合物。
前文所述肽疫苗递送系统或前文所述组合物用于制备预防或治疗肿瘤的药物的用途。
本发明的发明人已经多次实验证实，利用上述递送系统可以高效促进抗原在淋巴结中的募集，对于抗原的选择没有特异性，且能够被DC细胞摄取并激活抗原特异性。值得注意的是，相较于单纯的新生抗原肽免疫，利用该递送系统后可持续高滴度地激活T淋巴细胞。
与现有技术相比，(1)本发明所使用的核酸自组装形成的DNA四面体骨架具有序列特异性、优良的生物相容性、对细胞固有的无毒性、高度的生物稳定性以及精确控制其大小和结构的特性；(2)本发明利用CPG系列基序佐剂也为核酸的这一特性，内置到上述骨架中,可高效激活DC细胞；(3)本发明可以在同一DNA四面体上负载多个不同肽，做到多表位肽共递送；(4)本发明仅需要合成单表位肽即可，不需要合成融合长肽，大大缩短了抗原肽疫苗制备的时间和难度；(5)结合利用本发明的发明人已获专利权的辅助性表位肽，可以有效激活CD4+T细胞，促进Th1极化，进而有效辅助激活CD8+T细胞。
附图说明
图1为本发明实施例2的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明实施例2的原子力显微镜成像图。
图3为本发明实施例2的动态光散射测定结果图。其中，(1)图为测定DCP粒径，(2)图为测定DCNP粒径。
图4为本发明实施例3的结果图。
图5为本发明实施例4的结果图。
图6为本发明实施例5的结果图。
图7为本发明实施例6的结果图。其中，(1)图为测定IL-6，(2)图为测定TNF-α。
图8为本发明实施例7的结果图。
图9、图10为本发明实施例8的结果图。
图11、图12为本发明实施例9的结果图。
图13为本发明实施例10的结果图。
具体实施方式
本发明的具体技术方案如前文所述，其中，自组装DNA四面体的四条单链DNA序列SEQ ID NO:10至13如下表所示：
上表各序列中，方框处的碱基即为折弯处碱基。
TLR-9激动剂基序佐剂CpG系列的序列SEQ ID NO:1至9如下表所示：
| 序列 | 备注 |
| 5’-TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT-3’ | SEQ ID NO:1 |
| 5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’ | SEQ ID NO:2 |
| 5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’ | SEQ ID NO:3 |
| 5’-GGGGACGACGTCGTGGGGGGG-3’ | SEQ ID NO:4 |
| 5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’ | SEQ ID NO:5 |
| 5’-TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC-3’ | SEQ ID NO:6 |
| 5’-TCGCGACGTTCGCCCGACGTTCGGTA-3’ | SEQ ID NO:7 |
| 5’-TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3’ | SEQ ID NO:8 |
| 5’-TCGCGAACGTTCGCCGCGTTCGAACGCGG-3’ | SEQ ID NO:9 |
辅助性表位肽如专利号CN 201810408586.3、授权公告号CN109748952B的发明专利所记载，其序列SEQ ID NO:18至36如下表所示：
注：各序列中的X为4-硝基苯丙氨酸。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
采用的自组装DNA四面体由四条单链DNA组成，第一条单链DNA的序列如SEQ IDNO:10所示，第二条单链DNA的序列如SEQ ID NO:11所示，第三条单链DNA的序列如SEQ IDNO:12所示，第四条单链DNA的序列如SEQ ID NO:13所示。
在该自组装DNA四面体基础上构建重组自组装DNA四面体，具体如下：
一方面，选择SEQ ID NO:1所示的CpG ODN基序作为内置基序佐剂。
另一方面，先选择第一条单链DNA的序列SEQ ID NO:10以内置基序佐剂，在该单链DNA的序列中选定5’端的第1个碱基作为起始位置，从该起始位置起将该单链DNA的序列替换为SEQ ID NO:1所示的CpG ODN基序佐剂的序列，且当该基序佐剂的序列覆盖折弯处碱基时保持折弯处碱基不变，从而获得内置基序佐剂的重组单链DNA，即SEQ ID NO:14。
然后根据该内置基序佐剂的重组单链DNA中各段子序列，将其余各条单链DNA中对应的子序列进行碱基调整使之保持碱基互补配对。所得序列如下表所示：
上表中：(1)SH为巯基，表示采用巯基与马来酰亚胺的偶联方式偶联多肽；X表示采用除巯基外的其它修饰手段来偶联多肽；
(2)1号链下划线标记出内置基序佐剂，2号链、4号链下划线则标记出相应的碱基互补配对序列。
(3)1至4号链依次来自于SEQ ID NO:10至13，并依次编号为SEQ ID NO:14至17。5至8号链依次与1至4号链序列相同，不同之处仅在于5’端采用除巯基外的其它修饰手段来偶联多肽。
(4)各单链DNA的长度均为55bp，每一段子序列的长度均为17bp，折弯处碱基的长度均为2bp。
实施例2
本实施例为验证自组装成功的实施效果。
从实施例1中选取1至4号链，进行负载多肽的DNA四面体制备，主要步骤为：
(1)选择C末端未进行修饰的实施例1中的1至4号链，分别化学合成后，以PBS(PH＝7.0)分别溶解。其中，1号链记作DCP-A。
(2)将N末端经马来酰亚胺丙酸修饰的NitraTh肽(此肽即辅助性表位肽，序列为SEQ ID NO:18)，利用PBS(PH＝7.0)溶解。
取等摩尔质量溶解后的1至4号链与NitraTh肽，分别在37℃旋转混合2小时，使各单链DNA分别与多肽完全偶联，形成4个复合物。其中，1号链与NitraTh肽的复合物记作DCP-A-NitraTh。
(3)之后，将4个复合物混合至一起，利用PCR仪进行梯度降温，使其按照碱基互补配对的原则折叠成正四面体结构。
(4)退火条件：95℃，2min；95℃-25℃，按1℃/min进行梯度降温；25℃迅速下降至4℃；4℃，5min。
退火样本在TAE缓冲液中于60V在冰水浴中凝胶电泳40min，结果如图1所示，相较于未负载NitraTh的DNA四面体(命名为DCP),负载NitraTh的DNA四面体(命名为DCNP)的分子量进一步增大。
退火样本经原子力显微镜成像，结果如图2所示，可见成功自组装成DNA四面体。
制备后的退火样本，进行动态光散射测定，结果如图3所示，DCP和DCNP的粒径分别为5.67nm和21.21nm。
实施例3
本实施例为验证DNA四面体淋巴结驻留情况。
(1)采用实施例1的1至4号链，按实施例2步骤，将肽替换为FITC标记的SIINFEK(FITC)L肽，制备负载SIINFEK(FITC)L肽的DNA四面体(命名为DCP-SIINFEK(FITC)L)，按16nmol/200uL/只，注射到小鼠腹股沟皮下，左右各100uL。
该SIINFEKL肽的氨基酸序列为：H-Ser-Ile-Ile-Asn-Phe-Glu-Lys-Leu-OH。此肽为源于OVA蛋白的MHC-I Kb限制性表位肽，能够有效的激活CD8+T细胞，作为一种模式抗原肽被广泛使用。
(2)24h后，处死小鼠，剥离小鼠髂骨淋巴结，进行组织荧光拍照。
结果如图4所示，相较于空白对照组和纯SIINFEK(FITC)L肽组相比，经DNA四面体负载后，能够提高SIINFEKL肽淋巴结驻留率。
实施例4
本实施例为测定DNA四面体被DC细胞摄取能力。
(1)DC2.4细胞按照1x105/孔，铺至激光共聚焦小皿，2mL/皿。
(2)采用实施例3的负载SIINFEK(FITC)L肽的DNA四面体(DCP-SIINFEK(FITC)L)，过滤除菌后加入至小皿中，使四面体的终浓度为2uM。
(3)37℃，5％CO2培养24h。
(4)吸弃培养基，加入500μL的37℃预温育的溶酶体荧光探针工作液，37℃共孵育60min。
(5)加入1mL的PBS轻轻洗涤一遍。
(6)加入500μL固定液固定15min。
(7)吸取孔内液体，加入500μL的PBS轻轻洗涤一遍。
(8)加入500μL的DAPI(用PBS稀释到10ug/mL)，室温染色10min。
(9)每孔加入500μL的PBS轻轻洗涤一遍。
(10)每孔加入100μL的PBS，进行激光共聚焦拍照。
结果如图5所示，相较于空白对照组和纯SIINFEK(FITC)L肽组相比，经DNA四面体负载后，FITC标记SIINFEKL肽能被DC细胞高效摄取。
实施例5
本实施例为分析经DNA四面体负载后SIINFEKL肽被DC细胞的递呈情况。
事先按实施例3步骤制备负载SIINFEKL肽的DNA四面体(DCP-SIINFEKL)，与实施例3相比，区别仅在于本实施例采用无FITC标记的SIINFEKL肽。
(1)处死小鼠，75％乙醇中浸泡5min，尽量去除残留的乙醇。
(2)分离小鼠股骨和胫骨，放入PBS缓冲液中荡洗干净。
(3)用剪刀将股骨和胫骨分离，并剪开骨两端。
(4)用1mL注射器吸取PBS缓冲液，从一端插入骨头，将骨髓冲出。
(5)将骨髓液吹出并收集到6孔板中。
(6)将骨髓液经200目筛网过滤，并转移至15mL离心管中。
(7)补加PBS缓冲液至10mL，1200rpm，离心5min。
(8)倒弃上清，加入10mL PBS缓冲液，并重悬细胞。
(9)1200rpm，离心5min，倒弃上清，加入1mL 1640培养基(10％灭活FBS+20ng/mLmGM-CSF+15mg/mL mIL-4)，重悬后计数。
(10)按1x106/mL将骨髓细胞铺至10cm平皿中。
(11)37℃，5％CO2培养。
(12)48h后吸弃7mL培养基，注意轻微操作，避免吸到贴壁的BMDC。
(13)补加8mL 1640培养基(10％灭活FBS+20ng/mL mGM-CSF+15mg/mL mIL-4)。
(14)37℃，5％CO2培养。
(15)48h后将诱导分化后的BMDC轻轻吹悬，不要用力，避免将巨噬细胞吹起。
(16)2000rpm，5min离心。加入1mL 1640培养基(含10％FBS+20ng/mL mGM-CSF+15ng/mL mIL-4)重悬。
(17)计数后进行铺板，按5x105/孔，铺至24孔板，之后加入DCP-SIINFEKL，使终浓度为2uM。
(18)37℃，5％CO2培养24h。
(19)利用抗CD11c/CD80/CD86抗体标记DC细胞，利用eBio25-D1.16抗体标记MHC-OVA，之后流式细胞术测定，以评估抗原递呈情况。
结果如图6所示，经DNA四面体负载后，SIINFEKL肽(也即OVA257-264抗原肽)的递呈效率大大提高。
实施例6
本实施例为测定经含内置CPG ODN基序的DNA四面体对DC细胞激活的影响。
(1)在制备获得的5x105/孔的BMDCs中加入等摩尔量(200nM/孔)的CPG ODN(序列SEQ ID NO:1)、不含内置CPG ODN基序的DNA四面体(由SEQ ID NO:10-13的四条序列直接退火自组装获得，记作DP)、含内置CPG ODN基序的DNA四面体(实施例1的1至4号链按实施例2步骤，不与多肽偶联，直接退火自组装获得，记作DCP)。
(2)37℃，5％CO2培养24h。之后利用ELISA测定上清中IL-6和TNF-α细胞因子的分泌情况。
结果如图7所示，相较于CPG ODN，含内置CPG ODN基序的DNA四面体大大增加了DC细胞促炎因子的释放。
实施例7
本实施例为负载抗原肽及NitraTh辅助表位肽后抗原特异性T细胞激活情况。
(1)制备只负载SIINFEKL抗原肽的含内置CPG的DNA四面体(DCP-SIINFEKL)(即实施例5的无FITC标记四面体)、同时负载SIINFEKL抗原肽和NitraTh肽的不含内置CPG的DNA四面体(DNP-SIINFEKL)、以及同时负载SIINFEKL抗原肽和NitraTh肽的含内置CPG的DNA四面体(DCNP-SIINFEKL)。
制备同时负载SIINFEKL抗原肽和NitraTh肽的含内置CPG的DNA四面体(DCNP-SIINFEKL)的具体过程如下：首先将实施例1的1至4号链的5’端进行游离巯基修饰，对NitraTh肽、SIINFEKL肽的N端分别进行马来酰亚胺修饰，分别用PBS(PH＝7.0)溶解。之后,将1号链和2号链分别与NitraTh肽等摩尔反应，将3号链和4号链分别与SIINFEKL肽等摩尔反应，37℃，2h。之后，进行退火行成DNA四面体，此时该DNA四面体将同时负载2种肽。
制备同时负载SIINFEKL抗原肽和NitraTh肽的不含内置CPG的DNA四面体(DNP-SIINFEKL)的具体过程与上述内容基本相同，不同之处仅在于：采用SEQ ID NO:10至13四条单链DNA进行处理。
(2)选择6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，随机分组后免疫上述不同类型的DNA四面体、单纯的SIINFEKL抗原肽+NitraTh肽+CPG的混合物，按16nmol/只/次，每隔2周免疫一次，共计2次。
(3)在第2次免疫后1周，测定小鼠外周血中SIINFEKL抗原肽特异性的CD8+T细胞比例。
注：本实施例提到的CPG均为CPG ODN(序列SEQ ID NO:1)。
结果如图8所示，相较于DCP-SIINFEKL组与DNP-SIINFEKL组，DCNP-SIINFEKL组小鼠外周血中SIINFEKL抗原肽特异性的CD8+T细胞比例显著提高，表明了在该递送系统中，内置CPG ODN、偶联NitraTh肽均很重要。
实施例8
本实施例为B16F10-OVA预防给药模型评估该递送系统对抗原递送后的抗肿瘤活性。
(1)制备不同组别的样本，包括SIINFEKL抗原肽+CPG ODN(序列SEQ ID NO:1)+NitraTh肽的混合组、DCP-SIINFEKL组、DNP-SIINFEKL组以及DCNP-SIINFEKL组(同实施例7)。
(2)按16nmol/只/次，每隔2周免疫一次，共计3次。
(3)最后1次免疫14天后，尾静脉注射1x105 B16F10-OVA细胞/只，21天后处死小鼠，分离小鼠肺，并统计结节数。同时ELISPOT测定小鼠脾脏中SIINFEKL抗原肽特异性T细胞激活情况。
结果如图9、图10所示，与其他各组相比，DCNP-SIINFEKL组小鼠肿瘤抑制更加明显，且激活了长效的抗原特异性CD8+T细胞。
实施例9
本实施例为利用MC38肿瘤皮下移植模型评估该系统对肿瘤新生抗原肽递送后的抗肿瘤活性。
(1)选取MC38肿瘤细胞株中已鉴定的新生抗原Adpgk。
Adpgk氨基酸序列：ASMTNMELM。该表位肽为鼠源肿瘤细胞株MC38中已明确的由单碱基突变形成的新生抗原肽。
(2)制备不同组别的样本，包括Vehicle组、Adpgk+NitraTh+CPG混合组、DCNP-Adpgk(内置CpG、同时负载NitraTh肽和Adpgk的DNA四面体)共递送组、DCNP-Adpgk与PD-1单抗联用组(两者联用，无偶联关系)，其中DNA四面体的制备流程参考前述相关实施例的步骤。注：此处提到的CPG为CPG ODN(序列SEQ ID NO:1)。
(3)选择6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，皮下注射2x105/只的MC38细胞。待肿瘤直接到3-5mm时，随机分组。
(4)之后，按照16nmol/只/次，每隔1周免疫一次，共计3次。
(5)每隔2天监测一下小鼠肿瘤大小和体重。
(6)初次给药后21天处死小鼠，对小鼠肿瘤进行拍照，流式细胞术测定小鼠外周血中Adpgk特异性CD8+T细胞激活情况。
结果如图11、图12所示，相较于Vehicle与Adpgk+NitraTh+CPG混合组，DCNP-Adpgk共递送组能够显著抑制肿瘤的生长，且与PD-1单抗联用后，肿瘤生长得到了进一步的抑制。同时，共递送组外周血中Adpgk特异性CD8+T细胞激活水平更高。
实施例10
本实施例为利用MC38肿瘤皮下移植模型评估该系统对PD-L1免疫检查点抗原肽递送后的抗肿瘤活性。
(1)选择免疫检查点PD-L1，预测筛选获得表位肽，其中PD-L1的B表位肽序列为：AGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGN；PD-L1的T表位肽序列为：VNAPYRKI。
(2)制备不同组别的样本，包括Vehicle组、同时负载PD-L1的B表位肽和T表位肽以及NitraTh肽的DNA四面体(含CPG)，其中DNA四面体的制备流程参考前述相关实施例的步骤，预先将单链DNA分为三组并偶联相应肽，之后再自组装成四面体。注：此处提到的CPG为CPG ODN(序列SEQ ID NO:1)。
(3)选择6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，皮下注射2x105/只的MC38细胞。待肿瘤长到3-5mm时，随机分组。
(4)之后，按照16nmol/只/次，每隔1周免疫一次，共计3次。
(5)每隔2天监测一下小鼠肿瘤大小和体重。
(6)初次给药后21天处死小鼠，对小鼠肿瘤进行拍照。
结果如图13所示，相较于Vehicle组，同时负载PD-L1的B表位肽和T表位肽以及NitraTh的DNA四面体组能够显著抑制肿瘤的生长。
除此之外，发明人课题组还研究了：将抗原HER2、CD47、CD39、CD73、CD24、KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、CTLA-4、NY-ESO-1、P53之一，或抗原表位TSA、TAA之一，与辅助性表位肽共同负载于含CPG的DNA四面体(其中，辅助性表位肽序列为SEQ ID NO:18至36之一，CPG序列为SEQ ID NO:1至9之一)，分别检测其对小鼠肿瘤的影响，结果表明均能显著抑制肿瘤的生长。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 自组装DNA四面体及肽疫苗递送系统
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 12
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
Claims (10)
1.一种自组装DNA四面体，由四条单链DNA组成，其特征是，第一条单链DNA的序列如SEQID NO:10所示，第二条单链DNA的序列如SEQ ID NO:11所示，第三条单链DNA的序列如SEQID NO:12所示，第四条单链DNA的序列如SEQ ID NO:13所示。
2.一种重组自组装DNA四面体，其特征是，由权利要求1所述的自组装DNA四面体经重组获得，所述第一条、第二条、第三条、第四条单链DNA中至少有两条单链DNA经预设规则重组成为重组单链DNA；其中，一条重组单链DNA中内置基序佐剂，且其余重组单链DNA中分别内置基序佐剂的互补序列或互补序列的一部分。
3.根据权利要求2所述的重组自组装DNA四面体，其特征是，所述基序佐剂为TLR-9激动剂基序佐剂CpG系列，且基序佐剂的序列如SEQ ID NO:1-9之一所示。
4.根据权利要求2所述的重组自组装DNA四面体，其特征是，所述预设规则包括：
在重组之前，所述第一条、第二条、第三条、第四条单链DNA的序列中，自5’端起第18位和第19位碱基、第37位和第38位碱基分别为折弯处碱基，这些折弯处碱基将各条单链DNA分别划分为3段子序列，每一段子序列分别与其余某条单链DNA中的某一段子序列彼此对应且碱基互补配对；
重组时，先选择一条单链DNA的序列以内置基序佐剂，在该单链DNA的序列中任意选定碱基位置作为起始位置，从该起始位置起将该单链DNA的序列替换为预先选定的一条基序佐剂的序列，且当该基序佐剂的序列覆盖折弯处碱基时保持折弯处碱基不变，从而获得内置基序佐剂的重组单链DNA；
根据该内置基序佐剂的重组单链DNA中各段子序列，将其余各条单链DNA中对应的子序列进行碱基调整使之保持碱基互补配对。
5.根据权利要求4所述的重组自组装DNA四面体，其特征是，在重组之前以及重组之后，
所述第一条单链DNA的序列结构为：5’-1号子序列-折弯处碱基-2号子序列-折弯处碱基-3号子序列-3’；
所述第二条单链DNA的序列结构为：5’-4号子序列-折弯处碱基-2号子序列的互补序列-折弯处碱基-5号子序列-3’；
所述第三条单链DNA的序列结构为：5’-4号子序列的互补序列-折弯处碱基-6号子序列-折弯处碱基-3号子序列的互补序列-3’；
所述第四条单链DNA的序列结构为：5’-1号子序列的互补序列-折弯处碱基-6号子序列的互补序列-折弯处碱基-5号子序列的互补序列-3’。
6.一种肽疫苗递送系统，其特征是，以权利要求2至5任一项所述的重组自组装DNA四面体为主体，该主体各条单链DNA的5’端或3’端分别偶联有辅助性表位肽或肽疫苗；所述辅助性表位肽的序列为SEQ ID NO:18-36之一；所述肽疫苗包括抗原或抗原表位。
7.根据权利要求6所述的肽疫苗递送系统，其特征是，该主体中至少一条单链DNA的5’端或3’端偶联有辅助性表位肽，且该主体中至少一条单链DNA的5’端或3’端偶联有肽疫苗；或者，所述抗原为SIINFEKL、HER2、PD-L1、CD47、CD39、CD73、CD24、KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、CTLA-4、NY-ESO-1、P53之一；或者，所述抗原为肿瘤新生抗原；或者，所述抗原表位为TSA、TAA之一。
8.根据权利要求7所述的肽疫苗递送系统，其特征是，所述肿瘤新生抗原包括Adpgk。
9.含有权利要求6至8任一项所述肽疫苗递送系统的组合物。
10.权利要求6至8任一项所述肽疫苗递送系统或权利要求9所述组合物用于制备预防或治疗肿瘤的药物的用途。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114767830A (zh) * | 2022-04-28 | 2022-07-22 | 四川大学 | 一种预防骨坏死和/或促进血管生成的复合物及其制药用途 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150004193A1 (en) * | 2012-02-06 | 2015-01-01 | Arizona Board of Regents, a body Corporate of the State of Arizona, Acting for and on Behalf of Ariz | Novel dna-origami nanovaccines |
| CN107335065A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-10 | 郑州大学 | 一种靶向DNA纳米自组装体载NF‑kB decoy ODNs的制备方法及其应用 |
| CN109748952A (zh) * | 2018-05-02 | 2019-05-14 | 中国药科大学 | 辅助性表位肽及其应用 |
| US20190282706A1 (en) * | 2016-05-18 | 2019-09-19 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Peptide-dna chimeras for treatment of her overexpressing cancers |
| CN110507817A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-11-29 | 国家纳米科学中心 | 一种dna纳米疫苗及其制备方法和应用 |
| CN112933219A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-06-11 | 北京大学深圳研究生院 | 一种dna-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途 |
| CN113750259A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-12-07 | 中南大学 | 一种具有靶向激活能力的dna纳米系统及其构建方法和应用 |
-
2021
- 2021-12-15 CN CN202111537361.6A patent/CN114181935B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150004193A1 (en) * | 2012-02-06 | 2015-01-01 | Arizona Board of Regents, a body Corporate of the State of Arizona, Acting for and on Behalf of Ariz | Novel dna-origami nanovaccines |
| US20190282706A1 (en) * | 2016-05-18 | 2019-09-19 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Peptide-dna chimeras for treatment of her overexpressing cancers |
| CN107335065A (zh) * | 2017-06-23 | 2017-11-10 | 郑州大学 | 一种靶向DNA纳米自组装体载NF‑kB decoy ODNs的制备方法及其应用 |
| CN109748952A (zh) * | 2018-05-02 | 2019-05-14 | 中国药科大学 | 辅助性表位肽及其应用 |
| CN110507817A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-11-29 | 国家纳米科学中心 | 一种dna纳米疫苗及其制备方法和应用 |
| CN112933219A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-06-11 | 北京大学深圳研究生院 | 一种dna-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途 |
| CN113750259A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-12-07 | 中南大学 | 一种具有靶向激活能力的dna纳米系统及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIANG LI等: "Self-assembled multivalent DNA nanostructures for noninvasive intracellular delivery of immunostimulatory CpG oligonucleotides", ACS NANO., vol. 5, no. 11, pages 8783 - 8789, XP055502313, DOI: 10.1021/nn202774x * |
| Y. LIU等: "Tetrahedral framework nucleic acids as an advanced drug delivery system for oligonucleotide drugs", APL MATERIALS, vol. 8, no. 10, XP012250816, DOI: 10.1063/5.0025211 * |
| 和晨辰 等: "以DNA四面体为载体研究CpG对免疫Melan-A抗原肽协同作用", 天津医科大学学报, vol. 24, no. 3, pages 185 - 187 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114767830A (zh) * | 2022-04-28 | 2022-07-22 | 四川大学 | 一种预防骨坏死和/或促进血管生成的复合物及其制药用途 |
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| Publication number | Publication date |
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