CN105543395A - 检测乳腺癌her2基因的纳米量子点标记分子探针及其制备方法 - Google Patents

检测乳腺癌her2基因的纳米量子点标记分子探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了检测乳腺癌HER2基因的纳米量子点标记分子探针及其制备方法，所述分子探针是采用对细胞毒性最小的、经过表面修饰的水溶性ZnS包被的CdSe量子点与生物素标记的高特异性核苷酸片段结合后，再与STV连接形成的，其中所述高特异性核苷酸片段是指可与乳腺癌HER2基因杂交的一段高特异性核苷酸序列。本发明提供的新型纳米量子点标记分子探针具有高灵敏度、高稳定性、高通量、容易标准化和基层推广的优点。本发明初步构建了乳腺癌关键分子HER2基因的原位、高灵敏、共定位分子成像与定量分析技术体系，为乳腺癌关键分子的准确评估提供新方法；将新型量子点标记探针技术用于乳腺癌分子影像研究，有助于推动乳腺癌个体化医疗。

Description

检测乳腺癌HER2基因的纳米量子点标记分子探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及一种检测乳腺癌HER2基因的纳米量子点标记分子探针及其制备方法。
背景技术
乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，据世界卫生组织国际癌症研究中心统计，2012年全球女性乳腺癌新发病例达167万，占全部女性肿瘤发病的25.2％；52万女性因乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的14.7％。在我国，乳腺癌占据女性恶性肿瘤发病的首位，2009年调查结果显示其标化发病率为23.16/100,000，显著高于其它癌症的发病率，并以每年2-3％的增长速率递增。同时，我国女性乳腺癌的死亡率呈连续上升趋势，达4.94/100,000，是女性第五位最常见的恶性肿瘤死亡原因。
人类表皮生长因子受体(humanepidermalgrowthfactorreceptor,HER/ErbB)家族属酪氨酸激酶受体，包括4种同源跨膜蛋白：HER1(EG-FR或ErbB1)、HER2(Neu或ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。每种受体蛋白酪氨酸激酶活性域高度保守，使其结构和功能具有很高的同源性并成为受体间相互作用及交叉激活的分子基础。HER1、HER3或HER4与配体结合后，通过与HER2形成异二聚体而激活其细胞膜内侧含有酪氨酸残基的蛋白片段，使C末端的酪氨酸激酶发生磷酸化，信号通路被激活，进而参与多种细胞功能的调节，如生长、增殖和凋亡等。人类HER2基因是定位于17号染色体的原癌基因，HER2蛋白膜内段的各酪氨酸残基发生磷酸化后均能作用于特定的信号蛋白，激活信号转导通路。这些信号转导通路包括Ras/促分裂原活化蛋白激酶通路、PI3K/AKT/mTOR通路、Janus激酶/信号转导蛋白和转录激活因子通路及PLC-γ通路。转导途径的异常和各种肿瘤，尤其是乳腺癌的生长及增殖密切相关。临床上约20％的乳腺癌患者存在HER2基因扩增或过表达。有数据显示，HER2的过表达预示着疾病复发及患者存活率的降低。
作为21世纪最重要的高新技术之一，纳米技术在癌症诊疗方面已展示出广阔的应用前景。特别是纳米荧光量子点(Quantumdots，QDs)，作为一种半径小于或接近于激子玻尔半径的新型半导体纳米晶粒，表现出独特的量子尺寸和表面效应，使其具有以下多方面优越的光学特性:荧光发射波长可控、发射峰狭窄对称，激发谱宽而连续，消光系数大、荧光强度高、光稳定性好。经过表面修饰及功能化后，量子点易与生物功能分子耦联，成为量子点标记探针，在分子成像中与传统的免疫荧光标记探针相比具有显著应用优势，主要表现在：1)实现分子信息的高准确性及灵敏性定量检测：量子点的荧光强度高、耐光漂性强，能克服生物组织自发荧光的影响，获得准确的成像信息并进行量化；2)长时间、实时成像：荧光强度高、抗光漂白能力强，及经过适当修饰后具有良好的生物相容性，能够耐受复杂的生物医学应用环境，可用于长时间、实时分子成像研究；3)多分子共成像与相互作用研究：不同材料或大小的量子点可具有不同的发射光谱，可实现多个分子的原位、实时、同时成像；4)深组织成像：荧光发射波长可控使其可发射近红外波长的光谱，具有较好的组织穿透性，对体内成像监测十分理想。
近年来，基于量子点标记探针技术的分子成像、细胞成像和在体成像取得了重要进展。目前，量子点标记探针技术的研究重点已从基础研究向转化应用研究转变，将量子点标记探针技术用于肿瘤学研究，通过对肿瘤演变进展过程的关键分子事件、关键细胞事件进行实时、高灵敏、长时间标记成像，有望对肿瘤发病机制研究、早期诊断、靶向治疗、预后复发监测等方面产生重要影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测乳腺癌HER2基因的纳米量子点标记分子探针及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明的用于检测乳腺癌HER2基因的纳米量子点标记分子探针，所述分子探针包含：识别单元、连接单元和信号报告单元；
所述识别单元为经过表面修饰的水溶性ZnS包被的CdSe量子点与生物素标记的高特异性核苷酸序列；
所述连接单元为利用量子点表面的元素如Zn、Cd等与巯基之间强的络合作用力，使量子点与巯基酸络合带上羧基，巯基酸可以是巯基乙酸、巯基丙酸、巯基丁二酸、6,8-二巯基辛酸等；
所述信号报告单元为：biotin与STV/avidin/ExtrAvidin连接形成的；
所述分子探针的通式如下：
QDs-高特异性核苷酸序列-biotin-STV/avidin/ExtrAvidin；
其中，QDs为水溶性ZnS包被的CdSe量子点，其荧光发射波长在520nm-620nm；所述生物分子是指可与乳腺癌HER2基因相互作用的核酸、多肽、抗体或小分子抑制剂。
所述经过表面修饰的水溶性ZnS包被的CdSe量子点是指在水溶性ZnS包被的CdSe量子点表面修饰可与生物分子连接的官能团。例如，表面带-COOH或-NH2的量子点很容易进行PEG、NTA、Biotin或Folate等功能化，所得产物具有更好的生物相容性和更广泛的适应性。
优选地，所述生物分子是指可与SEQIDNO:1所示序列杂交的DNA片段。
更优选地，所述分子探针为QDs-DNA-biotin-STV。
本发明还提供一种用于检测乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述分子探针。
本发明进一步提供分子探针QDs-DNA-biotin-STV的制备方法，包括以下步骤：
1)水溶性ZnS包被的CdSe量子点的制备；
2)水溶性ZnS包被的CdSe量子点与biotin标记的DNA连接，制备QDs-DNA-biotin；
3)STV与QDs-DNA-biotin结合，制备QDs-DNA-biotin-STV。
步骤1)具体为：
取12.5gTOPO(三辛基氧化膦)置于反应瓶中，于200℃真空环境下干燥并脱气约20min；然后升温到350℃接近一个大气压，待温度稳定后，将0.7ml储存液A加入反应瓶中并停止加热；待反应混合液冷却至310℃，析出少量的CdSe纳米晶体；当温度降至300℃，将储存液B按每次0.55ml的量加入反应瓶中，间隔20s加入一次，共加入5次(储存液A、储存液B的摩尔比约为1:4)，待温度降至100℃，恒温搅拌反应1h，然后，将无水甲醇加入到上述反应液中，离心收集沉淀，向沉淀中加入无水甲醇清洗，然后离心收集沉淀，沉淀用无水甲醇重复清洗2次，以去除残余的TOPO；将收集的纳米晶体悬浮于10ml氯仿中，离心去除残余碎片和尚未反应的试剂；通过吸收光谱峰、X射线或测量直径等方法筛选出荧光发射波长在520nm-620nm且粒径均一，单分散性好的ZnS包被的CdSe纳米粒子；然后将其完全溶于氯仿中，超声30min，向其中逐滴加入蒸馏水至50ml。滴加完毕，将混合液旋蒸除去氯仿，使用.022um滤膜过滤水溶液，得到透明的水溶性ZnS包被的CdSe量子点。
其中，储存液A的制备方法如下：取0.2gSe溶于4.5mlTOP溶液(100uM)，向其中加入0.25mlMe2Cd溶液(100uM)，再加入19.5mlTOP溶液混匀即得储存液A，保存于充满N2的干燥盒中；
储存液B的制备方法如下：取0.52ml(TMS)2S加入4.5mlTOP溶液中，向其中加入3.5mlMe2Zn溶液(100uM)，再加入16mlTOP溶液混匀即得储存液B，保存于充满N2的干燥盒中。
步骤2)具体为：(备注：该部分包含表面修饰)
将1.2nmolQDs与12nmol经巯基、biotin双修饰的DNA混合，加入Tris缓冲液，最终形成1×Tris缓冲液，在25℃恒温振荡器上震荡后，避光放置过夜，使巯基修饰的DNA分子与量子点表面的巯基丙酸发生配体交换；然后向反应液中加入600μl无水乙醇，5000rpm离心30min，收集沉淀，用200μl1×Tris缓冲液重悬沉淀，超声1min，再加入600μl无水乙醇，5000rpm离心30min，去上清，沉淀用PBS复溶，得到QDs-DNA-biotin连接产物。
步骤3)具体为：
向10nmolSTV溶液中加入0.5nmolQDs-DNA-biotin，混合液在25℃下震荡30min，然后将反应液转移到300KD超滤管中，5000rpm离心15min，收集超滤管中的上层溶液，加入500μlPBS清洗，5000rpm离心10min；用PBS重复清洗2次，最终超滤管中的上层溶液用PBS复溶，4℃避光保存，即得纳米量子点标记分子探针QDs-DNA-biotin-STV。
上述方法中包含双修饰的探针序列：HS-5’-特异性核苷酸探针序列-3’-biotin，巯基端可以与量子点表面的巯基丙酸发生配体交换，biotin端可以和avidin(抗生物素蛋白)、STV、ExtrAvidin连接。在本发明的另一个实施方案中，如果CdSe/ZnS量子点采用PASP-Na-g-PEG-DDA包被，则双修饰的探针序列可以是：H2N-5’-特异性核苷酸探针序列-3’-biotin。
利用本发明的新型纳米量子点(QDs)标记分子探针，采用FISH检测方法并结合影像技术，可实现对乳腺癌HER2的活体或石蜡样本的检测分析。
本发明制备的荧光发射波长在520nm-620nm、粒径可控的多色荧光CdSe/ZnS纳米粒子，具有优良的荧光性质，量子产率从20％-30％提高到60％-80％，且粒径均一，单分散性好。通过设计优化改造，解决了量子点的表面化学修饰问题。
与现有技术相比，本发明提供的新型纳米量子点标记分子探针具有高灵敏度、高稳定性、高通量、适合不同样本，容易标准化和基层推广的优点。本发明初步构建了乳腺癌关键分子HER2基因的原位、高灵敏、共定位分子成像与定量分析技术体系，为乳腺癌关键分子的准确评估提供新方法；基于该技术体系，实现了乳腺癌亚型的有效预测，为乳腺癌的个体化分子预警提供了新思路；将新型量子点标记探针技术用于乳腺癌分子成像研究，有助于揭示肿瘤进展演变的生物学规律，推动乳腺癌的个体化医疗，促进学科的交叉融合及基础成果的应用转化。
附图说明
图1为本发明实施例2中量子点标记探针对HER2基因的特异性检测结果。A为FISH阳性；B为FISH阴性。Bars:100μm。
图2为本发明实施例2中量子点标记探针对HER2基因的定量检测结果。C为FISH阳性,少量突变；D为FISH阳性,大量突变。Bars:20μm。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1纳米量子点标记分子探针QDs-DNA-biotin-STV的制备
(1)水溶性ZnS包被的CdSe量子点制备
取12.5gTOPO(三辛基氧化膦)置于反应瓶中，于200℃真空环境下干燥并脱气约20min；然后升温到350℃接近一个大气压，待温度稳定后，将0.7ml储存液A加入反应瓶中并停止加热；待反应混合液冷却至310℃，析出少量的CdSe纳米晶体；当温度降至300℃，将储存液B按每次0.55ml的量加入反应瓶中，间隔20s加入一次，共加入5次(储存液A、储存液B的摩尔比约为1:4)，待温度降至100℃，恒温搅拌反应1h，然后，将无水甲醇加入到上述反应液中，离心收集沉淀，向沉淀中加入无水甲醇清洗，然后离心收集沉淀，沉淀用无水甲醇重复清洗2次，以去除残余的TOPO；将收集的纳米晶体悬浮于10ml氯仿中，离心去除残余碎片和尚未反应的试剂；通过吸收光谱峰、X射线或测量直径等方法筛选出荧光发射波长在520nm-620nm且粒径均一，单分散性好的ZnS包被的CdSe纳米粒子；然后将其完全溶于氯仿中，超声30min，向其中逐滴加入蒸馏水至50ml。滴加完毕，将混合液旋蒸除去氯仿，使用.022um滤膜过滤水溶液，得到透明的水溶性ZnS包被的CdSe量子点。
其中，储存液A的制备方法如下：取0.2gSe溶于4.5mlTOP溶液(100uM)，向其中加入0.25mlMe2Cd溶液(100uM)，再加入19.5mlTOP溶液混匀即得储存液A，保存于充满N2的干燥盒中。
储存液B的制备方法如下：取0.52ml(TMS)2S加入4.5mlTOP溶液中，向其中加入3.5mlMe2Zn溶液(100uM)，再加入16mlTOP(三辛基膦)溶液混匀即得储存液B，保存于充满N2的干燥盒中。
(2)水溶性ZnS包被的CdSe量子点与DNA连接(备注：该部分包含表面修饰)
将1.2nmolQDs与12nmol经巯基、biotin双修饰的DNA混合(HS-5’-特异性核苷酸探针序列-3’-biotin，其中特异性核苷酸探针序列是可与SEQIDNO:1所示序列杂交的DNA片段)，加入一定体积的10×Tris缓冲液，使最终缓冲液为1×Tris。反应溶液混匀后，在25℃的恒温振荡器上轻微震荡，避光放置过夜，使巯基修饰的DNA分子与量子点表面的巯基丙酸发生配体交换。然后通过乙醇沉淀，去除没有连接在CdSe/ZnS量子点上的DNA分子，即向反应液中加入600μl无水乙醇，在5000rpm转速下离心30min，QDs-DNA-biotin连接产物沉淀下来，而游离的DNA仍然在上清中。去掉上清，沉淀用200μl1×Tris缓冲液重悬，超声1min，以减少量子点对DNA的非特异性吸附。再加入600μl无水乙醇，在5000rpm转速下离心30min。去上清，沉淀用PBS复溶。得到QDs-DNA-biotin连接产物。
(3)STV与QD-DNA-biotin结合
向10nmolSTV溶液中加入0.5nmolQD-DNA-biotin，混合液在25℃下轻微震荡30min。反应液转移到300KD超滤管中，在5000rpm转速下离心15min，超滤管下层为未反应的STV，弃去超滤管下层的溶液；超滤管上层为QDs-DNA-biotin-STV连接产物，向上层溶液中加入500μlPBS溶液冲洗，在5000rpm转速下离心10min；重复冲洗2次。最终超滤管中上层的复合物溶液用一定体积的PBS溶液复溶，4℃避光保存，即得纳米量子点标记分子探针QDs-DNA-biotin-STV。
实施例2新型纳米量子点(QDs)标记分子探针在FISH检测中的应用
1、FISH试剂：
1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃
20×SSC(pH7.0)
2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成
25mg/ml蛋白酶K消化液
变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)新鲜配制
杂交后洗涤液(50％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)新鲜配制
/2、检测方法：
利用FISH技术检测乳腺癌组织中HER2基因扩增状况。使用4μm组织切片(湖北省人民医院)分析HER2基因的扩增，HER2探针根据制造商的说明采用切口平移法直接标记。近着丝粒谱橙色标记的11号染色体的探针(CEP11探针，市售可得)作为内控探针。FISH操作按照已有标准进行，样本的脱蜡和预处理按照SpotLightTissueKit(invitrogen,00-8401)操作手册进行。将处理好的样本和HER2/CEP3探针于80℃共变性5分钟，然后37℃杂交48小时。用杂交洗脱缓冲液(0.3％NP40/1×SSC)75.5℃处理5分钟除去过量的探针，然后用2×SSC处理，室温放置2分钟。用0.3μg/mgDAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole；vector,H-1200)进行复染后盖上盖玻片。用荧光显微镜(Olympus,BX61,Tokyo,Japan)观察HER2和CEP3信号。当≥10％的肿瘤细胞中有集群的存在或HER2/CEP3比率≥2时，HER2基因扩增发生。
结果表明，基于量子点标记探针技术的乳腺癌HER2多光谱定量检测，与目前检测金标准具有较高的一致性，可以较好地揭示乳腺癌HER2表达的生物学规律，更准确评估乳腺癌患者的5年无病生存；更重要的是，根据HER2总量，可以甄别出目前传统方法难以发现的乳腺癌新亚型。以此来指导的乳腺癌分子靶向治疗，有望进一步提高乳腺癌疗效，推动乳腺癌的个体化、规范化治疗。说明量子点标记探针的乳腺癌HER2分子靶向诊断技术路线可行，有望为乳腺癌HER2的靶向诊断提供一种具有临床价值的新方法。
采用新型纳米量子点标记分子探针结合影像技术对乳腺癌石蜡切片组织中HER2的特异性检测(图1)和定量检测(图2)，并在大样本、复杂乳腺癌临床病理标本中，评估了新型量子点标记探针的可靠性、灵敏性与实用性，初步证实了量子点标记探针技术对乳腺癌HER2的体外定量检测优势及临床应用的可行性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.用于检测乳腺癌HER2基因的纳米量子点标记分子探针，其特征在于，该纳米量子点标记分子探针包含：识别单元、连接单元和信号报告单元；
所述识别单元为经过表面修饰的水溶性ZnS包被的CdSe量子点与生物素标记的高特异性核苷酸序列；
所述连接单元为利用量子点表面的元素如Zn、Cd等与巯基之间强的络合作用力，使量子点与巯基酸络合带上羧基，巯基酸可以是巯基乙酸、巯基丙酸、巯基丁二酸、6,8-二巯基辛酸等；
所述信号报告单元为：biotin与STV/avidin/ExtrAvidin连接形成的；
所述分子探针的通式如下：
QDs-高特异性核苷酸序列-biotin-STV/avidin/ExtrAvidin；
其中，QDs为水溶性ZnS包被的CdSe量子点，其荧光发射波长在520nm-620nm；所述生物分子是指可与乳腺癌HER2基因相互作用的核酸、多肽、抗体或小分子抑制剂。
2.根据权利要求1所述的分子探针，其特征在于，其包含双修饰的HER2基因的核酸序列：HS-5’-NNNNNN-3’-biotion,巯基端可以与量子点表面的巯基丙酸发生配体交换，biotion端可以和avidin、STV、ExtrAvidin连接；
如果CdSe/ZnS量子点采用PASP-Na-g-PEG-DDA包被，双修饰的核苷酸序列可以是：H2N-5’-NNNNNN-3’-biotion。
3.根据权利要求1或2所述的分子探针，其特征在于，所述高特异性核苷酸序列是指可与SEQIDNO:1所示序列杂交的DNA片段。
4.一种用于检测乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任一项所述的分子探针。
5.权利要求4所述的分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)水溶性ZnS包被的CdSe量子点的制备；
2)水溶性ZnS包被的CdSe量子点与biotin标记的DNA连接，制备QDs-DNA-biotin；
3)STV与QDs-DNA-biotin结合，制备QDs-DNA-biotin-STV。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：
取12.5gTOPO置于反应瓶中，于200℃真空环境下干燥并脱气约20min；然后升温到350℃接近一个大气压，待温度稳定后，将0.7ml储存液A加入反应瓶中并停止加热；待反应混合液冷却至310℃，析出少量的CdSe纳米晶体；当温度降至300℃，将储存液B按每次0.55ml的量加入反应瓶中，间隔20s加入一次，共加入5次(储存液A、储存液B的摩尔比约为1:4)，待温度降至100℃，恒温搅拌反应1h，然后，将无水甲醇加入到上述反应液中，离心收集沉淀，向沉淀中加入无水甲醇清洗，然后离心收集沉淀，沉淀用无水甲醇重复清洗2次，以去除残余的TOPO；将收集的纳米晶体悬浮于10ml氯仿中，离心去除残余碎片和尚未反应的试剂；通过吸收光谱峰、X射线或测量直径等方法筛选出荧光发射波长在520nm-620nm且粒径均一，单分散性好的ZnS包被的CdSe纳米粒子；然后将其完全溶于氯仿中，超声30min，向其中逐滴加入蒸馏水至50ml；滴加完毕，将混合液旋蒸除去氯仿，使用.022um滤膜过滤水溶液，得到透明的水溶性ZnS包被的CdSe量子点。
其中，储存液A的制备方法如下：取0.2gSe溶于4.5ml100uMTOP溶液，向其中加入0.25ml100uMMe2Cd溶液，再加入19.5mlTOP溶液混匀即得储存液A，保存于充满N2的干燥盒中；
储存液B的制备方法如下：取0.52ml(TMS)2S加入4.5mlTOP溶液中，向其中加入3.5ml100uMMe2Zn溶液，再加入16mlTOP溶液混匀即得储存液B，保存于充满N2的干燥盒中。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为：
将1.2nmolQDs与12nmol经巯基、biotin双修饰的DNA混合，加入Tris缓冲液，最终形成1×Tris缓冲液，在25℃恒温振荡器上震荡后，避光放置过夜，使巯基修饰的DNA分子与量子点表面的巯基丙酸发生配体交换；然后向反应液中加入600μl无水乙醇，5000rpm离心30min，收集沉淀，用200μl1×Tris缓冲液重悬沉淀，超声1min，再加入600μl无水乙醇，5000rpm离心30min，去上清，沉淀用PBS复溶，得到QDs-DNA-biotin连接产物。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为：
向10nmolSTV溶液中加入0.5nmolQDs-DNA-biotin，混合液在25℃下震荡30min，然后将反应液转移到300KD超滤管中，5000rpm离心15min，收集超滤管中的上层溶液，加入500μlPBS清洗，5000rpm离心10min；用PBS重复清洗2次，最终超滤管中的上层溶液用PBS复溶，4℃避光保存，即得纳米量子点标记分子探针QDs-DNA-biotin-STV。
9.权利要求1-3任一项所述的分子探针在检测乳腺癌HER2基因方面的应用，其特征在于，采用FISH的检测方法并结合影像技术，对乳腺癌HER2的活体或石蜡样本进行结果分析。
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