CN111671901A - 一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂 - Google Patents

一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂 Download PDF

Info

Publication number
CN111671901A
CN111671901A CN202010613124.2A CN202010613124A CN111671901A CN 111671901 A CN111671901 A CN 111671901A CN 202010613124 A CN202010613124 A CN 202010613124A CN 111671901 A CN111671901 A CN 111671901A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bsa
mos2
nanosheet
apt
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010613124.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111671901B (zh
Inventor
金丽虹
申炳俊
高芳芳
陈甲琦
逄博
杨惠茹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changchun University of Science and Technology
Original Assignee
Changchun University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changchun University of Science and Technology filed Critical Changchun University of Science and Technology
Priority to CN202010613124.2A priority Critical patent/CN111671901B/zh
Publication of CN111671901A publication Critical patent/CN111671901A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111671901B publication Critical patent/CN111671901B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G39/00—Compounds of molybdenum
    • C01G39/06—Sulfides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2002/00—Crystal-structural characteristics
    • C01P2002/70—Crystal-structural characteristics defined by measured X-ray, neutron or electron diffraction data
    • C01P2002/72—Crystal-structural characteristics defined by measured X-ray, neutron or electron diffraction data by d-values or two theta-values, e.g. as X-ray diagram
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2002/00—Crystal-structural characteristics
    • C01P2002/80—Crystal-structural characteristics defined by measured data other than those specified in group C01P2002/70
    • C01P2002/82—Crystal-structural characteristics defined by measured data other than those specified in group C01P2002/70 by IR- or Raman-data
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2002/00—Crystal-structural characteristics
    • C01P2002/80—Crystal-structural characteristics defined by measured data other than those specified in group C01P2002/70
    • C01P2002/84—Crystal-structural characteristics defined by measured data other than those specified in group C01P2002/70 by UV- or VIS- data
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/01—Particle morphology depicted by an image
    • C01P2004/04—Particle morphology depicted by an image obtained by TEM, STEM, STM or AFM
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂，本发明构建一种具有靶向性的二硫化钼纳米片光热治疗系统，其特征在于：所述功能化二硫化钼纳米片MoS2‑BSA‑Apt的尺寸直径范围在80‑120nm，所述功能化二硫化钼纳米片中MoS2的尺寸为10nm；所述的功能化二硫化钼纳米片在红外光照射下有优异的光热效应；所述功能化二硫化钼纳米片具有特异性识别肿瘤细胞的能力，可以在肿瘤细胞周围富集并被移动到靶细胞内，本发明的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂具有优异的生物相容性，稳定性，光热转换效率高，合成简单，成本低，低毒性，代谢率高，具有靶向性可以精准高效治疗肿瘤的一种优异的光热治疗材料。

Description

一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂
技术领域
本发明涉及一种具有靶向识别的纳米片光热剂，具体是一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂。
背景技术
癌症是一种严重威胁人类健康与生命的致死性疾病，为当前社会面临重大公共卫生问题之一。迄今为止，已有一百多种癌症被相继发现，临床上针对不同癌症的发展和进展会采取相应治疗手段。癌症临床治疗手段主要包括化疗、放疗和手术治疗等。化疗和放疗存在非选择性损伤机体正常组织问题，在消除肿瘤细胞同时，还会给患者带来较大的副作用。对于一些紧邻人体重要器官的肿瘤，通过手术切除肿瘤，往往会在一定程度上破坏脏器。而且在很多情况下，肿瘤组织很难通过手术切底切除，这将导致肿瘤复发。因此，发展具有副作用小、操作简便和精准治疗方法，这对于癌症临床治疗具有重要意义。
近年来，光热治疗因其具有治疗时间短、操作简便、治疗效果明显、确度高、副作用小和患者治疗痛苦小等优点，使其在众多癌症新型治疗方法中脱颖而出。光热治疗(hotothermaltherapy)是将具有较高光热转换效率的光热材料注射入人体内，在外部光源(一般是近红外光)照射下，光热材料将光能转化为热能进而杀死癌细胞的一种治疗方法。目前，研究较为广泛的光热材料主要包括贵金属纳米粒子、有机纳米光热转换材料、碳基光热转换材料、金属硫族化合物纳米材料以及量子点等类型。以SiO2为核的金纳米壳材料已于2008年进入了临床研究，目前面临失败风险。碳纳米管和石墨烯等碳材料具有良好的光热转化效率，但多数碳材料较强疏水性令其生物相容性较差，由于在体内很难降解，所以该光热材料存在体内滞留进而引发中毒危险。二硫化钼是过渡金属硫化物中被研究最多的光热材料之一，其独特的带隙宽度、近红外吸收、光热转换能力和良好的生物相容性，使二硫化钼在肿瘤光热治疗领域具有潜在应用前景。然而，高特异性识别靶细胞，将二硫化钼纳米片有效地富集于肿瘤组织周围并被移动至靶细胞内，降低纳米材料潜在毒性，这仍然是肿瘤光热治疗研究和临床转化需要解决的关键问题。
核酸适配体(Aptamer)是指一类可以与靶标特异性结合的寡核苷酸序列。1990年，核酸适配体的出现，特别是以肿瘤全细胞或细胞膜表面特定蛋白为靶标筛选获得的核酸适配体为癌症早期诊断和疾病治疗提供了一种全新的思路和有效工具。研究表明，核酸适配体在细胞成像、分子生物学、肿瘤疾病的诊治、识别分子探针等方面有广泛的应用前景。在众多靶向分子中，核酸适配体的高亲和力、高特异性识别靶细胞特性，极大的推动了肿瘤光热治疗靶向探针的设计和构建。
综上所述，开发具有靶向识别、高生物相容性、低毒性和光热效应的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片，这在癌症精准治疗领域有广泛应用前景。
现有需要解决的技术难题：
1.减小核酸适配体修饰二硫化钼纳米片中二硫化钼尺寸，提高其生物相容性和生物安全性是二硫化钼光热剂用于肿瘤光热治疗关键问题之一。
2.二硫化钼纳米片高特异性、高亲和力识别靶细胞、能有效富集于肿瘤组织周围并进入肿瘤细胞内，这是二硫化钼精准光热治疗关键问题之二。
本发明从上述技术难题入手，通过二硫化钼纳米片吸附牛血清白蛋白以提高其生物相容性，将二硫化钼纳米片尺寸控制在10nm以降低其生物毒性。利用核酸适配体靶向识别乳腺癌细胞的特性，使核酸适配体修饰的二硫化钼纳米片经血液循环有效富集于肿瘤组织周围并进入肿瘤细胞内。
因此，本发明提供了一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的功能化二硫化钼纳米片的制备方法，包括：
(1)将钼酸钠，L-半胱氨酸分别溶于超纯水中，将L-半胱氨酸溶液、一定量剥离剂葡萄糖依次加入到钼酸钠溶液中，超声10min后，200℃水热反应，离心得到二硫化钼纳米片；通过葡萄糖辅助一步水热法合成MoS2纳米片，其中钼酸钠，L-半胱氨酸质量比为1：2；
(2)将步骤(1)合成的MoS2纳米片与BSA按质量比例3:1在溶液中充分混合后，冰浴超声或室温搅拌3h后，4℃、12000rpm条件下离心30min，获得表面修饰牛血清白蛋白(BSA)二硫化钼纳米片；
(3)取EDC(500μl，500mM)和NHS(500μl，100mM)对步骤(2)得到的MoS2-BSA表面末端游离羧基进行活化，将1mLMoS2-BSA与EDC和NHS于室温下反应0.5h，超滤离心，去离子水洗涤，得到活化MoS2-BSA纳米片；将核酸适配体(Apt，5’-NH2-AGGAGCACGACTCTGACGTAGGATCGAGACGAGGTACGTAT-3’)85℃变性10min，随即冰浴10min复性；活化MoS2-BSA与核酸适配体冰浴震荡反应5h，之后超滤离心直至超滤液中检测不到适配体，最终得到核酸适配体修饰的MoS2-BSA-Apt纳米片。
作为本发明专利进一步的方案，所述功能化MoS2-BSA-Apt纳米片的尺寸在80-120nm，功能化二硫化钼纳米片中MoS2的尺寸为10nm。
作为本发明专利再进一步的方案，所述步骤(1)中葡萄糖剥离剂为6.25mg或62.5mg，反应时间为10h、24h或36h；
作为本发明专利再进一步的方案，所述步骤(2)中冰浴超声时间为2h或4h，频率为25HZ或45HZ，室温搅拌0h或3h；
作为本发明专利再进一步的方案，本发明提供一种上述的功能化二硫化钼纳米片光热剂的细胞毒性、体外肿瘤光热和光动力性能的测定。该功能化二硫化钼纳米片细胞毒性、体外肿瘤光热性能、线粒体膜电位、细胞内外单线态氧测定方法具体包括如下步骤：
(1)将接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分组，加入不同浓度MoS2-BSA纳米片培养液，CO2培养箱中孵育24h，加入20μL MTT溶液，继续孵育4h，吸出培养液，再加入200μL DMSO，避光条件下，将其转移至酶标仪中测量每孔570nm下吸光度，记录细胞存活率，考察MoS2-BSA体外细胞毒性；MTT法测量MoS2-BSA-Apt纳米片体外细胞毒性过程同MoS2-BSA纳米片；
(2)将接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分为对照组、激光照射组、MoS2-BSA纳米片培养组、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组，MoS2-BSA纳米片加激光照射5min组、MoS2-BSA纳米片加激光照射10min组，MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射5min组、MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射10min组；细胞贴壁生长后，相应组别加入含有MoS2-BSA纳米片或MoS2-BSA-Apt纳米片培养液，CO2培养箱中孵育10h，吸出培养液，用PBS轻缓冲洗两次，激光照射组加入200μl培养液后，激光照射5min或10min，激光照射结束后，吸出培养液并用PBS清洗，加入200μl钙黄绿素-PI染料继续孵育20min，吸出液体后用PBS清洗，荧光显微镜记录细胞荧光图像；钙黄绿素-PI染料鉴别对照组、MoS2-BSA纳米片培养组和MoS2-BSA-Apt纳米片培养组活死细胞过程同激光照射组；
(3)将接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分四组，即对照组、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组、激光照射组、MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射组；相应培养液孵育细胞12h后，吸出培养液用PBS清洗，激光照组激光照射结束后，吸出培养液，再次用PBS清洗，加入100μlJC-1染料，在CO2培养箱中继续孵育20min，PBS清洗两次，荧光显微镜记录细胞荧光图像。JC-1染料法通过细胞膜电位变化获得非激光照射组细胞损伤程度过程同激光照射组；
(4)避光条件下将相同浓度MoS2-BSA纳米片溶液分别置于样本和参比石英比色皿中，423nm处调0；样本比色皿中加入DPBF溶液，参比比色皿中加入同体积PBS溶液，测定423nm处吸光度；808nm激光照射样本比色皿溶液后，分别在5、10、20、40和60min时测量A423nm，记录MoS2-BSA纳米片细胞外产生单线态氧数值；另外，样本和参比比色皿中均无MoS2-BSA时，测量激光照射DPBF溶液期间A423nm变化情况；
(5)接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分为五组：对照组、激光照射组、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组、阳性对照组和MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射组，细胞贴壁孔板内分别加入不含或含有MoS2-BSA-Apt纳米片溶液培养液，孵育2h，阳性对照组加入200μL H2O2继续孵育0.5h，激光照射组和MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射组均用808nm激光照射10min；各组吸出培养液并用PBS轻缓冲洗两遍，H2DCFDA探针染色，荧光显微镜下记录细胞荧光图像，获得细胞内MoS2-BSA-Apt纳米片产生单线态氧信息。
作为本发明专利再进一步的方案，本发明还提供一种上述的功能化二硫化钼纳米片在荷瘤裸鼠体内肿瘤光热治疗中的应用。该功能化二硫化钼纳米片可用于肿瘤光热治疗的方法具体包括如下步骤：
(1)将生长状态良好且处于对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞进行消化，离心后用无血清培养液配制成细胞悬液，将MCF-7人乳腺癌细胞皮下注射到5周龄雌性裸鼠右上肢腋上处，构建人乳腺癌荷瘤裸鼠模型。
(2)当肿瘤体积达到200mm3时，将携带有皮下MCF-7人乳腺癌的荷瘤裸鼠随机分组：对照组、激光照射组、瘤内注射MoS2-BSA纳米片组、尾静脉注射MoS2-BSA-Apt纳米片组，瘤内注射MoS2-BSA纳米片加激光照射5min和10min组，尾静脉注射MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射5min和10min组；瘤内注射MoS2-BSA纳米溶液2h或尾静脉注射MoS2-BSA-Apt纳米片溶液24h后，荷瘤裸鼠肿瘤处开始进行激光照射，每天光热治疗后，记录荷瘤裸鼠体重和肿瘤体积大小，评价功能化二硫化钼纳米片光热治疗效果。
(3)光热治疗两周后，将裸鼠处死。各组裸鼠主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤组织均采用4％多聚甲醛固定，经水洗、脱水、透明和浸蜡步骤后，用石蜡密封，利用切片机对裸鼠主要器官和肿瘤进行切片，苏木精-伊红(H&E)染色后，在显微镜下观察切片组织细胞形态，进一步评估功能化二硫化钼纳米片生物毒性及光热治疗效果。
(4)雌性裸鼠随机分为MoS2-BSA纳米片组和MoS2-BSA-Apt纳米片组，两种功能化二硫化钼纳米片溶液均通过尾静脉注射方式进行给药，注射后1小时、24小时和第7天时，分别处死不同组裸鼠，利用ICP-OES(Optima8300)法测定裸鼠主要器官(心，肝，脾，肺，肾)Mo元素含量，分析MoS2在裸鼠内代谢途径，进一步评估功能化二硫化钼纳米片生物安全性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)一步水热法合成二硫化钼纳米片最佳条件为：0.25g钼酸钠、0.5g半胱氨酸、62.5mg葡萄糖剥离剂、pH6.5、200℃水热反应24h，合成的二硫化钼纳米片粒径为10～50nm。
(2)BSA辅助超声剥离及偶联MoS2纳米片超声最佳条件为：频率45HZ、超声2h，构建表面吸附BSA的MoS2-BSA纳米片；通过EDC/NHS化学交联法将核酸适配体偶联到MoS2-BSA纳米片上，构建MoS2-BSA-Apt纳米片；两种功能性二硫化钼纳米片中MoS2粒径约为10nm，MoS2-BSA-Apt纳米片中MoS2含量低于MoS2-BSA纳米片。
(3)TMD、THTMD、XRD、傅里叶变换红外光谱、紫外-可见-近红外光谱结果均表明，本专利成功构建了MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt两种功能化二硫化钼纳米片；Zata电位和悬浮稳定性实验指出，负电位是功能化二硫化钼纳米片在溶液中稳定存在因素。
(4)MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt两种功能化二硫化钼纳米片均具有近红外吸收特性和较好的光热效应，经0.8W·cm-2808nm激光照射280s后，0.2mg/mLMoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt溶液温度分别升高为45℃和43℃。
(5)MoS2-BSA纳米片和MoS2-BSA-Apt纳米片浓度在1～200μg·mL-1范围，两种功能化二硫化钼纳米片均对细胞没有明显的毒性；浓度为100μg·mL-1时，功能化二硫化钼纳米片光热温升即可满足光热治疗要求。
(6)两种功能化二硫化钼纳米片对体外培养的MCF-7人乳腺癌细胞均表现处良好的光热效应，但存在差异；MoS2-BSA纳米片无特异性识别靶细胞性能，仅能存在于靶细胞外，光热治疗过程MoS2-BSA纳米片可在细胞外产生单线态氧；MoS2-BSA-Apt纳米片能特异性识别靶细胞并被移动到细胞内，光热治疗过程细胞内有单线态氧产生和细胞线粒体受损，可引起肿瘤细胞迅速凋亡。
(7)MoS2-BSA纳米片和MoS2-BSA-Apt纳米片分别在细胞外和细胞内产生丰富单线态氧，令肿瘤细胞产生氧化应激反应产生氧自由基，进而引发肿瘤细胞凋亡。
(8)808nm激光对瘤内注射MoS2-BSA纳米片溶液、尾静脉注射MoS2-BSA-Apt纳米片溶液两种给药方式的荷瘤裸鼠乳腺癌肿瘤均具有光热治疗作用，但光热效果存在差异；光热治疗十四天后，瘤内注射MoS2-BSA组裸鼠乳癌肿瘤生长虽得到抑制但没有完全消失，有复发倾向，尾静脉注射MoS2-BSA-Apt组裸鼠乳癌肿瘤全部消失，这与体外肿瘤细胞光热实验结果一致。
(9)两种功能化二硫化钼纳米片体内光热治疗荷瘤裸鼠过程中，其体重均稳步增加；MoS2纳米片对裸鼠心、肝、脾、肺、肾五个主要脏器组织影响不大，体内代谢脏器主要为肝脏和脾脏，尾静脉注射7天后功能化MoS2纳米片基本被代谢出体外；MoS2-BSA-Apt纳米片中二硫化钼含量低于MoS2-BSA纳米片，直接导致MoS2-BSA-Apt组裸鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)Mo元素含量均低于MoS2-BSA组；MoS2-BSA-Apt纳米片是一种安全的光热治疗剂。
综上所述，本发明的具有靶向识别的核酸适配体修饰化二硫化钼纳米片光热剂是一种具有优异的生物相容性，稳定性，光热转换效率高，合成简单，成本低，低毒性，代谢率高，具有靶向性可以精准高效治疗肿瘤的一种优异的光热治疗材料。
附图说明
图1为MoS2-BSA纳米片溶液被808nm激光照射期间的温升变化图。
图2为MoS2修饰BSA、BSA-Apt后紫外-可见吸收光谱图。
图3为MoS2-BSA-Apt、MOS2-BSA、MoS2和BSA傅里叶变换红外光谱图。
图4为不同浓度MoS2-BSA、MoS2-BSA-Apt溶液光热效应图。
图5为MoS2-BSA、MoS2-BSA-Apt升温-降温稳定性图。
图6为MoS2形貌和晶格表征TEM和THTEM图。
图7为MoS2-BSA形貌和晶格表征TEM和THTEM图。
图8为MoS2-BSA-Apt形貌和晶格表征TEM和THTEM图。
图9为MoS2-BSA-Apt、MoS2-BSA、MoS2纳米片X射线衍射(XRD)图。
图10为MoS2-BSA-Apt、MoS2-BSA、MoS2纳米片zeta电位图。
图11为MoS2-BSA-Apt、MoS2-BSA、MoS2纳米片溶液悬浮稳定性图。
图12为MoS2-BSA-Apt2孵育MCF-10A人乳腺细胞和MCF-7人乳腺癌细胞荧光成像图。
图13为实施例4中步骤(2)中MoS2-BSA-Apt、MoS2-BSA体外细胞毒性结果图。
图14为实施例4中步骤(3)中MoS2-BSA-Apt、MoS2-BSA体外细胞光热治疗效果图。
图15为实施例4中步骤(4)中MoS2-BSA-Apt体外细胞线粒体膜电位图。
图16为实施例4中步骤(5)DPBF加入MoS2-BSA前后423nm处吸光度变化情况图。
图17为实施例4中步骤(6)MCF-7人乳腺癌细胞内单线态氧检测图。
图18为MCF-7人乳腺癌荷瘤裸鼠模型图。
图19为荷瘤裸鼠乳腺癌肿瘤体内光热治疗效果图。
图20为荷瘤裸鼠光热治疗过程乳腺癌肿瘤变化图。
图21为荷瘤裸鼠光热治疗过程乳腺癌肿瘤大小及体重变化情况图。
图22为荷瘤裸鼠光热治疗过程心、肝、脾、肺、肾主要脏器组织切片图。
图23为MoS2-BSA-Apt和MoS2-BSA纳米片Mo元素在裸鼠主要器官中分布图。
图24为葡萄糖辅助一步水热法合成二硫化钼纳米实验条件图。
图25为二硫化钼纳米片表面修饰牛血清白蛋白实验条件图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：MOS2-BSA合成条件优化研及光热性能究
(1)0.25g钼酸钠溶解于25mL超纯水，超声振荡5min后，用0.1mol·L-1HCl将溶液pH调至6.5；0.5g半胱氨酸用超纯水溶解、定容至50mL，获得半胱氨酸溶液。将半胱氨酸溶液、一定量剥离剂葡萄糖依次缓慢加入到钼酸钠溶液中，超声振荡后，将混合液转移至水热反应釜中；200℃下水热反应一定时间，一步水热法合成的二硫化钼自然降至室温，12000rpm离心30min，收集的上清液即为二硫化钼纳米片；冷冻干燥12h，获得二硫化钼纳米片固体。合成二硫化钼纳米片时，水热时间、葡萄糖质量及合成条件标识表示方式具体实验条件见图24。
(2)MoS2纳米片与BSA按质量比例3:1在溶液中充分混合后，冰浴超声或室温搅拌3h后，于4℃、12000rpm条件下离心30min，获得表面修饰牛血清白蛋白(BSA)二硫化钼纳米片，45个合成条件下获得的MoS2-BSA光热效应均高于水溶液对照组，0.8W·cm-2的808nm激光照射温升满足光热治疗温升20℃的MoS2-BSA的14个合成条件列于图25。
图1为14个合成条件下获得的MoS2-BSA纳米片溶液被激光(808nm，0.8W·cm-2)照射期间温升情况。水溶液、不同实验条件获得的MoS2-BSA纳米片溶液被激光照射后，其温度均有一定升高，但温升幅度有较大差异。其中，MoS2-BSA纳米片温升最高组温度升至63.18℃，温度升高幅度为43.18℃。结果表明，2/24/45/2/0水热合成和构建条件下获得的MoS2-BSA光热效应最大，其最佳制备条件为：葡萄糖辅助一步水热法合成MoS2、构建MoS2-BSA时加入62.5mg葡萄糖，200℃下水热24h，偶联BSA条件为超声45Hz、冰浴超声2h。说明MoS2-BSA可以将808nm近红外光转化为局部高热，进而为肿瘤光热治疗奠定了基础。
对本实施例制得的MoS2-BSA产物进行表征证，其中MoS2修饰BSA前后的吸收光谱如图2(a)所示，可见MoS2-BSA的紫外图谱出现了BSA的特征峰，表明BSA被修饰到MoS2上。
MoS2-BSA、MoS2、BSA傅里叶变换红外光谱如图3所示。可以看出，1519cm-1处C-N伸缩振动峰，1656cm-1处C＝O伸缩振动峰，2947cm-1处C-H伸缩振动峰，3296cm-1处N-H伸缩振动峰，这些红外特性峰均与BSA官能团的红外特征峰相吻合，这进一步表明MoS2纳米片表面成功包裹上BSA。
进一步获得此合成条件下不同浓度MoS2-BSA纳米片溶液光热效应，如图4(a)所示，不同浓度MoS2-BSA溶液温度均随激光照射时间增加而升高，浓度越大其温升速度越快，温度升高幅度越大，温升幅度均高于对照组；当2/24/45/2/0型MoS2-BSA溶液浓度为0.025mg·mL-1时，激光照射5min可使溶液温度迅速升高20℃，此时已经可以满足光热治疗所需要的最低温度(临界温度)。MoS2-BSA纳米片溶液升温-降温稳定性能如图5(a)所示，每次循环几乎都能升高至前一次温升幅度，说明2/24/45/2/0型MoS2-BSA具有良好的升温-降温循环稳定性。
实施例2：MoS2-BSA偶联核酸适配体及光热效应研究
(1)取EDC(500μl，500mM)和NHS(500μl，100mM)对实施例1中得到的MoS2-BSA表面末端游离羧基进行活化，将1mLMoS2-BSA与EDC和NHS于室温下反应半小时，超滤离心，去离子水洗涤，得到活化的MoS2-BSA片；将核酸适配体(Apt，5’-NH2-AGGAGCACGACTCTGACGTAGGATCGAGACGAGGTACGTAT-3’)85℃变性10min，随即冰浴10min复性；活化的MoS2-BSA片与核酸适配体冰浴震荡反应5h，之后4000rpm超滤离心，直至超滤液中检测不到适配体，最终得到适配体修饰的MoS2-BSA-Apt纳米片。
对本实施例制得的产物进行表征，其中MoS2修饰BSA、Apt后的吸收光谱如图2(b)所示，MoS2-BSA-Apt纳米片吸收光谱在260nm和280nm处分别出现了核酸和蛋白质特征峰，并且上清液中没有检测到此特征峰，表明Apt成功偶联到MoS2-BSA纳米片上。
MoS2-BSA-Apt傅里叶变换红外光谱测如图3所示。MoS2-BSA偶联Apt后，其傅里叶红外光谱1678cm-1处出现C＝O及N-H伸缩振动。另外，MoS2-BSA-Apt存在1069cm-1核酸适配体磷酸基团中磷酸根的不称伸缩振动。因此，本专利成功构建MoS2-BSA-Apt纳米片。
不同浓度MoS2-BSA-Apt纳米片溶液光热效应如图4(b)所示，可见MoS2-BSA-Apt纳米片浓度越大，激光照射温升速度越快，温度升高幅度越大，而且温度升高幅度均高于对照组；当MoS2-BSA-Apt浓度为0.025mg·mL-1时，激光照射5min可使溶液迅速升高17℃,，MoS2-BSA-Apt纳米片具有良好的光热性能。MoS2-BSA-Apt纳米片升温-降温稳定性能如图5(b)所示，每个循环都能升高至前一次温升幅度，说明MoS2-BSA-Apt具有良好的升温-降温循环稳定性。
实施例3：功能化二硫化钼纳米片表征
对实施例1，2中制得的MoS2，MoS2-BSA，MoS2-BSA-Apt通过透射电子显微镜(TEM)、高分辨透射电子显微镜(HRTEM)，X射线衍射能谱(XRD)与zeta电位进行表征。
对实施1，2制得的MoS2，MoS2-BSA，MoS2-BSA-Apt纳米片进行形貌表征，TEM结果如图6，7，8所示。图6可以看出MoS2钠米片尺寸约在10nm～50nm，晶格间距大约为0.62nm，与文献(Liu Q,PuZH,Abdullah M.Asiri,etal.One-step solvothermal synthesis of MoS2/TiO2 nanocomposites with enhanced photocatalytic H2 production[J].NanopartRes,2013,15:2057)报道的六角形MoS2的(002)晶面吻合。图7MoS2-BSA钠米片的BSA表面存在一些圆形MoS2黑斑点，大小约10nm。图8MoS2-BSA-Apt钠米片形态规律性不强，但总体与MoS2-BSA钠米片长条形比较相似，其纵向尺寸更小，说明核酸适配体减少了BSA聚集，MoS2-BSA-Apt钠米片中MoS2大小约10nm。MoS2-BSA钠米片和MoS2-BSA-Apt钠米片中MoS2尺寸较均匀，约10nm。
MoS2、MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt纳米片X射线衍射(XRD)如图9所示。可以看出，三种二硫化钼纳米片的主要衍射峰均在40o和58o，此外，在43o附近还有一个小的凸起。与JCPDS标准卡片(编号73-1508)比对可知，40o处对应二硫化钼(103)晶面，而58o处对应二硫化钼(110)晶面，由此可知，MoS2与BSA、BSA-Apt连接后并未改变二硫化钼物相，功能化二硫化钼纳米片产物为六方相二硫化钼。这与高分辨透射电镜结果是一致。
zeta电位如图10所示，可知MoS2连接BSA、BSA-Apt前后其在溶液中的Zeta电位值分别为-33.26±0.2mV、-42.36±0.2mV和-43.16±0.2mV。与BSA、BSA-Apt连接后MoS2纳米片zeta电位绝对值逐渐增大，表明MoS2纳米片表面修饰BSA和BSA-Apt后，其在溶液中稳定性增大。由此可见，MoS2纳米片和功能化MoS2纳米片均能在溶液中稳定存在。另外，MoS2纳米片功能化前后其Zeta电位负电位变大，这也间接说明BSA和BSA-Apt均被成功修饰偶联到了MoS2上。
溶液悬浮稳定性测试结果见图11(a)～(d)。MoS2纳米片与MoS2-BSA纳米片相比，其在PBS和DMEM中均有部分沉淀，MoS2-BSA纳米片几乎无沉淀，说明MoS2纳米片被BSA包裹后增加了稳定性；修饰核酸适配体后MoS2-BSA的稳定性并没有较大的改变，MoS2-BSA-Apt也具有良好的溶液稳定性。这与Zeta电位结果一致。
实施例4：功能化二硫化钼纳米片细胞毒性及体外肿瘤光热性能研究
(1)取对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞和MCF-10A人乳腺细胞进行消化、计数后，细胞密度调整为1×105个/mL，将其接种于无菌96孔板中。隔日细胞贴壁情况良好且长满孔底90％时，用PBS溶液清洗细胞后，加入200μL含有0.1mg·mL-1的MoS2-BSA-Apt2(此处APT修饰了荧光基团表示为APT2，5’-NH2-AGGAGCACGACTCTGACGTAGGATCGAGACGAGGTACGTAT-3’FAM)溶液，冰上孵育半个小时后，用200μLPBS溶液洗涤细胞两次。再加入100μL的结合缓冲液，用荧光倒置显微镜观察功能化二硫化钼与MCF-7人乳腺癌细胞和MCF-10A人乳腺细胞结合情况，确定MoS2-BSA-Apt纳米片靶向识别性。
(2)培养MCF-7人乳腺癌细胞至对数生长期，然后将同批MCF-7人乳腺癌细胞随机分为7组，每组6孔。将细胞接种于无菌96孔板中，CO2培养箱培养至细胞贴壁，吸出培养液，用PBS溶液轻缓冲洗2次后，分别加入含有不同浓度MoS2-BSA纳米片或MoS2-BSA-Apt纳米片培养液。CO2培养箱中孵育24h，之后加入20μLMTT溶液，继续孵育4h，吸出培养液，再加入200μLDMSO。避光条件下，将其转移至酶标仪中测量每孔570nm下吸光度，记录细胞存活率，以此考察MoS2-BSA纳米片和MoS2-BSA-Apt纳米片体外细胞毒性。
(3)同批次MCF-7人乳腺癌细胞均接种到无菌96孔板上，CO2培养箱中培养至细胞贴壁。将96孔板细胞随机分为8组，对照组、激光照射组、MoS2-BSA纳米片和MoS2-BSA-Apt纳米片培养组、MoS2-BSA纳米片和MoS2-BSA-Apt纳米片均激光照射5min组、MoS2-BSA纳米片和MoS2-BSA-Apt纳米片均激光照射10min组。细胞贴壁后，相应组别分别加入含有0.1mg·mL-1的MoS2-BSA纳米片或MoS2-BSA-Apt纳米片培养液200μl，培养箱中继续孵育12h，令纳米片有充足时间进入细胞内。12h后将溶液吸出，用PBS溶液清洗一遍，激光照射组加入200μl培养液后用波长为808nm 0.8W·cm-2激光进行照射，激光照射结束后，吸出培养液并用PBS清洗两遍，加入200μl钙黄绿素-PI染料，继续孵育20min后，吸出液体并用PBS清洗两遍后，荧光显微镜下获得细胞荧光成像；钙黄绿素-PI染料鉴别对照组、MoS2-BSA纳米片和MoS2-BSA-Apt纳米片培养组活死细胞过程同激光照射组；
(4)将接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分为四组：对照组、MoS2-BSA-Apt纳米片溶液培养组、激光照射组、MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射组。将200μl含有0.1mg·mL-1MoS2-BSA-Apt纳米片培养液加入到相应组别孔板内，孵育12h后，吸出培养液用PBS清洗两遍，激光照射结束后，吸出培养液，再次用PBS清洗，加入100μlJC-1染料和100μlPBS混合液，在CO2培养箱中继续孵育20min，PBS清洗两次，荧光显微镜记录荧光成像。非激光照射组细胞线粒体损伤程度测定过程同激光照射组；
(5)在避光条件下将0.2mg·mL-1MoS2-BSA分别置于样本和参比石英比色皿中，423nm处调0；样本比色皿中加入DPBF溶液，测定423nm处的吸光度。用808nm激光对样本比色皿中混合溶液进行照射，之后分别在5、10、20、40和60min时测试A423nm，记录数值。另外，样本和参比比色皿中均无MoS2-BSA时，记录激光照射期间DPBF溶液在A423nm变化情况。
(6)MCF-7人乳腺癌细胞接种于无菌96孔板内，贴壁后将细胞随机分为五组：对照组、激光照射组、阳性对照组、MoS2-BSA-Apt纳米片溶液组、MoS2-BSA-Apt纳米片溶液加激光照射组。将200μl 0.1mg·mL-1MoS2-BSA-Apt纳米片培养液加入到相应组别孔板内，培育2h后，用808nm激光照射10min；阳性对照组加入200μL H2O2继续孵育0.5h，各组吸出培养液并用PBS轻缓冲洗两遍，H2DCFDA探针染色，荧光显微镜下观察细胞荧光成像情况，记录细胞内MoS2-BSA-Apt纳米片产生单线态氧信息。
步骤(1)中MoS2-BSA-Apt2孵育MCF-10A人乳腺细胞和MCF-7人乳腺癌细胞荧光倒置显微镜结果见图12(a)～(d)。可以看出，MoS2-BSA-Apt2具有优异的靶向识别肿瘤细胞性质，它能结合于靶细胞表面。而MoS2-BSA-Apt2与MCF-10A人乳腺细胞孵育，MoS2-BSA与MCF-10A人乳腺细胞和MCF-7人乳腺癌细胞孵育后几乎均无荧光信号。
步骤(2)中MoS2-BSA-Apt体外细胞毒性测试如图13所示，细胞的存活率随着MoS2-BSA-Apt纳米片溶液浓度的增大而逐渐减小，当浓度为200μg·mL-1时，细胞存活率仍高于75％；两种功能化二硫化钼纳米片浓度为100μg·mL-1时，其光热转换能力已经足够进行光热治疗。因此，本专利所构建的MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt纳米片对细胞毒性符合光热治疗要求。
步骤(3)中体外细胞光热效果结果见图14(a)～(h)。对照组(a)、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组(b)；MoS2-BSA纳米片培养组(c)和808nm激光照射组(d)的MCF-7人乳腺癌细胞几乎没有死亡，说明0.1mg·mL-1MoS2-BSA-Apt和MoS2-BSA纳米片对细胞均无损伤，808nm0.8W·cm-2激光对细胞亦不会造成伤害。MoS2-BSA-Apt和MoS2-BSA纳米片培养组细胞经808nm激光照射5min和10min后，细胞呈现不同程度死亡，细胞死亡数量随着激光照射时间的增加而增多；相同激光照射时间条件下，MoS2-BSA-Apt纳米片激光照射组细胞死亡数量均高于MoS2-BSA纳米片激光照射组。两种功能化二硫化钼均具有良好的体外细胞光热治疗效应，具有靶向识别特性的MoS2-BSA-Apt纳米片光热治疗效果优于MoS2-BSA纳米片。
步骤(4)细胞线粒体膜电位检测结果见图15。对照组(a)、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组(b)和808nm激光照射组(c)细胞经JC-1染料染色后，均呈现红色荧光，表明上述三种细胞线粒体膜电位无损伤；MoS2-BSA-Apt纳米片培养组细胞经808nm激光照射(d)后,JC-1染料染色细胞呈绿色荧光，表明特异性识别MCF-7人乳腺癌细胞的MoS2-BSA-Apt纳米片可被移动到细胞内，808nm激光照射后直接导致该细胞线粒体受损，引起其膜电位变化。
步骤(5)细胞外单线态氧测试中，DPBF加入MoS2-BSA后，其在423nm处吸光度随激光照射时间增加明显下降如图16所示，说明808nm激光照射可使细胞外MoS2-BSA纳米片产生一定浓度单线态氧，MoS2-BSA纳米片除具有光热效应外，还有光动力性能。
步骤(6)细胞内单线态氧检测如图17所示。H2O2阳性对照组和808nm激光照射MoS2-BSA-Apt纳米片组的细胞都呈现出了绿色荧光，对照组、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组和仅808nm激光照射组细胞均无荧光显示。因此，进入到细胞内MoS2-BSA-Apt纳米片经808nm激光照射后，可在细胞内产生丰富的单线态氧，MoS2-BSA-Apt纳米片除具有高光热效应外，还有光动力性能，可以用于肿瘤光热和光动力治疗。
实施例5裸鼠体内肿瘤的光热治疗
(1)将生长状态良好且处于对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞进行消化，离心，用无血清培养液将其制成细胞悬液，通过皮下注射方式将1×107个MCF-7人乳腺癌细胞接种到5周龄雌性裸鼠右上肢腋上处。一批实验构建的人乳腺癌荷瘤裸鼠模型数量为30只。之后，带有MCF-7人乳腺癌细胞的裸鼠每天正常进食和饮水，期间密切观察肿瘤生长情况。当肿瘤体积(V＝0.5×a×b2，其中a和b分别表示肿瘤的最大直径和最小直径)达到200mm3时，荷瘤裸鼠模型构建完成。
(2)将携带有皮下MCF-7人乳腺癌的荷瘤裸鼠随机分成6组，每组5只。6组分别为对照组、激光照射组、瘤内注射MoS2-BSA纳米片组、尾静脉注射MoS2-BSA-Apt纳米片组，瘤内注射MoS2-BSA纳米片加激光照射5min和10min组，尾静脉注射MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射5min和10min组。激光参数为：波长808nm，功率密度为0.8W·cm-2。对照组注射PBS、功能化二硫化钼组注射0.1mg·mL-1MoS2-BSA溶液或0.1mg·mL-1MoS2-BSA-Apt溶液体积均为100μL。注射光热剂2h或24h后，荷瘤裸鼠开始激光照射治疗，每天光热治疗之后，记录荷瘤裸鼠体重和肿瘤体积大小，评价功能化评测肿瘤光热治疗效果。
(3)光热治疗两周后，处死裸鼠，将每只裸鼠主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤组织均采用4％多聚甲醛固定，进行水洗、脱水、透明和浸蜡步骤后，用石蜡密封，切片机对裸鼠主要器官和肿瘤进行切片，利用苏木精-伊红(H&E)进行染色，染色结束后，在显微镜下观察切片细胞形态，进一步评估功能化二硫化钼纳米片生物毒性。
(4)18只裸鼠随机分为2组，每组9只。100μL0.1mg·mL-1MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt两种光热剂均通过尾静脉注射给药。注射后的第1小时、24小时和第7天时，分别处死不同材料组的3只裸鼠，将裸鼠主要器官(心，肝，脾，肺，肾)取出，放入王水中，器官组织全部溶于王水后，离心，取上清，用5％硝酸溶液定容至100mL，过滤器过滤，ICP-OES(Optima8300)法测定裸鼠主要器官(心，肝，脾，肺，肾)Mo元素含量，标准曲线由不同浓度钼酸钠王水溶液建立，分析MoS2在裸鼠内代谢途径，进一步评价功能化二硫化钼纳米片生物安全性。
MCF-7人乳腺癌荷瘤裸鼠模型见图18。可以看出，皮下注射MCF-7人乳腺癌裸鼠，经过10天生长，裸鼠右上肢上部均长出CF-7人乳腺癌肿瘤组织，肿瘤平均体积约为216mm3。所构建的荷瘤裸鼠模型状态良好，体重保持稳定上升。
对照组、MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt纳米片组光热治疗10min内红外热成像结果见图19。两种功能化二硫化钼组荷瘤裸鼠，激光照射处乳腺肿瘤温度迅速升高，温度可保持在51℃，达到了光热治疗所需要温度。图20为6组荷瘤裸光热治疗过程乳腺肿瘤图片。可以看出，尾静脉注射MoS2-BSA-Apt纳米片溶液组荷瘤裸鼠，每天用808nm激光照射10min组，裸鼠肿瘤在光热治疗14天后乳腺肿瘤完全消失；而瘤内注射MoS2-BSA纳米片溶液组裸鼠，每天经过808nm激光照射10min组，光热治疗14天后裸鼠肿瘤生长虽然得到了抑制，但并没有完全消失；其余4组裸鼠肿瘤体积均随生长时间增加逐渐增大。因此，MoS2-BSA-Apt纳米片靶向识别作用令其具有更好的光热治疗效果，这与实施例4步骤(3)上文中体外细胞光热治疗结论一致。另外，MoS2-BSA-Apt纳米片进入MCF-7人乳腺癌细胞内，经808nm激光照射后还产生单线态氧，破坏细胞内线粒体，这种光热和光动力协同作用令MoS2-BSA-Apt纳米片具有更加显著癌症精准治疗效果。光热治疗过程，各组裸鼠乳腺肿瘤大小及其体重变化情况如图21所示。对照组裸鼠肿瘤增长较快，与光热治疗组平行第14天时，肿瘤体积为第1天的4～5倍；激光照射组、注射MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt纳米片溶液组裸鼠的肿瘤生长虽存在组别间差异，但肿瘤增长均相对较快，第14天时肿瘤体积达到平行光热治疗第1天肿瘤体积3倍左右。结果表明：仅注射功能化二硫化钼纳米片和仅利用激光照射组肿瘤，均不能有效抑制裸鼠乳腺肿瘤的生长。注射MoS2-BSA纳米片溶液组，裸鼠乳腺肿瘤每天经808nm激光照射10min，其乳腺肿瘤生长速度得到明显抑制作用，但不能完全消除肿瘤，存在复发可能；而注射MoS2-BSA-Apt纳米片溶液组，裸鼠乳腺肿瘤每天经激光治疗10min，在光热治疗后第9天时，裸鼠乳腺肿瘤就已经完全消失，光热至第14天时裸鼠肿瘤未出现复发。光热治疗过程中荷瘤裸鼠体重变化情况见图22。可以看出，治疗组和对照组荷瘤裸鼠体重均呈现增加趋势，组别间有差异，但两种功能化二硫化钼纳米片对荷瘤裸鼠体重增长影响不大，这也进一步说明MoS2-BSA与MoS2-BSA-Apt纳米片是一种安全的光治疗试剂。
荷瘤裸鼠乳腺癌肿瘤经光热治疗后，裸鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)组织切片如图22所示。荷瘤裸鼠经光热治疗后，其主要器官组织中均未发现明显的病理组织损伤或异常，而注射MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt纳米片组荷瘤裸鼠经光热治疗后，其乳腺癌肿瘤受到了破坏，失去原有细胞形态，其余组肿瘤均为正常细胞形态。另外，MoS2-BSA-Apt纳米片组荷瘤裸鼠经激光照射后，乳腺肿瘤细胞形态几乎被完全破坏；MoS2-BSA纳米片组荷瘤裸鼠经激光照射后，其肿瘤细胞虽然也受到一定程度破坏，但还存在一些正常的肿瘤细胞，即被破坏乳腺癌细胞相对较少。这进一步说明，MoS2-BSA-Apt纳米片在肿瘤光热治疗过程中，具有安全、高效性和精确性，同时在生物体内也有着良好的生物相容性。
裸鼠主要器官MoS2测定结果见图23。两种功能化二硫化钼纳米片尾静脉注射到裸鼠体内后，裸鼠心、肝、脾、肺、肾五个主要脏器中Mo含量均随时间增加，7天内呈现出先增加后降低趋势。对比两种功能化二硫化钼纳米片在裸鼠各器官Mo元素含量发现，MoS2代谢过程中肝脏和脾脏的Mo含量均明显高于其他器官，这说明功能化二硫化钼纳米片在裸鼠体内主要是通过肝脏和脾脏进行代谢，而肾代谢了少量的MoS2。原因在于，肝脏和脾脏是动物体内的主要代谢器官，所以Mo元素含量较高。另外，从第7天开始，裸鼠五个主要体内器官中的Mo元素含量均减少，表明功能化二硫化钼纳米片可以被体内代谢清除。裸鼠五个体内主要脏器均存在MoS2-BSA注射组Mo元素含量均高于MoS2-BSA-Apt组，这是由于MoS2-BSA-Apt纳米片中二硫化钼含量低于MoS2-BSA造成的，这也是引起实施例2中MoS2-BSA-Apt纳米片光热升温幅度低于实施例1中MoS2-BSA纳米片升温幅度、实施例4中MoS2-BSA-Apt纳米片体外细胞毒性低于MoS2-BSA纳米片的主要原因。因此，MoS2-BSA和MoS2-BSA-Apt两种功能化二硫化钼纳米片均为安全有效的光治疗剂。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂，其特征在于：包括二硫化钼纳米片、牛血清白蛋白(BSA)以及核酸适配体(Apt),功能化二硫化钼纳米片的制备方法包括以下步骤：
(1)将钼酸钠，L-半胱氨酸分别溶于超纯水中，将L-半胱氨酸溶液、一定量剥离剂葡萄糖依次加入到钼酸钠溶液中，超声10min后，200℃水热反应，离心得到二硫化钼纳米片；通过葡萄糖辅助一步水热法合成MoS2纳米片，其中钼酸钠，L-半胱氨酸质量比为1：2；
(2)将步骤(1)合成的MoS2纳米片与BSA按质量比例3:1在溶液中充分混合后，冰浴超声或室温搅拌3h后，4℃、12000rpm条件下离心30min，获得表面修饰牛血清白蛋白(BSA)二硫化钼纳米片；
(3)取EDC(500μl，500mM)和NHS(500μl，100mM)对步骤(2)得到的MoS2-BSA表面末端游离羧基进行活化，将1mLMoS2-BSA与EDC和NHS于室温下反应0.5h，超滤离心，去离子水洗涤，得到活化MoS2-BSA纳米片；将核酸适配体(Apt，5’-NH2-AGGAGCACGACTCTGACGTAGGATCGAGACGAGGTACGTAT-3’)85℃变性10min，随即冰浴10min复性；活化MoS2-BSA与核酸适配体冰浴震荡反应5h，之后超滤离心直至超滤液中检测不到适配体，最终得到核酸适配体修饰的MoS2-BSA-Apt纳米片。
2.根据权利要求1所述的一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂，其特征在于，所述功能化MoS2-BSA-Apt纳米片的尺寸在80-120nm，功能化二硫化钼纳米片中MoS2的尺寸为10nm。
3.根据权利要求1所述的一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂，其特征在于：所述步骤(1)中葡萄糖剥离剂为6.25mg或62.5mg，反应时间为10h、24h或36h。
4.根据权利要求1所述的一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂，其特征在于：所述步骤(2)中冰浴超声时间为2h或4h，频率为25HZ或45HZ，室温搅拌0h或3h。
5.一种用于对权利要求1所述的功能化二硫化钼纳米片光热剂的细胞毒性、体外肿瘤光热和光动力性能的测定方法，包括以下步骤：
(1)将接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分组，加入不同浓度MoS2-BSA纳米片培养液，CO2培养箱中孵育24h，加入20μL MTT溶液，继续孵育4h，吸出培养液，再加入200μLDMSO，避光条件下，将其转移至酶标仪中测量每孔570nm下吸光度，记录细胞存活率，考察MoS2-BSA体外细胞毒性；MTT法测量MoS2-BSA-Apt纳米片体外细胞毒性过程同MoS2-BSA纳米片；
(2)将接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分为对照组、激光照射组、MoS2-BSA纳米片培养组、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组，MoS2-BSA纳米片加激光照射5min组、MoS2-BSA纳米片加激光照射10min组，MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射5min组、MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射10min组；细胞贴壁生长后，相应组别加入含有MoS2-BSA纳米片或MoS2-BSA-Apt纳米片培养液，CO2培养箱中孵育10h，吸出培养液，用PBS轻缓冲洗两次，激光照射组加入200μl培养液后，激光照射5min或10min，激光照射结束后，吸出培养液并用PBS清洗，加入200μl钙黄绿素-PI染料继续孵育20min，吸出液体后用PBS清洗，荧光显微镜记录细胞荧光图像；钙黄绿素-PI染料鉴别对照组、MoS2-BSA纳米片培养组和MoS2-BSA-Apt纳米片培养组活死细胞过程同激光照射组；
(3)将接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分四组，即对照组、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组、激光照射组、MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射组；相应培养液孵育细胞12h后，吸出培养液用PBS清洗，激光照组激光照射结束后，吸出培养液，再次用PBS清洗，加入100μlJC-1染料，在CO2培养箱中继续孵育20min，PBS清洗两次，荧光显微镜记录细胞荧光图像。JC-1染料法通过细胞膜电位变化获得非激光照射组细胞损伤程度过程同激光照射组；
(4)避光条件下将相同浓度MoS2-BSA纳米片溶液分别置于样本和参比石英比色皿中，423nm处调0；样本比色皿中加入DPBF溶液，参比比色皿中加入同体积PBS溶液，测定423nm处吸光度；808nm激光照射样本比色皿溶液后，分别在5、10、20、40和60min时测量A423nm，记录MoS2-BSA纳米片细胞外产生单线态氧数值；另外，样本和参比比色皿中均无MoS2-BSA时，测量激光照射DPBF溶液期间A423nm变化情况；
(5)接种于96孔板的MCF-7人乳腺癌细胞随机分为五组：对照组、激光照射组、MoS2-BSA-Apt纳米片培养组、阳性对照组和MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射组，细胞贴壁孔板内分别加入不含或含有MoS2-BSA-Apt纳米片溶液培养液，孵育2h，阳性对照组加入200μL H2O2继续孵育0.5h，激光照射组和MoS2-BSA-Apt纳米片加激光照射组均用808nm激光照射10min；各组吸出培养液并用PBS轻缓冲洗两遍，H2DCFDA探针染色，荧光显微镜下记录细胞荧光图像，获得细胞内MoS2-BSA-Apt纳米片产生单线态氧信息。
6.根据权利要求1所述的一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂，其特征在于：所述具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂可用于肿瘤光热治疗。
CN202010613124.2A 2020-06-29 2020-06-29 一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂 Expired - Fee Related CN111671901B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010613124.2A CN111671901B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010613124.2A CN111671901B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111671901A true CN111671901A (zh) 2020-09-18
CN111671901B CN111671901B (zh) 2022-05-31

Family

ID=72456902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010613124.2A Expired - Fee Related CN111671901B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111671901B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375561A (zh) * 2020-10-27 2021-02-19 中南民族大学 上转换荧光纳米探针及其应用
CN113101366A (zh) * 2021-04-08 2021-07-13 东南大学 一种同时具有光热和光动力性能的二硫化钼基材料及其制法
CN113109265A (zh) * 2021-03-18 2021-07-13 温州医科大学 一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法
CN113433320A (zh) * 2021-07-19 2021-09-24 长春理工大学 磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物ca19-9的方法
CN113456815A (zh) * 2021-06-03 2021-10-01 北京大学深圳医院 二磷化钼在制备光热试剂中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110184273A (zh) * 2019-06-17 2019-08-30 长春理工大学 特异性靶向乳腺癌细胞株mcf-7的核酸适配体筛选及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110184273A (zh) * 2019-06-17 2019-08-30 长春理工大学 特异性靶向乳腺癌细胞株mcf-7的核酸适配体筛选及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BO PANG等: "Aptamer modified MoS2 nanosheets application in targeted photothermal therapy for breast cancer", 《COLLOIDS AND SURFACES A》, vol. 608, no. 125506, 13 September 2020 (2020-09-13), pages 1 - 12, XP086366870, DOI: 10.1016/j.colsurfa.2020.125506 *
BO PANG等: "Research on Targeted Thermal Effect of Molybdenum Disulfide Nanosheets Modified by Nucleic Acid Aptamers", 《E3S WEB OF CONFERENCES》, vol. 185, no. 04003, 1 September 2020 (2020-09-01), pages 1 - 4 *
XUEYI ZHANG等: "Functionalized MoS2-nanosheets for targeted drug delivery and chemo-photothermal therapy", 《COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES》, vol. 173, 21 September 2018 (2018-09-21), pages 101 - 108 *
YAGE PENG等: "Determination of folic acid via its quenching effect on the fluorescence of MoS2 quantum dots", 《MICROCHIMICA ACTA》, vol. 186, no. 605, 5 August 2019 (2019-08-05), pages 1 - 8 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375561A (zh) * 2020-10-27 2021-02-19 中南民族大学 上转换荧光纳米探针及其应用
CN113109265A (zh) * 2021-03-18 2021-07-13 温州医科大学 一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法
CN113101366A (zh) * 2021-04-08 2021-07-13 东南大学 一种同时具有光热和光动力性能的二硫化钼基材料及其制法
CN113101366B (zh) * 2021-04-08 2023-08-25 东南大学 一种同时具有光热和光动力性能的二硫化钼基材料及其制法
CN113456815A (zh) * 2021-06-03 2021-10-01 北京大学深圳医院 二磷化钼在制备光热试剂中的应用
CN113456815B (zh) * 2021-06-03 2023-02-28 北京大学深圳医院 二磷化钼在制备光热试剂中的应用
CN113433320A (zh) * 2021-07-19 2021-09-24 长春理工大学 磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物ca19-9的方法
CN113433320B (zh) * 2021-07-19 2023-03-14 长春理工大学 磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物ca19-9的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111671901B (zh) 2022-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111671901B (zh) 一种具有靶向识别的核酸适配体修饰二硫化钼纳米片光热剂
CN111438368B (zh) 利用丝素蛋白溶液制备金铂双金属纳米酶及其应用
CN108853059A (zh) 一种聚吡咯-聚乙烯吡咯烷酮纳米颗粒及其制备方法和用途
CN101805362A (zh) 二乙撑三胺五乙酸钆修饰的卟啉及制备方法及用途
CN116477668B (zh) 一种二维硫化铁纳米片及其制备方法和应用
Pang et al. Aptamer modified MoS2 nanosheets application in targeted photothermal therapy for breast cancer
CN111803629A (zh) 一种基于纳米纤维素晶的有机无机杂化多功能生物材料及其制备方法和应用
CN108514642B (zh) 一种树状大分子稳定的超小四氧化三铁/金纳米花的制备方法
CN112007170B (zh) 免疫佐剂功能化金属有机框架材料及其制备方法与应用
Wei et al. Orange-emissive carbon quantum dots for ligand-directed Golgi apparatus-targeting and in vivo imaging
CN106421823A (zh) 一种两性离子修饰的超小氧化铁颗粒的制备方法
CN108653732B (zh) pH响应型四氧化三铁纳米粒及其制备方法与应用
CN104117074B (zh) 一种基于聚吡咯复合物的治疗诊断制剂及其制备方法
CN108743971B (zh) 一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法及其应用
CN110743013A (zh) 用于双动力协同治疗的上转换纳米复合材料、制备方法及应用
CN107625744B (zh) 一种核壳结构纳米胶囊及其制备方法和应用
CN110368359A (zh) 一种基于支化聚乙烯亚胺合成的杂化纳米水凝胶及其制备和应用
CN111760035B (zh) 一种双光子激发诊疗一体化纳米材料及其制备方法与应用
CN113230419A (zh) 一种基于藻蓝胆素的新型靶向纳米颗粒及其制备方法
CN106620701A (zh) 一种G5‑MoS2/Bcl‑2 siRNA复合物的制备方法
CN113562773B (zh) 一种CoFe2O4量子点纳米材料的合成方法及其在抗非小细胞型肺癌中的应用
CN105535973A (zh) 用于光声成像和/或光热治疗的磷脂-聚苯胺纳米粒及制备方法
CN117224673B (zh) 一种可用于增强膀胱癌声动力治疗的钛基纳米材料
CN111420072A (zh) 一种mri-sers双模式造影剂的制备方法
CN113181357B (zh) 一种有机纳米肿瘤光热剂及其制法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220531