CN110186911A - 一种基于共振能量转移的电致化学发光适配体传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于共振能量转移的电致化学发光适配体传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及电致化学发光适配体传感器技术领域，特别是涉及一种基于共振能量转移的毒死蜱电致化学发光适配体传感器制备方法，包括毒死蜱电致化学发光适配体传感器的制备步骤、使用该传感器测定毒死蜱的操作方法等；以生物分子辅助合成MoS2/CdS纳米球，尺寸和形貌可控，并作为能量供体；银/碳量子点（Ag/CQDs）的生物相容性好，呈超支状结构，作为能量受体，构建的共振能量转移电致化学发光适配体传感器用于检测农残毒死蜱，背景小，特异性好、灵敏度高。

Description

一种基于共振能量转移的电致化学发光适配体传感器的制备 方法及应用
技术领域
本发明涉及电致化学发光适配体传感器技术领域，特别是涉及一种MoS2/CdS纳米球作为共振能量转移供体，银/碳量子点（Ag/CQDs）作为能量受体的电致化学发光适配体传感器的制备方法及应用，包括毒死蜱电致化学发光适配体传感器的制备步骤、使用该传感器测定毒死蜱的操作方法等；以生物分子辅助合成MoS2/CdS纳米球，尺寸和形貌可控；Ag/CQDs生物相容性好，呈超支状结构，可有效抑制供体发光强度；构建的共振能量转移电致化学发光适配体传感器用于检测农残毒死蜱，背景小，特异性好、灵敏度高。
背景技术
农药残留已成为危害环境和健康的全球问题。毒死蜱由于其广谱性，越来越成为一种广泛使用的有机磷杀虫剂。虽然毒死蜱对病虫害的预防和控制具有非常好的效果，但他们对动物和环境的潜在毒性和污染是不可避免的。由于毒死蜱等有机磷与多种靶酶的快速且不可逆的相互作用，因而对人类具有高毒性。因此，人们越来越致力于开发检测有机磷农药的高性能传感器，为采取措施减少它们对哺乳动物的有害影响提供支持。电致化学发光 (ECL) 是由电化学方法触发的化学发光现象，是化学发光和电化学结合的产物，是一门综合性很强的分析技术。最近，基于共振能量转移策略构建传感器的开发引起越来越多研究者的关注。这种能量转移涉及两个发色团之间的非辐射能量转移，即电子激发的供体发色团通过非辐射偶极子将能量转移到受体。而电致化学发光-共振能量转移(ECL-RET)结合了两者的优点，是一个很具有发展潜力的新领域。它不需要激发光源，背景噪音较小，也避免了散射光的影响，己广泛地应用于生物传感器的构建。由两种有机染料组成的常见的能量转移系统，经常会发生光漂白，光谱串扰和较低纳秒范围内的短荧光寿命的现象。为了解决上述问题，越来越多的纳米材料被纳入共振能量转移的范畴。硫化镉(CdS) 在常温下的禁带宽度约为2.4 eV，稳定性高且制备简单，具有独特的发光性能。众所周知，CdS与其他半导体的复合材料能够有效地改善电致化学发光性能。在众多材料中，二硫化钼 (MoS2) 由于具有高热稳定性和较窄的带隙而受到关注。此外，CdS和MoS2具有相同的六方晶体结构，因而能够得到较为理想的异质结结构的复合材料。
在共振能量转移电致化学发光传感器研究中，能量供受体的选择至关重要，开发新型的电致化学发光供受体成为研究热点。基于CdS/MoS2复合材料作为供体而开发的的共振能量转移电致化学发光传感器已有许多文献报道，大多集中在免疫传感器研究中，而在农残电致化学发光传感器研究中应用较少。而且，在报道的这些传感器中大多使用的是MoS2/CdS纳米片，尺寸不可控。片层结构的MoS2/CdS纳米材料电致发光性能较差，不适于复杂基质痕量农残样品。在共振能量转移电致发光传感器的能量受体选择中，目前多采用纳米金、有机染料及其各种复合物，亟需开发新型能量受体材料。
发明内容
本发明的目的就是针对上述传感器研究中的缺点，构建一种能够用于高灵敏检测农药残留毒死蜱的电致化学发光传感器。本发明要解决的技术问题是以生物分子辅助法，调控MoS2/CdS形貌，制备MoS2/CdS纳米球，改善能量供体的发光性能；通过原位复合碳点与纳米银，合成能量受体Ag/CQDs，碳点与纳米银间强化学键的结合，有利于等离子共振效应的发生，从而促使光的吸收及其能量转化效率的提高。本发明以MoS2/CdS纳米球为电极材料，通过纳米金负载毒死蜱适配体的互补链cDNA；以Ag/CQDs标记毒死蜱适配体apt，构建了基于共振能量转移的电致化学发光适配体传感器，用于检测毒死蜱。由于Ag/CQDs可以猝灭MoS2/CdS发光，使本发明的传感器背景信号较低；当毒死蜱存在时，由于适配体与毒死蜱的强烈作用，破坏了适配体与其互补链形成的双螺旋结构，使Ag/CQDs减少，猝灭作用降低，引起发光信号的增大，而且随着毒死蜱的浓度增大信号增强，本发明也是一种“signal-on”型电化学适配体传感器，检测速度快，灵敏度高，选择性好；传感器制备简捷，使用简便，稳定性、重现性好，无毒，不污染环境，为农残毒死蜱的检测提供了一种可行的新方法。
本发明的技术方案
1.一种基于能量共振转移的毒死蜱电致发光适配体传感器的制备方法及应用，以MoS2/CdS纳米球作为能量供体，银/碳量子点Ag/CQDs作为能量受体，实现对毒死蜱的高灵敏特异性检测。所述MoS2/CdS纳米球，是基于生物分子辅助法合成，呈球形网状结构；所述生物分子是 L-半胱氨酸；所述银/碳量子点Ag/CQDs，呈超支状结构；
2. 所述MoS2/CdS纳米球制备方法如下：
（1）称取0.2156 g柠檬酸钠·二水和0.0848 g L-半胱氨酸溶解在35.0 mL乙二胺中，搅拌30min，得到澄清溶液;
（2）称取0.0128 g钼酸铵·四水和0.128 g醋酸镉·二水加入到上述溶液中，继续搅拌2 h；
（3）转移到高压反应釜中，在真空干燥箱中150 °C反应8 h；
（4）用无水乙醇离心洗涤两次，再用超纯水离心洗涤三次，离心机转速为8000 rpm，离心时间为5 min，洗涤，得MoS2/CdS纳米球，将其分散在5.0 mL超纯水中，存储待用；
3. 所述银/碳量子点Ag/CQDs，制备方法如下：
（1）称取0.8 g柠檬酸钠·二水和6.0 g碳酸氢铵溶解于40.0 mL超纯水中，搅拌溶解；
（2）转移至高压反应釜中，在180 °C反应4 h；
（3）用透析膜透析上述得到的产物，得到粒径均匀的碳量子点CQDs，旋蒸、存储备用；
（4）移取7.0 mL的CQDs溶液，称取0.06 g AgNO3溶解于CQDs的溶液中，在室温下搅拌30min；
（5）称取20.0 mg硼氢化钠注入到上述溶液中，继续搅拌30 min，离心、以超纯水洗涤，得到Ag/CQDs，分散在5 mL超纯水中备用；
4. 基于能量共振转移的毒死蜱电致发光适配体传感器的制备方法如下：
（1）取8.0 μL 、1 mg/mL Au NPs@MoS2/CdS分散液滴涂到处理好的玻碳电极表面，自然晾干得Au NPs@MoS2/CdS/GCE；
（2）将8.0 μL、10-6 mol/L毒死蜱适配体的互补链cDNA滴涂到Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，置于4 °C孵化过夜，用pH 7.4的PBS清洗，得cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE；
（3）滴涂4.0 μL、10 μmol/L 6-巯基己醇 ，封闭非特异性结合位点，在37 °C下孵化60min，再用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗；
（4）将8.0 μL Ag/CQDs-apt滴涂到cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，在37 °C下孵化60min，再用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗，得Ag/CQDs-apt/cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE，置于4 °C存储备用；
5. 技术方案4所述的Au NPs@MoS2/CdS分散液，制备方法如下：
（1）在剧烈搅拌下将1.2 mL、0.1 mol/L冰的硼氢化钠注入到40.0 mL含有0.25 mmol/L柠檬酸钠·二水和0.25 mmol/L HAuCl4的水溶液中，并老化6 h，得Au NPs溶液；
（2）移取6.0 mL Au NPs溶液及260 μL上述MoS2/CdS纳米球溶液，混合搅拌过夜；之后用无水乙醇和超纯水离心洗涤，离心机转速为6000 rpm，离心时间为5 min，得产物Au NPs@MoS2/CdS，产物分散在超纯水中，存储待用；
6. 技术方案4所述的 Ag/CQDs-apt，制备方法如下：
取2.0 mL 上述Ag/CQDs分散液，与50.0 μL、10-7 mol/L毒死蜱适配体apt混合，置于冰箱中孵化过夜，得Ag/CQDs-apt，离心洗涤之后重新分散在3.0 mL超纯水中备用；
7. 毒死蜱检测方法：
（1）在Ag/CQDs-apt/cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，滴涂不同浓度的毒死蜱溶液，37°C下孵化60 min，用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗；
（2）在含有0.1 mol/L K2S2O8、pH 7.4的PBS 缓冲溶液中，以上述孵化了毒死蜱的电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-1.6~0.0 V电位区间内进行循环伏安扫描，光电倍增管800 V，记录得到的光强结果；
（3）检测一系列不同浓度毒死蜱标准溶液孵化后的光强，绘制工作曲线；同时测定传感器线性范围和检测限；
(4) 将待测样品溶液代替毒死蜱标准溶液，按步骤（1）、（2）方法记录光强，根据线性方程计算待测样品中毒死蜱含量。
本发明的有益效果
(1)本发明制备的CdS/MoS2材料，是基于生物分子辅助法合成，呈球形网状结构，且尺寸可控；
(2)CdS/MoS2纳米球比MoS2/CdS纳米片具有更优异的电致发光强度，而且最大发光峰电位正移了约0.35 V；
(3)原位复合制备Ag/CQDs，强化学键的结合，有利于等离子共振效应的发生，从而促使了光的吸收及其能量转化效率的提高，有效降低了传感器背景信号，提高了检测灵敏度；
(4)本发明是一种“signal-on”型电化学适配体传感器，相比“signal-off”型传感器，对毒死蜱更为敏感，检测限更低；
(5)本发明传感器具有背景低，检测速度快，灵敏度高，选择性好特点；可以实现对毒死蜱的简单、快速、高灵敏检测；线性范围为1.0×10-8~1.0×10-15 mol/L，检出限为3.0×10-16mol/L。
附图说明：
图1为不同修饰电极的电位-光强图
其中，1--裸GCE，2--CdS/GCE，3--MoS2/CdS纳米片修饰玻碳电极，4--MoS2/CdS纳米球修饰玻碳电极
图2为不同浓度毒死蜱的电致化学发光强度（A）及线性拟合图（B）
其中，1-8分别代表毒死蜱的浓度为：10-15，10-14，10-13，10-12，10-11，10-10，10-9，10-8 mol/L。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1 MoS2/CdS纳米球制备方法
（1）称取0.2156 g柠檬酸钠·二水和0.0848 g L-半胱氨酸溶解在35.0 mL乙二胺中，搅拌30min，得到澄清溶液;
（2）称取0.0128 g钼酸铵·四水和0.128 g醋酸镉·二水加入到上述溶液中，继续搅拌2 h；
（3）转移到高压反应釜中，在真空干燥箱中150 °C反应8 h；
（4）用无水乙醇离心洗涤两次，再用超纯水离心洗涤三次，离心机转速为8000 rpm，离心时间为5 min，洗涤，得MoS2/CdS纳米球，将其分散在5.0 mL超纯水中，存储待用。
实施例2 银/碳量子点Ag/CQDs制备方法
（1）称取0.8 g柠檬酸钠·二水和6.0 g碳酸氢铵溶解于40.0 mL超纯水中，搅拌溶解；
（2）转移至高压反应釜中，在180 °C反应4 h；
（3）用透析膜透析上述得到的产物，得到粒径均匀的碳量子点CQDs，旋蒸、存储备用；
（4）移取7.0 mL的CQDs溶液，称取0.06 g AgNO3溶解于CQDs的溶液中，在室温下搅拌30min；
（5）称取20.0 mg硼氢化钠注入到上述溶液中，继续搅拌30 min，离心、以超纯水洗涤，得到Ag/CQDs，分散在5 mL超纯水中备用。
实施例3 Au NPs@MoS2/CdS分散液制备方法
（1）Au NPs的制备：在剧烈搅拌下将1.2 mL冰的硼氢化钠 (0.1 mol/L) 注入到40.0mL含有0.25 mmol/L柠檬酸钠·二水和0.25 mmol/L HAuCl4的水溶液中并老化6 h；
（2）Au NPs@MoS2/CdS复合材料的制备：用移液枪移取6.0 mL Au NPs溶液及260 μLMoS2/CdS纳米球溶液，混合搅拌过夜。之后用无水乙醇和超纯水离心洗涤上述材料，离心机转速为6000 rpm，离心时间为5 min，得产物Au NPs@MoS2/CdS，产物分散在超纯水中，存储待用。
实施例4 Ag/CQDs-apt制备方法
取2.0 mL上述Ag/CQDs分散液，与50.0 μL、10-7 mol/L毒死蜱适配体apt混合，置于冰箱中孵化过夜，得Ag/CQDs-apt，离心洗涤之后重新分散在3.0 mL超纯水中备用。
实施例5 基于能量共振转移的毒死蜱电致发光适配体传感器的制备方法
（1）取8.0 μL 、1 mg/mL Au NPs@MoS2/CdS分散液滴涂到处理好的玻碳电极表面，自然晾干得Au NPs@MoS2/CdS/GCE；
（2）将8.0 μL、10-6 mol/L毒死蜱适配体的互补链cDNA滴涂到Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，置于4 °C孵化过夜，用pH 7.4的PBS清洗，得cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE；
（3）滴涂4.0 μL、10 μmol/L 6-巯基己醇 ，封闭非特异性结合位点，在37 °C下孵化60min，再用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗；
（4）将8.0 μL Ag/CQDs-apt滴涂到cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，在37 °C下孵化60min，再用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗，得Ag/CQDs-apt/cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE，置于4 °C存储备用。
实施例6 毒死蜱的检测
（1）在Ag/CQDs-apt/cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，滴涂不同浓度的毒死蜱标准溶液，37 °C下孵化60 min，用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗；
（2）在含有0.1 mol/L K2S2O8、pH 7.4的PBS 缓冲溶液中，以上述孵化了毒死蜱的电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，通过MPI-B型多参数化学发光分析测试系统，在-1.6~0.0 V电位区间内进行循环伏安扫描，光电倍增管800 V，记录得到的光强结果；
（3）检测一系列不同浓度毒死蜱标准溶液孵化后的光强，绘制工作曲线；同时测定传感器线性范围和检测限；结果表明，电致化学发光强度与毒死蜱浓度的对数呈正相关，线性方程为I=18403+893lgc，相关系数r=0.9936，线性范围为1.0×10-8 ~ 1.0×10-15 mol/L，检测限为3.0×10-16 mol/L；
(4) 将待测样品溶液代替毒死蜱标准溶液，按步骤（1）、（2）方法记录光强，根据线性方程计算待测样品中毒死蜱含量。
实施例7 MoS2/CdS纳米球与MoS2/CdS纳米片发光性能对比
制备了不同修饰玻碳电极，考察了各电极的发光性能；图1为不同修饰玻碳电极的电位-光强图；由曲线1可知，裸电极的电致化学发光响应非常低，对于纯CdS来说，电致化学发光响应明显增大约为7990 a.u.(曲线2) ，说明CdS具有优异的电致化学发光性能；相同掺杂比例下不同形貌的MoS2/CdS复合材料的电致化学发光性能研究表明，MoS2/CdS纳米球(曲线4) 比其纳米片(曲线3)最大发光峰电位正移了约0.35 V，发光强度更大；说明合成的MoS2/CdS纳米球的电致化学发光性能更优异。
实施例8 毒死蜱电致化学发光传感器使用条件的优化
为了得到毒死蜱检测的最佳性能，本文通过改变检测底液的pH、毒死蜱孵化时间及过硫酸钾的浓度，从中筛选出最优条件；实验结果表明，当检测底液的pH小于7.4时，电致发光强度随着pH的增加而增大，而当pH大于7.4时，光强随着pH的增大而减小；当pH为7.4时，此时的电致发光强度达到最大；当毒死蜱孵化时间为60 min时，电致化学发光强度达到最大值；当孵化时间大于60 min时，光强的变化非常微小，几乎保持平稳；随着过硫酸钾浓度的增大，电致化学发光强度逐渐增大；当过硫酸钾的浓度大于0.10 mol/L时，电致化学发光强度趋于稳定；最佳实验条件如下：过硫酸钾浓度为0.10 mol/L，毒死蜱孵化时间为60 min，pH为7.4。
实施例9 毒死蜱电致化学发光传感器的重现性、选择性和稳定性
对毒死蜱浓度为0.10 ng/mL的七根修饰电极做了平行实验，相对标准偏差为4.07%；以甲基对硫磷、多菌灵、氯氰菊酯、啶虫脒为干扰物质，测量了含0.10 ng/mL毒死蜱和10.0ng/mL各种干扰物质的光强；结果表明，相对于未滴涂农药时，其他农药孵化后电极的电致化学发光强度几乎没有变化；当存在毒死蜱时，发光强度升高，毒死蜱与其它农药的混合液与只含有毒死蜱的发光强度近似相同；将制备的传感器置于4 °C 放置15天，测得的光强为初始光强的92%；上述结果表明本发明传感器具有较好的重现性、选择性和稳定性。

Claims (9)

1.一种基于共振能量转移的毒死蜱电致化学发光适配体传感器的制备方法及应用，其特征在于，以MoS2/CdS纳米球作为能量供体，银/碳量子点Ag/CQDs作为能量受体，实现对毒死蜱的高灵敏特异性检测。
2.权利要求1所述的基于共振能量转移的传感器制备方法，其特征在于，所述MoS2/CdS纳米球是基于生物分子辅助法合成，呈球形网状结构；所述生物分子是 L-半胱氨酸；所述银/碳量子点Ag/CQDs呈超支状结构，并用来标记毒死蜱适配体。
3.权利要求1-2任一项所述的MoS2/CdS纳米球，其特征在于，其制备方法如下：
称取0.2156 g柠檬酸钠·二水和0.0848 g L-半胱氨酸溶解在35.0 mL乙二胺中，搅拌30min，得到澄清溶液;
称取0.0128 g钼酸铵·四水和0.128 g醋酸镉·二水加入到上述溶液中，继续搅拌2h；
转移到高压反应釜中，在真空干燥箱中150 °C反应8 h；
用无水乙醇离心洗涤两次，再用超纯水离心洗涤三次，离心机转速为8000 rpm，离心时间为5 min，洗涤，得MoS2/CdS纳米球，将其分散在5.0 mL超纯水中，存储待用。
4.权利要求1-2任一项所述的银/碳量子点Ag/CQDs，其特征在于，其制备方法如下：
称取0.8 g柠檬酸钠·二水和6.0 g碳酸氢铵溶解于40.0 mL超纯水中，搅拌溶解；
转移至高压反应釜中，在180 °C反应4 h；
用透析膜透析上述得到的产物，得到粒径均匀的碳量子点CQDs，旋蒸、存储备用；
移取7.0 mL的CQDs溶液，称取0.06 g AgNO3溶解于CQDs的溶液中，在室温下搅拌30min；
称取20.0 mg硼氢化钠注入到上述溶液中，继续搅拌30 min，离心、以超纯水洗涤，得到Ag/CQDs，分散在5 mL超纯水中备用。
5.权利要求1-2任一项所述的一种基于共振能量转移的毒死蜱电致化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
取8.0 μL 、1 mg/mL Au NPs@MoS2/CdS分散液滴涂到处理好的玻碳电极表面，自然晾干得Au NPs@MoS2/CdS/GCE；
将8.0 μL、10-6 mol/L毒死蜱适配体的互补链cDNA滴涂到Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，置于4 °C孵化过夜，用pH 7.4的PBS清洗，得cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE；
滴涂4.0 μL、10 μmol/L 6-巯基己醇 ，封闭非特异性结合位点，在37 °C下孵化60min，再用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗；
将8.0 μL Ag/CQDs-apt滴涂到cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，在37 °C下孵化60min，再用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗，得Ag/CQDs-apt/cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE，置于4 °C存储备用。
6.权利要求5所述 Au NPs@MoS2/CdS分散液，其特征在于，制备方法如下：
在剧烈搅拌下将1.2 mL、0.1 mol/L冰的硼氢化钠注入到40.0 mL含有0.25 mmol/L柠檬酸钠·二水和0.25 mmol/L HAuCl4的水溶液中，并老化6 h，得Au NPs溶液；
移取6.0 mL Au NPs溶液及260 μL权利要求3所述的MoS2/CdS纳米球溶液，混合搅拌过夜；之后用无水乙醇和超纯水离心洗涤，离心机转速为6000 rpm，离心时间为5 min，得产物Au NPs@MoS2/CdS，产物分散在超纯水中，存储待用。
7.权利要求5所述 Ag/CQDs-apt，其特征在于，制备方法如下：
取2.0 mL 权利要求4所述的Ag/CQDs分散液，与50.0 μL、10-7 mol/L毒死蜱适配体apt混合，置于冰箱中孵化过夜，得Ag/CQDs-apt，离心洗涤之后重新分散在3.0 mL超纯水中备用。
8.权利要求1-2、5任一项所述的电致化学发光适配体传感器用于检测毒死蜱。
9.根据权利要求8所述的检测毒死蜱，其特征在于，步骤如下：
在Ag/CQDs-apt/cDNA/Au NPs@MoS2/CdS/GCE表面，滴涂不同浓度的毒死蜱溶液，37 °C下孵化60 min，用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗；
在含有0.1 mol/L K2S2O8、pH 7.4的PBS 缓冲溶液中，以上述孵化了毒死蜱的电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-1.6~0.0 V电位区间内进行循环伏安扫描，光电倍增管800 V，记录得到的光强结果。
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