CN113433320B - 磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物ca19-9的方法 - Google Patents

磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物ca19-9的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤检测的技术领域，特别是涉及一种磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19‑9的方法；该方法选择GQDs‑PEG‑Apt作为CA19‑9特性识别和能量供体，以载有四氧化三铁纳米颗粒的WS2/Fe3O4纳米复合物为能量受体，构建了磁分离荧光增强型适配体传感器；利用加入CA19‑9前后，能量供体与受体间FRET效应导致体系荧光信号增强的变化，实现对目标物的定量检测。本方法的优点在特异性好、灵敏度高、检测范围宽、低检测限、低成本、操作简单，且具有良好的实用价值，有望应用于临床上肿瘤标志物CA19‑9的检测。

Description

磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19-9的 方法
技术领域
本发明涉及肿瘤检测的技术领域，特别是涉及一种磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19-9的方法。
背景技术
肿瘤标志物(tumormarker，TM)又称肿瘤标记物，是指由肿瘤刺激宿主正常细胞产生的或由肿瘤组织自身产生的化学、生物类物质，主要包括抗原、激素、蛋白质、酶及癌基因产物等。临床医学表明，体内肿瘤标志物一般可以反映肿瘤的存在、恶性及良性、生长以及预后治疗。癌症患者体内，相关肿瘤标志物的含量通常高于阈值即正常人水平。因此，肿瘤标志物的含量测定对肿瘤的诊断、分类、发育程度及治疗指导、监控都具有重要的意义。
糖类抗原CA19-9(Carbohydrateantigen19-9，CA19-9)是一种黏蛋白型糖类蛋白肿瘤标志物，由Koprowski在1979年首先发现，1983年Delcillano等将其作为胰腺癌肿瘤标志应用于临床。CA19-9主要在胎儿的胃、肠和胰等上皮细胞发现，正常人胰腺、胆管细胞及胃、结肠、子宫内膜和唾液腺上皮细胞等亦可合成。医学研究发现，人体血清C19-9阳性阈值为37kU/mL，在胰腺癌患者中CA19-9敏感度高达71％～93％。CA19-9与其他肿瘤标志物联合检测，有助于提高消化系统恶性肿瘤的检出率。作为一种临床应用最多、最具诊断价值的肿瘤相关抗原之一，血清CA19-9检测一直是肿瘤检测技术领域重要研究内容。
临床上对血清CA19-9的检测方法多基于免疫学原理，如放射免疫测定法(radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)法和化学发光免疫分析法(chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)等,这些方法均存在操作步骤繁琐且反应时间较长等共性问题。另外，抗体还存在制备周期长、成本高和容易失活等问题，这在一定程度上限制了其临床的广泛应用。因此，建立血清CA19-9的简单、快速、高效和低成本的检测方法，这在临床生化检验领域有应用前景。
适配体(Aptamer)是一种人工筛选出来的单链DNA或RNA分子，它能够高特异性和高亲和力与靶标结合，过程类似抗原-抗体的结合反应。与抗体相比，适配体作为靶向识别元件，在血清CA19-9检测领域具有许多优势，如体积小、化学稳定、成本低、保存条件不苛刻等。作为一种能特异性结合多种靶标的分子探针，适配体在血清肿瘤标志检测方面具有良好的应用前景。目前，仅有癌胚抗原(CEA)、糖类抗原12-5(CA12-5)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异抗原(PSA)和黏蛋白(MUC1)少量肿瘤标志物适配体传感器被研究，CA19-9适配体传感器及检测方法至今未见相关报道。
适配体本身不具有信号指示作用，以适配体分子为识别元件的传感器需要结合可识别信息，如电、光、热、质或声等。荧光适配体传感器兼具荧光检测的高灵敏性和适配体传感器的高选择性，还具有精度高、检测速度快、操作简单和成本低等优点，是近年来生物传感器的重点发展方向之一。其中通过荧光基团(供体)和猝灭剂(受体)构建的基于荧光共振能量转移的适配体传感器是最为普遍的荧光增强型适配体传感器。低荧光背景、高荧光量子产量是荧光增强型适配体传感器宽范围、低检测限检测血清CA19-9需要解决的关键技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种具有特异性好、灵敏度高、检测范围宽、低检测限、低成本、操作简单的磁分离荧光增强型适配体传感器制备及肿瘤标志物CA19-9定量检测方法。
本发明的磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19-9的方法，具体包括如下步骤：
步骤1、通过水热合成法制备羧基化石墨烯量子点(GQDs-COOH)；首先，将碳纤维分散在混酸溶液中，超声分散2h，在95℃条件下剧烈搅拌12h；然后，向烧瓶中加入弱有机酸柠檬酸，在相同温度下继续搅拌1h，得到GQDs-COOH；反应结束后，向烧瓶中缓慢加入超纯水；当混合物体系颜色发生改变时，向烧瓶中缓慢加入氢氧化钠溶液，将反应体系pH值调至1左右；再加入碳酸钠溶液，使pH值为8；将烧瓶放入冰浴中，将温度调节到4℃；在此温度下缓慢搅拌2min，沉淀溶液2-4h，去除沉淀物，将含有GQDs-COOH液体用1000KD透析袋透析3天，将溶液浓缩后冷冻干燥24h；
步骤2、制备聚乙二醇化石墨烯量子点(GQDs-PEG)：GQDs-COOH溶液中依次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌15min；再加入10％PBS稀释的NH2-PEG-NH2，室温下与活化的GQDs-COOH孵育过夜，超滤离心管纯化、浓缩，得到GQDs-PEG颗粒；
步骤3、合成适配体化石墨烯量子点(GQDs-PEG-Apt)：羧基修饰的适配体(Apt)用EDC/NHS方法预处理15min；然后，将终浓度为1.95μmol/L的Apt加入到GQDs-PEG溶液中，室温下摇动过夜；终产物GQDs-PEG-Apt通过超滤离心管进行纯化和浓缩；
步骤4、采用水热法制备二硫化钼纳米片(WS2)：将WS2粉末原料加入到NaOH溶液中，30℃下持续搅拌18h，在90℃下缓慢蒸发至完全干燥；然后加入超纯水，重复上述操作3次，得到的固体在80℃下真空干燥12h，将固体分散在乙醇中，超声24h；1000r/min离心，弃去沉淀物，上清液15000r/min离心，收集的沉淀物即为WS2纳米片；
步骤5、溶剂热法制备四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4)：将乙酰丙酮铁加入到乙醇中，室温下搅拌直至悬浮物均匀分布；将悬浮液转移到水热反应釜中，氮气下密封；反应釜在180℃下加热12h；冷却至室温，在氮气气氛下，用丙酮、乙醇和超纯水分别洗涤三次；磁场分离，收集黑色粉末产物即为Fe3O4纳米颗粒，冷冻干燥12h；
步骤6、组装WS2/Fe3O4纳米复合物：含Fe3O4纳米颗粒的四氢呋喃(THF)溶液中，缓慢加入meso-2,3-二巯基琥珀酸(DMSA)，超声30min，对磁性Fe3O4纳米颗粒进行功能化处理；室温下搅拌2h，14800r/min离心去除溶剂；得到DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒；然后，将DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒缓慢加入到含有WS2纳米片水溶液中，超声作用30min；室温下搅拌6h，得到WS2/Fe3O4纳米复合物悬浮溶液；
步骤7、构建GQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4磁分离荧光增强型适配体传感体系：取步骤6和步骤3中WS2/Fe3O4纳米复合物悬浮溶液和GQDs-PEG-Apt溶液，37℃孵育25min，得到GQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4磁分离荧光增强型适配体传感体系溶液；
步骤8、磁分离荧光增强型适配体传感器定量检测CA19-9：取步骤7中GQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4溶液，与pH7.4磷酸盐缓冲溶液进行混合；之后在混合溶液中分别加入一系列不同浓度的肿瘤标志物CA19-9溶液，每个样品检测三次，取平均值；荧光测量条件为：激发/发射狭缝固定为10nm/5nm，激发波长固定为359nm，荧光发射谱发射波长范围为400-600nm。
本发明的磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19-9的方法，步骤1中混酸溶液由体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸混合而成。
本发明的磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19-9的方法，所述步骤2中使用的羧基化石墨烯量子点(GQDs-COOH)溶液浓度为1mg/mL。
本发明的磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19-9的方法，所述步骤2和步骤3中使用的超滤离心管截留率为30kD。
与现有技术相比本发明的有益效果为：该方法特异性好、灵敏度高、检测范围宽、低检测限、低成本、操作简单。
附图说明
图1是CA19-9浓度对GQDs-PEG-Apt荧光光谱影响图；
图2是CA19-9浓度对GQDs-PEG-Apt荧光强度响应关系图；
图3是CA19-9浓度与GQDs-PEG-Apt荧光相对恢复率线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19-9的方法步骤如下：
步骤1、制备羧基化石墨烯量子点(GQDs-COOH)：首先，通过水热合成法制备GQDs-COOH，将200mg碳纤维分散在16mL混酸(浓硫酸：浓硝酸体积比为3:1)溶液中，超声分散2h，在95℃条件下剧烈搅拌12h；然后，向反应瓶中加入弱有机酸柠檬酸，在相同温度下继续搅拌1h，得到GQDs-COOH；反应结束后，向烧瓶中缓慢加超纯水；当混合物体系的颜色由棕色变为棕红色时，向反应体系中缓慢加入氢氧化钠溶液，将pH值调至1左右；再加入碳酸钠溶液，使pH值为8；将烧瓶放入冰浴中，使温度调节到4℃；在此温度下缓慢搅拌2min，沉淀溶液2-4h，去除沉淀物，将含有GQDs-COOH液体用1000KD透析袋透析3天，将溶液浓缩后冷冻干燥24h，得到GQDs-COOH固体粉末。
步骤2、制备聚乙二醇化石墨烯量子点(GQDs-PEG)：将1mLGQDs-COOH(1mg/mL)溶液依次加入80mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和120mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌15min；再加入10％PBS稀释的聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)，室温下与活化的GQDs-COOH孵育过夜，制备GQDs-PEG；超滤离心管(3KD)纯化、浓缩，得到GQDs-PEG溶液；微孔微孔膜(0.22μm)过滤掉可能存在的大团聚体，获得GQDs-PEG颗粒。
步骤3、合成适配体化石墨烯量子点(GQDs-PEG-Apt)：通过EDC/NHS方法将CA19-9的Apt共价偶联到胺功能化GQDs-PEG上。首先，羧基修饰的Apt用EDC/NHS预处理15min；然后，将终浓度为1.95μmol/L的活化Apt加入到胺功能化的GQDs-PEG溶液中，室温下摇动过夜；终产物GQDs-PEG-Apt利用超滤离心管(30kD)进行纯化和浓缩，去除体系中过量的EDC、NHS和Apt。
步骤4、制备二硫化钼纳米片(WS2)：采用水热合成法制备WS2纳米片。具体过程为：4gNaOH溶于20mL超纯水，30℃下揽拌10min；将0.4gWS2粉末原料加入到上述溶液中，30℃下继续揽拌18h，在90℃下缓慢蒸发至完全干燥；然后加入20mL超纯水，重复上述操作3次，得到的固体超纯水充分洗涤去除残留的NaOH；80℃下真空干燥12h，将其分散在40mL乙醇中，超声24h；1000r/min离心，弃去沉淀物，收集的上清液15000r/min离心，收集的沉淀物即为WS2纳米片。
步骤5、合成四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4)：采用溶剂热合成方法，将1.1g乙酰丙酮铁加入到50mL乙醇中，室温下搅拌直至悬浮物均匀分布；将悬浮液转移到60mL水热反应釜中，氮气下密封；反应釜在180℃下加热12h；冷却至室温，在氮气气氛下，用丙酮、乙醇和超纯水分别洗涤三次；磁场分离，收集黑色粉末产物并冷冻干燥12h，获得Fe3O4纳米颗粒。
步骤6、组装WS2/Fe3O4纳米复合物：含20mgFe3O4纳米颗粒四氢呋喃(THF)溶液中，缓慢加入25mgmeso-2,3-二巯基琥珀酸(DMSA)，超声30min，对磁性Fe3O4纳米颗粒进行功能化处理；室温下搅拌2h，14800r/min离心去除溶剂；得到DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒。然后，将10mgDMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒，缓慢加入到含有6mL333.33μg/mLWS2纳米片水溶液中，超声作用30min；室温下搅拌6h，得到WS2/Fe3O4纳米复合物悬浮溶液。
步骤7、构建GQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4磁分离荧光增强型适配体传感体系：取上述180μLWS2/Fe3O4纳米复合物悬浮溶液和200μLGQDs-PEG-Apt溶液，37℃孵育25min，得到GQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4磁分离荧光增强型适配体传感体系溶液。
步骤8、磁分离荧光增强型适配体传感器定量检测CA19-9：取200μLGQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4混合溶液与100μLpH7.4的磷酸盐缓冲溶液进行混合。荧光测量条件为：激发/发射狭缝固定为10nm/5nm，激发波长(λex)固定为359nm，荧光发射谱发射波长(λem)范围为400-600nm。在上述混合溶液中分别加入一系列不同浓度的肿瘤标志物CA19-9溶液，每个样品检测三次，取其平均值。荧光强度随着CA19-9浓度的增加而增加(见图1和图2)，体系荧光相对恢复率((F2-F1)/F1)与CA19-9浓度对数之间存在良好的线性关系，CA19-9浓度范围为2-1000U/mL，线性回归方程为y＝0.22733logC+0.74994(见图3)。式中，y为荧光相对恢复率，c为CA19-9浓度，U/mL，相关系数为0.98824。与现有检测方法相比，发明专利所构建的磁分离荧光增强型适配体传感器对CA19-9检测线性范围更宽，达到1.995～1000U/mL；检测限更低，其值为0.01U/mL。
步骤9、血清中CA19-9的检测：磁分离荧光增强型适配体传感器检测血清样本CA19-9(5U/mL、10U/mL和50U/mL)结果、相对标准偏差(RSD)和回收率见表1，发明专利构建的磁分离荧光增强型适配体传感器对血清样本CA19-9的RSD在1.09～4.51％，回收率90.21～99.33％。
表1血清肿瘤标志物CA19-9加标真实样品的回收率
Figure BDA0003169247770000081
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，如更换肿瘤标志物种类，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种磁分离荧光增强型适配体传感器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1、通过水热合成法制备羧基化石墨烯量子点GQDs-COOH；首先，将碳纤维分散在混酸溶液中，超声分散2h，在95℃条件下剧烈搅拌12h；然后，向烧瓶中加入弱有机酸柠檬酸，在相同温度下继续搅拌1h，得到GQDs-COOH；反应结束后，向烧瓶中缓慢加入超纯水；当混合物体系颜色发生改变时，向烧瓶中缓慢加入氢氧化钠溶液，将反应体系pH值调至1；再加入碳酸钠溶液，使pH值为8；将烧瓶放入冰浴中，使温度调节到4℃；在此温度下缓慢搅拌2min，沉淀溶液2-4h，去除沉淀物，将含有GQDs-COOH液体用1000KD透析袋透析3天，将溶液浓缩后冷冻干燥24h；
步骤2、制备聚乙二醇化石墨烯量子点GQDs-PEG：GQDs-COOH溶液中依次加入1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌15min；再加入10％PBS稀释的NH2-PEG-NH2，室温下与活化的GQDs-COOH孵育过夜，超滤离心管纯化、浓缩，得到GQDs-PEG颗粒；
步骤3、合成适配体化石墨烯量子点GQDs-PEG-Apt：羧基修饰的适配体Apt用EDC/NHS方法预处理15min；然后，将终浓度为1.95μmol/L的Apt加入到GQDs-PEG溶液中，室温下摇动过夜；终产物GQDs-PEG-Apt通过超滤离心管进行纯化和浓缩；
步骤4、采用水热法制备二硫化钼纳米片WS2：将WS2粉末原料加入到NaOH溶液中，30℃下持续搅拌18h，在90℃下缓慢蒸发至完全干燥；然后加入超纯水，重复上述操作3次，得到的固体在80℃下真空干燥12h，将固体分散在乙醇中，超声24h；1000r/min离心，弃去沉淀物，上清液15000r/min离心，收集的沉淀物即为WS2纳米片；
步骤5、溶剂热法制备四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4：将乙酰丙酮铁加入到乙醇中，室温下搅拌直至悬浮物均匀分布；将悬浮液转移到水热反应釜中，氮气下密封；反应釜在180℃下加热12h；冷却至室温，在氮气气氛下，用丙酮、乙醇和超纯水分别洗涤三次；磁场分离，收集黑色粉末产物即为Fe3O4纳米颗粒，冷冻干燥12h；
步骤6、组装WS2/Fe3O4纳米复合物：含Fe3O4纳米颗粒的四氢呋喃THF溶液中，缓慢加入meso-2,3-二巯基琥珀酸DMSA，超声30min，对磁性Fe3O4纳米颗粒进行功能化处理；室温下搅拌2h，14800r/min离心去除溶剂；得到DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒；然后，将DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒，缓慢加入到含有WS2纳米片水溶液中，超声作用30min；室温下搅拌6h，得到WS2/Fe3O4纳米复合物悬浮溶液；
步骤7、构建GQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4磁分离荧光增强型适配体传感体系：取步骤6和步骤3中WS2/Fe3O4纳米复合物悬浮溶液和GQDs-PEG-Apt溶液，37℃孵育25min，得到GQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4磁分离荧光增强型适配体传感体系溶液；
步骤8、磁分离荧光增强型适配体传感器定量检测CA19-9：取步骤7中GQDs-PEG-Apt/WS2/Fe3O4溶液，与pH7.4磷酸盐缓冲溶液进行混合；之后在混合溶液中分别加入一系列不同浓度的肿瘤标志物CA19-9溶液，每个样品检测三次，取其平均值；荧光测量条件为：激发/发射狭缝固定为10nm/5nm，激发波长固定为359nm，荧光发射谱发射波长范围为400-600nm。
2.如权利要求1所述的磁分离荧光增强型适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤1中混酸溶液由体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸混合而成。
3.如权利要求1所述的磁分离荧光增强型适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2中使用的羧基化石墨烯量子点GQDs-COOH溶液浓度为1mg/mL。
4.如权利要求3所述的磁分离荧光增强型适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3中使用的超滤离心管截留率为30kD。
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