CN114295703B - 一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器 - Google Patents
一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114295703B CN114295703B CN202210001613.1A CN202210001613A CN114295703B CN 114295703 B CN114295703 B CN 114295703B CN 202210001613 A CN202210001613 A CN 202210001613A CN 114295703 B CN114295703 B CN 114295703B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ifn
- gamma
- aptamer
- electrode
- electrochemical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 27
- 239000004332 silver Substances 0.000 title claims abstract description 27
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 64
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 10
- VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N Allylamine Chemical compound NCC=C VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 claims description 6
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 claims description 6
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 2
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims description 2
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 claims 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 abstract description 54
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 28
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 abstract description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 3
- PMBXCGGQNSVESQ-UHFFFAOYSA-N 1-Hexanethiol Chemical compound CCCCCCS PMBXCGGQNSVESQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000007812 electrochemical assay Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- -1 silver ions Chemical class 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- AKIZPWSPNKVOMT-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylhexan-1-ol Chemical compound CCCCCC(O)S AKIZPWSPNKVOMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000693922 Bos taurus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011852 carbon nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003487 electrochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明属于生物传感和电分析化学检测技术领域,涉及一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器。该传感器以固定有金纳米颗粒的胺端电极为基底电极,通过Au‑S键将富C修饰的IFN‑γ特异性适配体固定化并通过掩蔽剂对电极表面未结合位点进行封闭。通过核酸适配体的识别将IFN‑γ捕获到电极表面,并引入过量cDNA使未结合IFN‑γ的适配体全部双链化。然后,利用双链剪切酶将所有双链消解。之后,以富C序列为模板原位生成银纳米簇为信号探针最终完成IFN‑γ的检测。实验表明该方法构建的电化学生物传感器对于IFN‑γ的检测不仅具有灵敏度高、检测限低、特异性高且稳定性好等特点,且在人血清和细胞分析液样本的检测中表现出可行性,为细胞因子的定量检测及其在早期临床诊断中的应用提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器,用于细胞因子干扰素-γ的测定,属于生物传感和电分析化学检测技术领域。
背景技术
细胞因子作为信号蛋白通常由免疫细胞分泌,可以调节免疫反应、组织再生和伤口愈合。异常细胞因子表达与癌症、感染、阿尔茨海默病以及COVID-19密切相关。干扰素-γ(IFN-γ)是最常见的细胞因子之一,参与多种炎症性疾病,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。
由于人体液中IFN-γ的浓度极低,制造用于检测IFN-γ的生物传感器仍存在较大挑战。为了更好实现对IFN-γ的快速高效检测,许多具有优异性能的新型功能纳米材料(如币族金属纳米材料、金属氧化物、碳纳米粒子、量子点和磁性纳米材料等)被引入到电化学、荧光、比色和其他分析方法中。银纳米团簇由于其价格合理,制备过程简单,稳定性较高且导电性和生物相容性优异而被广泛用作电化学传感器的电极修饰。因此,从银基材料的设计和可控合成着手,构建超灵敏检测IFN-γ的电化学传感器,为实现体液中的IFN-γ日常检测提供一种简便的方法。
以富胞嘧啶(富C)为模板合成银纳米簇过程简单,且合成的银纳米簇具有电化学活性。另一方面,IFN-γ的核酸适配体的成功筛选为IFN-γ检测传感器的构建中检测的专一性提供了可能。我们知道核酸适配体是通过指数富集的方式在体外筛选而来,是由20~60个碱基组成的单链寡聚核苷酸。因此,通过核酸适配体的设计可以将富C序列修饰其上,进一步以富C为模板合成银纳米簇,而连接的核酸适配体可以实现IFN-γ的识别。
因此,尝试设计含有富C修饰的核酸适配体,用于银纳米簇的合成,并将其用于检测IFN-γ的电化学生物传感中的信号放大,制备成具有高灵敏度、高选择性和高稳定性的电化学生物传感器。这将对癌症、阿尔茨海默病以及COVID-19的发病程度提供技术支撑。
发明内容
基于现有技术,本发明提供了一种超灵敏、高选择性检测IFN-γ的电化学生物传感器;另一目的在于提供其制备方法。
为实现本发明目的,本发明以金纳米颗粒修饰的端氨基改性玻碳电极为基底电极,以原位合成的银纳米簇为信号探针,构建了一种用于IFN-γ超灵敏检测的电化学传感器。
具体采用以下技术方案:
(1)将洁净的玻碳面浸入烯丙基胺溶液中在254nm紫外下进行光化学反应。通过光化学加成过程使得玻碳表面产生大量氨基。将氨基改性电极浸入金胶溶液中反应过夜即可获得金纳米离子修饰的基底电极;
(2)将步骤(1)制得的基底电极浸入巯基化IFN-γ的富C适配体(末端修饰富C模板)溶液中室温孵育,适配体与金纳米粒子通过Au-S键进行结合后,用1-巯基己醇溶液对电极进行封闭,以消除非特异性结合位点;将制备好的修饰电极分别与不同浓度的IFN-γ在37℃下孵育,利用适配体对靶标物质的特异性实现对IFN-γ的特异性识别;
(3)将(2)中所得修饰电极浸入cDNA序列中于室温下进行自组装,基于碱基互补原则,过量的cDNA可以将未结合IFN-γ的适配体全部双链化;
(4)步骤(3)中改性电极置于双联剪切酶(DSN)溶液中进行充分剪切,可以将表面双链化适配体移除;
(5)向步骤(4)改性电极依次引入AgNO3溶液和NaBH4溶液,以适配体末端修饰富C为模板进行银纳米簇的原位合成。
应用时进行线性扫描伏安法测定,通过银纳米簇的氧化还原峰电流改变值与IFN-γ浓度的关系实现IFN-γ的定量测定。
进一步的,合成过程中富C适配体和cDNA浓度均为1μmol·L-1,DSN活性为80mU·μL-1。
进一步的,所述的IFN-γ核酸适配体-富C的序列是GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGT-CCCCTCAATCCC,利用其与IFN-γ的高亲和力和DSN酶高选择性筛选,可以提高对IFN-γ检测的选择性。
进一步的,进行了实验条件的优化,步骤(5)进行银纳米簇合成时AgNO3浓度为5mmol·L-1;NaBH4浓度为10mmol·L-1;测试过程中KCl浓度为1mol·L-1。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明制备的金纳米粒子修饰的端氨基改性玻碳基底具有较大的表面积,从而促进了电子传导,提供放大的电化学信号。
(2)本发明以富C为模板的银纳米簇作为信号探针,可以实现信号放大,从而使检测具有较高的灵敏性。
(3)本发明利用适配体对IFN-γ的高亲和力,IFN-γ可以高选择性的被捕获,DSN酶将特定形式适配体消解,排除未结合IFN-γ适配体对后续检测的干扰。通过适配体和DSN酶的双重选择保证了该传感策略的高特异性,并且过程中避免了昂贵的酶标抗体试剂的使用。
(4)本发明采用的基底电极和银纳米簇的电化学信号均具有很高的稳定性,使其具有高重复性和稳定性。
(5)本发明电化学传感器实现了IFN-γ的高灵敏、高选择性测定,检测限为1.7pg·mL-1,可用于细胞分泌液中IFN-γ的测定,对于判断癌症、阿尔茨海默病以及COVID-19的病情具有重要意义,是一种高灵敏度、高选择性和高稳定性的电化学生物传感器,具有很好的开发应用前景。
附图说明
图1是本发明技术路线图。
图2是本发明制备的基底电极表面金纳米粒子的扫描电子显微镜图(A-B),以及模板法化学还原生成的银纳米簇的透射电镜图(C-D)。
图3是对本发明电极各修饰阶段的交流阻抗(A)和循环伏安曲线(B)表征,图中(1)~(8)分别为裸玻碳电极、金纳米颗粒改性电极、适配体修饰电极、掩蔽剂封闭后的适配体修饰电极、识别IFN-γ后的适配体修饰电极、双链化后电极、酶切后修饰电极和银簇修饰的最终传感电极;电极表面修饰适配体前后的计时电量曲线(C),其中(1)和(2)分别代表适配体修饰后和修饰前的计时电量曲线;DSN酶剪切双联DNA的高效液相色谱曲线(D),(1)、(2)和(3)依次为所选双链DNA、经DSN酶剪切的双链DNA和单独的DSN酶的高效液相色谱图。
图4是本发明传感器在检测过程中不同浓度IFN-γ的电流响应曲线和该传感体系的工作曲线。
图5是本发明传感器的特异性实验,实验中以BSA、IFN-α、IFN-β、IgG、IL-6和TNF-α为干扰物质,测定了该传感器对于上述各物质的选择性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明,以下实施例仅用于说明本发明,但不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器的制备方法
(1)金纳米粒子在玻碳电极上的沉积:将清洁的玻碳电极浸泡在1mL烯丙基胺溶液中,在254nm紫外光照下反应12h;将氨基改性电极浸入金胶溶液中反应过夜获得金纳米粒子修饰的玻碳电极。所述金胶溶液为柠檬酸钠还原金溶胶用柠檬酸调节pH至4.0。
(2)适配体的固定及IFN-γ的识别:将金纳米粒子修饰的玻碳电极与8μL的1μmol·L-1富C改性巯基化适配体溶液共同孵育1h,然后用1mmol·L-1 1-己硫醇溶液封闭电极表面1h,制备得到适配体修饰传感器。将制备的传感器与含有不同浓度的IFN-γ共同孵育1h,然后用纯水冲洗电极。
(3)剪切前准备和DSN酶剪切:室温下,将过量的1μmol·L-1的cDNA引入到电极表面反应1h,使电极表面未结合靶标的适配体双链化;向电极表面引入5μL浓度为80mU·μL-1的DSN酶溶液进行剪切,减少非特异性信号来源。
(4)探针分子的原位合成:室温条件下,将5mmol·L-1的AgNO3溶液和10mmol·L-1的NaBH4溶液各5μL依次引入到电极表面,AgNO3处理10min;NaBH4孵化50min以上,确保电极表面银离子完全还原生成银纳米簇。
应用例1本发明生物电化学传感器对IFN-γ的测定
电位测试采用三电极体系,以本发明修饰后的电极作为工作电极,铂丝为对电极,Ag/AgCl为参比电极。在1mol·L-1KCl电解液溶液中,以100mV·s-1的扫速在-0.02~0.15V范围内进行线性扫描伏安法测试并记录传感器的伏安响应信号,通过测定不同浓度IFN-γ标准溶液,记录检测不同浓度IFN-γ标准溶液时电极银纳米簇氧化峰电流,以峰电流-浓度绘制标准曲线。在IFN-γ浓度为5~1000pg mL-1时,线性回归方程为Ip=3.56C+0.82(R=0.992);1~10ng mL-1范围内,得到线性回归方程为Ip=0.31C+3.61(R=0.998)。估算得出该传感器检测限为1.7pg·mL-1。说明此电化学生物传感器用于浓度IFN-γ标准溶液的测定具有较高的灵敏度。
实际血清样品测定时,根据峰电流响应,基于上述线性方程,可以确定所述人体血清中IFN-γ的浓度,从而实现定量检测。
应用例2本生物电化学传感器性能考察
这些结果表明电化学测定具有可接受的稳定性和可靠性。为了研究本发明传感器的稳定性,用同一传感器对1ng·mL-1的IFN-γ进行了8次重复测量,其电流响应的相对标准偏差值为1.64%。用6个独立的传感器检测IFN-γ进行了重复性试验,相对标准偏差值为5.23%。为了研究电化学测定的长期稳定性,通过检测在4℃冰箱中存放1个月后的伏安响应变化,伏安响应保持了初始信号响应的92.7%。结果表明,由于底物电极的稳定性和生物相容性的微环境,该方法具有较好的稳定性。此外,利用银纳米簇的电化学信号代替了不稳定的荧光发射信号,保证了长时间、稳定的检测应用。
为了证明其特异性,在其他干扰蛋白(如BSA、IFN-α、IFN-β、IgG、IL-6和TNF-α)存在的情况下监测了IFN-γ的电化学反应。如图5所示,观察到明显的伏安响应,而干扰分子的电流值比IFN-γ高10倍。在所有干扰物存在的情况下,响应变化小于3.3%,这表明设计的传感器对IFN-γ具有高选择性。该测定的高选择性可归因于适体识别探针对IFN-γ靶标的特异性结合能力。因此,这种电化学策略可以将IFN-γ与体液中的其他细胞因子和蛋白质区分开来。
应用例3血清样品中IFN-γ的测定
为评价电化学传感器检测IFN-γ的实用性,对健康人血清样品用标准加入法检测回收率。当IFN-γ的加入量分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0ng mL-1时,回收率在98.4%~102.7%之间,相对标准偏差小于5.4%。这些结果表明该电化学传感器具有良好的准确性,在临床诊断中具有实际应用潜力。
表1.人血清样品中IFN-γ的测定
应用例4细胞分泌液样品中IFN-γ的测定
为进一步研究电化学传感器对于IFN-γ检测的适用性,我们培养并刺激外周血单个核细胞(PBMC)以研究该发明对于细胞上清液中IFN-γ的检测准确性。利用ELISA试剂盒和该发明方法检测不同刺激时间下PBMC细胞上清液中IFN-γ含量,结果见表2。结果表明,ELISA方法与该发明检测结果无明显差异,进一步表明该方法可用于细胞因子的日常检测。
表2.细胞上清液中IFN-γ的检测
序 列 表
< 110> 商丘师范学院
<120>一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器
<160> 1
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> 富C的IFN-γ核酸适配体
<400> 1
ggggttggtt gtgttgggtg ttgtgtcccc tcaatccc 38
Claims (4)
1.一种IFN-γ细胞因子电化学适配体传感器,其特征在于,通过如下方法制备而成:
(1)制备金纳米粒子修饰的基底电极:将玻碳面浸入烯丙基胺溶液中,紫外光照下进行光化学反应,制备氨基改性玻碳电极;将氨基改性电极浸入金胶溶液中反应过夜获得金纳米粒子修饰的基底电极;
(2)核酸适配体的固定及细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的识别:将步骤(1)制得的金纳米粒子修饰的基底电极浸入到含富C模板的巯基化IFN-γ特异性适配体溶液中室温孵育,并用1-巯基己醇溶液对电极表面进行封闭,消除非特异性结合位点;在室温下,将制备好的修饰电极分别与不同浓度的IFN-γ溶液孵育,进行IFN-γ的识别;
(3)引入探针分子:室温下,将经步骤(2)处理过的修饰电极浸入到cDNA溶液中,进行自组装;
(4)步骤(3)中改性电极置于双链剪切酶溶液中进行剪切,将表面双链化适配体移除;
(5)向步骤(4)改性电极依次引入AgNO3溶液和NaBH4溶液,制得IFN-γ电化学生物传感器;
步骤(2)所述IFN-γ特异性适配体的DNA序列为:GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGT-CCCCTCAATCCC。
2.如权利要求1所述的IFN-γ细胞因子电化学适配体传感器,其特征在于:步骤(1)所述烯丙基胺光照法采用254 nm紫外光照12 h;金胶溶液pH为4.0。
3.如权利要求1所述的IFN-γ细胞因子电化学适配体传感器,其特征在于:步骤(2)所述含富C模板的巯基化核酸适配体固定时其浓度选择1 μmol·L-1。
4.如权利要求1-3其中之一所述的IFN-γ细胞因子电化学适配体传感器,其特征在于:步骤 (5) 进行银纳米簇合成时AgNO3浓度为5 mmol·L-1;NaBH4浓度为10 mmol·L-1。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210001613.1A CN114295703B (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210001613.1A CN114295703B (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114295703A CN114295703A (zh) | 2022-04-08 |
CN114295703B true CN114295703B (zh) | 2023-11-21 |
Family
ID=80975974
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210001613.1A Active CN114295703B (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114295703B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114740071B (zh) * | 2022-05-19 | 2024-02-20 | 中国石油大学(华东) | 酶电极、其制备方法及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09509323A (ja) * | 1994-02-23 | 1997-09-22 | リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | 疾患関連遺伝子の発現を阻害するための方法および試薬 |
CN106198673A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-12-07 | 青岛大学 | 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器 |
CN108152342A (zh) * | 2016-12-06 | 2018-06-12 | 南京科技职业学院 | 基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器 |
CN112816533A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-18 | 商丘师范学院 | 一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体传感器 |
-
2022
- 2022-01-04 CN CN202210001613.1A patent/CN114295703B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09509323A (ja) * | 1994-02-23 | 1997-09-22 | リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | 疾患関連遺伝子の発現を阻害するための方法および試薬 |
CN106198673A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-12-07 | 青岛大学 | 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器 |
CN108152342A (zh) * | 2016-12-06 | 2018-06-12 | 南京科技职业学院 | 基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器 |
CN112816533A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-18 | 商丘师范学院 | 一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体传感器 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
An amplified label-free electrochemical aptasensor of γ-interferon based on target-induced DNA strand transform of hairpin-to-linear conformation enabling simultaneous capture of redox probe and target;Hui Jin 等;Biosensors and Bioelectronics;第145卷;111732(1-8) * |
电化学适配体传感器的研究进展;孟凡飞;孟凡娜;熊琦;罗小舸;蒲晓允;;检验医学与临床(第21期);3303-3307 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114295703A (zh) | 2022-04-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Arkan et al. | A novel antibody–antigen based impedimetric immunosensor for low level detection of HER2 in serum samples of breast cancer patients via modification of a gold nanoparticles decorated multiwall carbon nanotube-ionic liquid electrode | |
Wang et al. | RNA aptamer-based electrochemical aptasensor for C-reactive protein detection using functionalized silica microspheres as immunoprobes | |
Ahmad et al. | An electrochemical sandwich immunosensor for the detection of HER2 using antibody-conjugated PbS quantum dot as a label | |
Ravalli et al. | New label free CA125 detection based on gold nanostructured screen-printed electrode | |
Jia et al. | Triple signal amplification using gold nanoparticles, bienzyme and platinum nanoparticles functionalized graphene as enhancers for simultaneous multiple electrochemical immunoassay | |
Nourani et al. | Magnetic nanoparticle-based immunosensor for electrochemical detection of hepatitis B surface antigen | |
Pal et al. | Graphene oxide layer decorated gold nanoparticles based immunosensor for the detection of prostate cancer risk factor | |
US20160061766A1 (en) | Electrochemical proximity assay | |
Qu et al. | A novel electrochemical immunosensor based on colabeled silica nanoparticles for determination of total prostate specific antigen in human serum | |
CN109490284B (zh) | 一种基于金纳米颗粒和二碳化钛MXenes的双重催化鲁米诺电化学发光生物传感器 | |
Shabani et al. | ZnO nanoparticle/nanorod-based label-free electrochemical immunoassay for rapid detection of MMP-9 biomarker | |
Li et al. | Conductive catalytic redox hydrogel composed of aniline and vinyl-ferrocene for ultrasensitive detection of prostate specific antigen | |
CN112816533A (zh) | 一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体传感器 | |
Miao et al. | Voltammetric determination of tumor necrosis factor-α based on the use of an aptamer and magnetic nanoparticles loaded with gold nanoparticles | |
Ahirwar | Recent advances in nanomaterials-based electrochemical immunosensors and aptasensors for HER2 assessment in breast cancer | |
US20090270266A1 (en) | Method for Electrocatalytic Protein Detection | |
Yang et al. | A reagentless amperometric immunosensor for human chorionic gonadotrophin based on a gold nanotube arrays electrode | |
Liao et al. | Hybridization chain reaction triggered poly adenine to absorb silver nanoparticles for label-free electrochemical detection of Alzheimer's disease biomarkers amyloid β-peptide oligomers | |
Kumar et al. | Electrochemical detection: Cyclic voltammetry/differential pulse voltammetry/impedance spectroscopy | |
CN114295703B (zh) | 一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器 | |
Zhang et al. | A sandwich-type electrochemical immunosensor using trimetallic nanozyme as signal amplification for NT-proBNP sensitive detection | |
Li et al. | Electrochemical sensors applied for in vitro diagnosis | |
Yang et al. | The preparation of reagentless electrochemical immunosensor based on a nano-gold and chitosan hybrid film for human chorionic gonadotrophin | |
Zheng et al. | A simple electrochemical aptasensor for saxitoxin detection | |
Yaiwong et al. | A new portable toluidine blue/aptamer complex-on-polyethyleneimine-coated gold nanoparticles-based sensor for label-free electrochemical detection of alpha-fetoprotein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |