CN106442479B - 纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法 - Google Patents
纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106442479B CN106442479B CN201610772576.9A CN201610772576A CN106442479B CN 106442479 B CN106442479 B CN 106442479B CN 201610772576 A CN201610772576 A CN 201610772576A CN 106442479 B CN106442479 B CN 106442479B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pbpe
- pathogenic bacteria
- bipolar electrode
- paper base
- genetic test
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 title claims abstract description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N Phenanthrene Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 claims description 13
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 101100378273 Brachyspira hyodysenteriae acpP gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100098690 Listeria monocytogenes serovar 1/2a (strain ATCC BAA-679 / EGD-e) hly gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150021605 hlyA gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011898 label-free detection Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 239000002585 base Substances 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 description 3
- 241001646719 Escherichia coli O157:H7 Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 3
- YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N tripropylamine Chemical compound CCCN(CCC)CCC YFTHZRPMJXBUME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004411 aluminium Substances 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- BVQAWSJMUYMNQN-UHFFFAOYSA-N dipyridophenazine Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=CC=C4N=C3C3=CC=CN=C3C2=N1 BVQAWSJMUYMNQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 239000011263 electroactive material Substances 0.000 description 2
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 2
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000004204 optical analysis method Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical compound CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000010146 3D printing Methods 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000011532 electronic conductor Substances 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000007641 inkjet printing Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000005622 photoelectricity Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- WCYJXDMUQGVQQS-UHFFFAOYSA-N pyridine;ruthenium Chemical compound [Ru].C1=CC=NC=C1 WCYJXDMUQGVQQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940048102 triphosphoric acid Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/305—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells optically transparent or photoresponsive electrodes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法。该方法为:将致病细菌的靶毒力基因的DNA分子片段与含有“光开关”分子和TPrA的PBS溶液进行混合,得到混合液;然后将混合液滴到pBPE上;将pBPE正面朝向PMT,然后将该pBPE放置到暗盒里;最后,将pBPE的一对驱动电极连接到直流电源上,施加驱动电压;在pBPE的阳极获得一个ECL信号,将在10s内观察到的最大的可再现的发光信号作为有效的信号值,即实现快速灵敏基因检测致病菌的目的。该方法利用分子开关的性质,可达到非标记检测的目的;灵敏度高;成本低;检测装置的构建更简便。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,特别涉及一种纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法。
背景技术
基因检测是检测致病菌非常重要的一种方法。各种策略和技术,如实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR),基于核酸序列的扩增(NASBA),和环介导等温扩增(LAMP)法等,已开发用以检测目标病原体的特征基因,并已被用作中央研究实验室的标准方法。然而,这些传统的方法通常费力和耗时。随着生物传感技术的发展,某些光学分析方法,包括比色法,荧光光谱法,化学发光法和电化学发光(ECL)的发展已被开发来解决这些问题。电化学发光(ECL)是结合电化学和化学发光为一体的方法,它作为最灵敏的光学分析技术之一,因为其显着的优点,其中包括高信噪比(SNR),高灵敏度和空间可控性,吸引了研究者相当大的兴趣。我们的团队近十年来一直利用ECL进行基因检测。不幸的是,我们发现,这样的方法通常需要复杂的探针设计和有线电源,这限制了它在资源极其有限的环境中的床旁诊断(POCT)应用。
双极性电极作为一种导体,一般置于溶液的微管道中,当微管道两端施加电压时,溶液和双极性电极之间电势的差别,使其一端成阳极,另一端为阴极,若外加电场足够大,电活性物质会分别在阳极和阴极发生氧化和还原反应。在过去的十年中,双极性电极无需导线连接的性质使得它与ECL相结合,已经催生了一个有前途的只需要用一个直流电源控制的新的检测方法。一个典型的双极型电极电化学发光(BPE-ECL)检测系统通常使用三联吡啶钌作为ECL发光体和三丙胺(TPrA)作为共反应剂。在这种策略中,其阳极发生氧化并发出较强的ECL信号,同时氧气或其他电活性物质在阴极发生还原。与由一个工作电极,辅助电极,和参考电极构成的传统的三电极ECL结构相比,BPE-ECL系统已被证明是灵敏度高,并且双极性电极和外加电源之间无需导线相连,故该检测装置的构建更简便。此外,该系统可以提供一种潜在适于小型化应用的方法。
然而,传统的BPE-ECL检测系统通常使用复杂和相当昂贵的微流控技术,将检测腔室集成为微流控芯片。此外,这些技术需要昂贵的仪器或熟练的技术人员,这限制了它在床旁诊断中的应用。
纸基微流控分析装置(μPADs)满足床旁诊断的ASSURED的标准(即,价格便宜,灵敏度高,特异性好,人性化,快速稳定,不需要昂贵的设备和终端用户使用方便),作为强大的工具在最近几年受到了越来越多的关注。μPADs利用纸张提供的毛细作用达到定量和空间控制生物流体的目的,而不需要外部开关或泵,并且可以使用喷墨打印,蜡印或丝网印刷技术制作μPADs。简单地说,纸基微流控装置可以被视为常规微流控芯片的变种或经典侧向流动试纸条的升级版本。
但是,在纸上标记探针面临一些挑战,如需要昂贵探针标记物和难以去除非特异性结合的探针,从而导致相对高的背景信号。此外,大多数纸基检测通常基于比色法,而当分析物的浓度较低,所使用的定量或半定量分析达不到高灵敏度检测的要求。由于这些原因,纸基ECL基因检测方法的应用较少。为了克服这些挑战,必须开发一种更灵敏的,便宜的,定量和无标记的基因检测致病微生物的方法。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法,包括如下步骤:
将致病细菌的靶毒力基因的DNA分子片段与含有“光开关”分子和TPrA的PBS溶液进行混合,得到混合液;然后将混合液滴到纸基双极性电极(pBPE)上;将pBPE正面朝向光电倍增管(PMT),然后将该pBPE放置到暗盒里;最后,将pBPE的一对驱动电极连接到一个直流电源上,施加驱动电压;在pBPE的阳极获得一个ECL信号,将在10s内观察到的最大的可再现的发光信号作为有效的信号值,即可实现快速灵敏基因检测致病菌的目的。
所述的致病细菌优选为致病性李斯特菌、致病性大肠杆菌、致病性沙门氏菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、志贺氏杆菌(Shigella)、空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)或金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(CMCC 26003)。
所述的致病性李斯特菌优选为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)(CMCC54007);
所述的致病性大肠杆菌优选为大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)(GW1.0202);
所述的致病性沙门氏菌优选为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)(CMCC54007);
所述的单增李斯特菌的靶毒力基因hlyA特异性的引物如下:
上游引物:5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3';
下游引物:5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。
所述的“光开关”分子为[Ru(bpy)2dppz]2+或[Ru(phen)2dppz]2+,浓度优选为30μM~0.1mM;更优选为0.1mM;
所述的TPrA的浓度优选为10mM~50mM。更优选为50mM;
所述的PBS溶液为pH=6.9、0.1M的PBS溶液;
所述的驱动电压设定为850V。
所述的纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法,具体包括如下步骤:
(1)细菌DNA提取和PCR扩增
将1mL菌种置于10mL LB培养基中过夜培养12h,然后按照TIANamp细菌DNA试剂盒的试剂和说明书的方法提取细菌DNA,最后重悬在50μL的TE缓冲液中备用;取1μL提取的细菌DNA和一对单增李斯特菌靶毒力基因hlyA特异性的引物加入反应体积为25μL的PCR扩增体系中,按照设定的PCR扩增程序,在热循环PCR仪中进行扩增,扩增得到的产物的长度为179bp;PCR产物最后用pBPE-ECL系统进行分析。
(2)纸基双极性电极的制作
丝网印刷的网板的图案形状用Adobe Illustrator CS6设计,然后制作成网板(铝框200目尼龙网板);网板的开口产生纸的疏水区域,而具有交联光敏材料的部分,则得到亲水性的区域;用蜡印的方法产生亲水的通道,然后用丝网印刷的方法将导电碳油墨在纸通道上制作双极性电极和驱动电极;纸基双极性电极的制作过程如下:首先,将滤纸裁剪成合适的尺寸(100毫米×80毫米),并在纸张上通过网板丝网印刷上碳电极,然后置于100℃的烘箱8分钟,并将其冷却到室温;然后,将纸基电极置于纸张通道丝网膜的下方,将固体蜡通过丝网膜擦到纸张上;为了让更多的固体蜡印到纸上,用光滑的勺状的金属器具进一步按压丝网膜;纸被蜡印之后,和网板一起置于加热板上,并加热至80℃,约10秒,以将蜡熔化进纸,以形成疏水屏障。
(3)pBPE-ECL检测
纸基双极性电极制作完成后,将步骤(1)中的PCR产物进行pBPE-ECL检测;首先,将所制备的pBPE裁剪成单个,置于一个3D打印的一对塑料衬底中组装成芯片;然后,将含有5μL上述PCR扩增产物的溶液与在0.1M的PBS(pH为6.9)中制备的含有[Ru(phen)2dppz]2+和TPrA的混合液定容至25μL,将混合液滴到pBPE的中心。将滴加溶液后的pBPE翻转,确保pBPE正面朝向PMT,然后将该pBPE芯片放置到暗盒里。最后,将芯片的一对驱动电极连接到一个直流电源上通电之前,需要等待30~60s,以确保整个纸基芯片的通道被溶液浸润。接着,施加适当的驱动电压。之后约5s,在pBPE的阳极可以获得一个ECL信号。
(4)数据采集和分析
由光电倍增管收集的pBPE阳极的ECL信号被PMT放大,模拟信号被晶体管-晶体管逻辑(TTL)识别,并使用由LabView软件程序控制的多功能采集卡(PCI-1751,研华,台湾)进行采集,最终用基于Labview的光子计数的计算机程序记录,并用于进一步的分析;在实验中观察到的ECL信号不是一个稳定的数值,实际上随着时间衰减,这种现象可是由于发光体的不可逆的分解造成的;实验中,我们将在10s内观察到的最大的可再现的发光信号作为有效的信号值。
步骤(1)中所述的PCR扩增体系包含:终浓度0.2U/μL的Taq DNA聚合酶,不同浓度的靶DNA(106copies/μL,105copies/μL,104copies/μL,103copies/μL,102copies/μL和10copies/μL),0.2mM的dNTP,1×PCR缓冲液,和40nM的每种引物(即上游引物和下游引物)。空白对照则不包含DNA模板。
步骤(1)中所述的序列如下:
上游引物:5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3';
下游引物:5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。
步骤(1)中所述的PCR扩增程序为:首先95℃下变性5分钟;循环条件如下:变性95℃30秒,退火56℃30秒,和72℃延伸40秒,上述程序总共进行35个循环;最后延伸8分钟。
步骤(3)中所述的[Ru(phen)2dppz]2+和TPrA的浓度分别优选为30μM~0.1mM和10mM~50mM。
步骤(4)中所述的光电倍增管的电压设定为850V。
本发明的基本原理如图1所示:
在这项研究中,我们首次利用纸质双极性电极电化学发光(pBPE-ECL)结合“光开关”分子[Ru(phen)2dppz]2+(phen=1,10-菲咯啉;dppz=dipyridophenazine)开发了一种低成本,无线,灵敏度高和无标记的致病细菌DNA分析方法。[Ru(phen)2dppz]2+已经发现可以以高亲和力插入DNA的碱基对中,并通过三联体金属配体电荷转换(MLCT)的三重激发态产生一个ECL信号。该方法的检测原理是基于[Ru(phen)2dppz]2+同时具备“分子光开光”和能发生电化学发光的两个性质,它在在溶液状态下,水分子通过氢键与嵌入配位体的吩嗪氮原子连接,使得吩嗪氮原子质子化,导致三联体金属配体电荷转换(triplet metal-to-ligand charge transfer,MLCT)激发态失活,从而使得[Ru(phen)2dppz]2+不发生电化学发光反应;然而当将DNA加入到该复合物的溶液中以后,平面的配位体嵌入双螺旋DNA分子“大沟”部位的碱基对之间,使吩嗪氮原子受到了保护,三联体金属配体处于激发态,可以和三丙胺(TPrA)发生氧化还原反应,并释放出光子,从而可以观察到显著的电化学发光。这种pBPE-ECL装置通过蜡印制作亲水通道,通过丝网印刷制作碳墨BPE作为电子导体加上另外两个碳墨电极作为驱动电极。一对李斯特菌特异性靶向hlyA毒力基因的引物被用于聚合酶链反应(PCR),以产生双链DNA(dsDNA)的扩增产物。“光开关”分子[Ru(phen)2dppz]2+被用来以插入PCR扩增产物双链DNA的碱基对中,然后将其直接滴加到pBPE-ECL上进行ECL检测。在优化的实验条件下,低至10copies/μL单增李斯特菌的基因组DNA的可以被检测出来。该装置也被用来从鼠伤寒沙门氏菌,大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌中特异性区分单增李斯特菌。因为该设备构造简单,一次性的,快速,低成本,无标记并具有灵敏度高的优势,如果将来以电池作为电源和智能手机作为信号读出,这种pBPE-ECL分子开关系统具有在发展中国家或者在资源有限的偏远地区用于床旁基因检测病原菌的巨大潜力。
本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果:
(1)该方法利用分子开关的性质,可以达到非标记检测的目的;
(2)该纸基双极性电极电化学发光系统灵敏度高;
(3)该纸基双极性电极为一次性可抛弃芯片,成本低;
(4)双极性电极和外加电源之间无需导线相连,故该检测装置的构建更简便。
附图说明
图1是纸基双极性电极电化学发光分子开关系统的检测原理;
图2是纸基双极性电极的尺寸;
图3是纸基双极性电极的制作过程示意图;
图4是纸基双极性电极电化学发光分子开关系统的灵敏度分析;
图5是纸基双极性电极电化学发光分子开关系统的特异性分析。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.细菌DNA提取和PCR扩增
鼠伤寒沙门氏菌(CMCC 50040),大肠杆菌(O157:H7GW1.0202),单增李斯特菌(CMCC 54007)和金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)购自微生物学(中国,广州)广州研究所。引物由上海生工(上海,中国)合成。PCR扩增试剂,包括10×PCR缓冲液(加Mg2+),三磷酸脱氧核苷酸(的dNTP)混合物和Taq DNA聚合酶均从宝生物工程有限公司(大连,中国)购买。SYBRGreen I染料从赛百盛基因有限责任公司(中国,北京)购买。DSTM 2000 DNA marker,其中包含2000-,1000-,750-,500-,250-和100bp的DNA片段,是由东胜生物科技有限公司(中国,广州)提供。按照TIANamp细菌DNA试剂盒的试剂和说明书的方法提取细菌DNA,然后重悬在50μL的TE缓冲液。PCR扩增反应体积为25μL体系,包含:终浓度0.2U/μL的Taq DNA聚合酶,不同浓度的靶DNA(106copies/μL,105copies/μL,104copies/μL,103copies/μL,102copies/μL和10copies/μL),0.2mM的dNTP,1×PCR缓冲液,和40nM的每种引物(即,上游引物和下游引物)。空白对照则不包含DNA模板。李斯特菌靶毒力基因hlyA的PCR扩增产物的长度为179碱基对。所述序列如下:
上游引物:5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3';
下游引物:5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。
PCR反应在热循环PCR仪中进行,PCR扩增程序为:首先95℃下变性5分钟。循环条件如下:变性95℃30秒,退火56℃30秒,和72℃延伸40秒。上述程序总共进行35个循环。最后延伸8分钟。PCR产物最后用pBPE-ECL系统进行分析。
2.pBPE的制作
滤纸(Ф=125.0毫米,纤维素滤纸)从杭州沃华滤纸有限公司(中国浙江)购买,适当裁剪以后使用。导电碳油墨购自徐州博汇新材料科技有限公司(中国徐州)(型号CNB-7,<60Ω/cm2),将其用于驱动电极的制作材料)。固体蜡和光滑匙状的金属器皿购自当地百货公司。用蜡印的方法产生亲水的通道,然后用丝网印刷的方法将导电碳油墨在纸通道上制作双极性电极和驱动电极。丝网印刷的图案形状用Adobe Illustrator CS6设计,然后交付给广州联昌印刷器材店制作网板(铝框200目尼龙网板)。网板的开口产生纸的疏水区域,而具有交联光敏材料的部分,则得到亲水性的区域。pBPE芯片的制作过程(见图3所示)如下:首先,将滤纸裁剪成合适的尺寸(100毫米×80毫米),并在纸张上通过网板丝网印刷上碳电极,然后置于100℃的烘箱8分钟,并将其冷却到室温。然后,将纸基电极置于纸张通道丝网膜的下方,将固体蜡通过丝网膜擦到纸张上。为了让更多的固体蜡印到纸上,用光滑的勺状的金属器具进一步按压丝网膜。纸被蜡印之后,和网板一起置于加热板上,并加热至80℃,约10s,以将蜡熔化进纸,以形成疏水屏障;得到纸质双极性电极。所述的纸质双极性电极的尺寸见图2所示。
3.pBPE-ECL检测
TPrA(≥98%,编号:102-69-2)从Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,密苏里州,美国)购买。芯片制作完成后,进行pBPE-ECL检测。首先,将所制备的pBPE裁剪成单个,置于一个3D打印的一对塑料衬底中组装成芯片,然后将芯片的一对驱动电极连接到一个直流电源上。最后,将含有5μL上述PCR扩增产物的溶液与在0.1M的PBS(pH为6.9)中制备的含有0.1mM[Ru(phen)2dppz]2+和50mM TPrA的混合液定容至25μL,将混合液滴到pBPE的中心。将滴加溶液后的pBPE翻转,确保pBPE正面朝向PMT,然后将该pBPE芯片放置到暗盒里。通电之前,需要等待30~60s,以确保整个纸基芯片的通道被溶液浸润。接着,施加适当的驱动电压。之后约5s,在pBPE的阳极可以获得一个ECL信号。
4.数据采集和分析
直流电源(型号LW-K605D)从龙威仪表仪器有限公司(中国香港)购买。光电倍增管的电压(PMT;MP-962型,Perkin Elmer公司,威斯巴登,德国)设定为850V。由光电倍增管收集的ECL信号被PMT放大,模拟信号被晶体管-晶体管逻辑(TTL)识别,并使用由LabView软件程序控制的多功能采集卡(PCI-1751,研华,台湾)进行采集,最终用基于Labview的光子计数的计算机程序记录,并用于进一步的分析。在实验中观察到的ECL信号不是一个稳定的数值,实际上随着时间衰减,这种现象可是由于发光体的不可逆的分解造成的。实验中,我们将在10s内观察到的最大的可再现的发光信号作为有效的信号值。
为了验证我们的新开发的pBPE-ECL检测系统的灵敏度,将不同浓度的李斯特菌DNA(106copies/μL,105copies/μL,104copies/μL,103copies/μL,102copies/μL和10copies/μL)分别加入PCR扩增体系中进行扩增。扩增后的DNA产物然后分别用0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+和50mM TPrA孵育,来评估pBPE-ECL检测系统的灵敏度。如图4所示,ECL强度随着DNA浓度从10copies/μL到106copies/μL的增加而呈线性增加的趋势。不同浓度靶DNA和阴性对照的最大ECL发光信号如图所示。这表明该系统能够高灵敏度地检测单增李斯特菌。
为了进一步验证pBPE-ECL检测系统的特异性,将从单增李斯特菌,鼠伤寒沙门氏菌,大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌中提取的106copies/μL靶DNA与之前使用的单增李斯特菌相同的特异性引物分别加入PCR扩增体系中进行PCR扩增。扩增后的DNA产物然后分别用0.1mM的[Ru(phen)2dppz]2+和50mM TPrA孵育,来评估pBPE-ECL检测系统的特异性。如图5所示,只有单增李斯特菌特异性扩增得到的PCR产物结合[Ru(phen)2dppz]2+以后表现出显著的ECL信号。鼠伤寒沙门氏菌,大肠杆菌O157:H7,金黄色葡萄球菌和对照组表示没有双链PCR产物产生,所以ECL信号较低。这些结果证实,所设计的pBPE-ECL检测系统可以在鼠伤寒沙门氏菌,大肠杆菌O157:H7,金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌中特异性区分出单增李斯特菌。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法,其特征在于包括如下步骤:
将致病细菌的靶毒力基因的DNA分子片段与含有“光开关”分子和TPrA的PBS溶液进行混合,得到混合液;然后将混合液滴到pBPE上;将pBPE正面朝向PMT,然后将该pBPE放置到暗盒里;最后,将pBPE的一对驱动电极连接到直流电源上,施加驱动电压;在pBPE的阳极获得一个ECL信号,将在10s内观察到的最大的可再现的发光信号作为有效的信号值,即实现快速灵敏基因检测致病菌的目的;
所述的致病细菌为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes);
所述的单增李斯特菌的靶毒力基因hlyA特异性的引物如下:
上游引物:5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3';
下游引物:5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3';
所述的“光开关”分子为[Ru(phen)2dppz]2+;
所述的“光开关”分子的浓度为30μM~0.1mM;
所述的驱动电压设定为850V。
2.根据权利要求书1所述的纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法,其特征在于:
所述的TPrA的浓度为10mM~50mM。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610772576.9A CN106442479B (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610772576.9A CN106442479B (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106442479A CN106442479A (zh) | 2017-02-22 |
CN106442479B true CN106442479B (zh) | 2019-10-22 |
Family
ID=58090811
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610772576.9A Active CN106442479B (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106442479B (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108553754A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-09-21 | 东莞福哥电子有限公司 | 一种亲水性电极片及其制作方法 |
CN110146495A (zh) * | 2019-05-13 | 2019-08-20 | 青海大学 | 一种微量爆炸物与毒品快速检测装置 |
CN110129188B (zh) * | 2019-06-05 | 2022-09-20 | 济南大学 | 一种整合式核酸检测装置 |
CN110220951B (zh) * | 2019-07-03 | 2020-12-11 | 济南大学 | 一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法 |
CN110982878B (zh) * | 2019-11-29 | 2023-06-13 | 华南师范大学 | CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用 |
CN112964702A (zh) * | 2021-02-08 | 2021-06-15 | 南京工业大学 | 基于可视化多色电化学发光技术快速检测沙门氏菌的方法 |
CN112964701B (zh) * | 2021-02-08 | 2022-05-13 | 南京工业大学 | 基于可视化bpe-ecl技术检测大肠杆菌的方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101768625A (zh) * | 2010-02-23 | 2010-07-07 | 厦门大学 | 致病菌的检测方法 |
CN101892294A (zh) * | 2010-01-22 | 2010-11-24 | 华南师范大学 | 基于磁珠电化学发光基因传感器检测汞离子的方法及应用 |
CN102220417A (zh) * | 2011-04-21 | 2011-10-19 | 华南师范大学 | 基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法 |
CN102816855A (zh) * | 2012-09-03 | 2012-12-12 | 华南师范大学 | 基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测食品致病菌的方法及试剂盒 |
CN104655617A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-05-27 | 宁波大学 | 用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 |
CN105300963A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-02-03 | 宁波大学 | 用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE329888T1 (de) * | 2002-01-04 | 2006-07-15 | Koninkl Philips Electronics Nv | Gesinterte formkörper und elektrische lampe |
EP2780709A2 (en) * | 2011-11-16 | 2014-09-24 | UES, Inc. | Pathogen detection using metal enhanced fluorescence |
-
2016
- 2016-08-30 CN CN201610772576.9A patent/CN106442479B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101892294A (zh) * | 2010-01-22 | 2010-11-24 | 华南师范大学 | 基于磁珠电化学发光基因传感器检测汞离子的方法及应用 |
CN101768625A (zh) * | 2010-02-23 | 2010-07-07 | 厦门大学 | 致病菌的检测方法 |
CN102220417A (zh) * | 2011-04-21 | 2011-10-19 | 华南师范大学 | 基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法 |
CN102816855A (zh) * | 2012-09-03 | 2012-12-12 | 华南师范大学 | 基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测食品致病菌的方法及试剂盒 |
CN104655617A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-05-27 | 宁波大学 | 用于检测海洋致病菌的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 |
CN105300963A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-02-03 | 宁波大学 | 用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
In Situ Hybridization Chain Reaction Amplification for Universal and Highly Sensitive Electrochemiluminescent Detection of DNA;Ying Chen.etal;《Analytical Chemistry》;20120827;第84卷;第7750-7755页 * |
Open bipolar electrode-electrochemiluminescence imaging sensing using paper-based microfluidics;Rui Liu.etal;《Sensors and Actuators B: Chemical》;20150416;第216卷;第255-262页 * |
Portable and Visual Electrochemical Sensor Based on the Bipolar Light Emitting Diode Electrode;Xiaowei Zhang.etal;《Analytical Chemistry》;20150415;第87卷;第4612-4616页 * |
Rapid and sensitive detection of Vibrio parahaemolyticus in sea foods by electrochemiluminescence polymerase chain reaction method;Jie Wei.etal;《Food Chemistry》;20101231;第123卷;第852-858页 * |
基于特征基因识别的食源性致病微生物快速检测技术新进展;朱啸等;《科学通报》;20131231;第58卷(第11期);第961-971页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106442479A (zh) | 2017-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106442479B (zh) | 纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法 | |
Zhang et al. | Visual detection for nucleic acid-based techniques as potential on-site detection methods. A review | |
Li et al. | Nucleic acid tests for clinical translation | |
Luo et al. | Based lateral flow strip assay for the detection of foodborne pathogens: principles, applications, technological challenges and opportunities | |
Zhang et al. | Application of multiplexed aptasensors in food contaminants detection | |
Li et al. | Development of mercury (II) ion biosensors based on mercury-specific oligonucleotide probes | |
Zhou et al. | CRISPR/Cas12a based fluorescence-enhanced lateral flow biosensor for detection of Staphylococcus aureus | |
CN104004850B (zh) | 一种纸基微流控芯片增强型化学发光基因传感方法 | |
CN105899947A (zh) | 分析测试装置、试剂盒和使用方法 | |
Tian et al. | A new label-free and turn-on strategy for endonuclease detection using a DNA–silver nanocluster probe | |
Luo et al. | Ultrasensitive biosensing pathogenic bacteria by combining aptamer-induced catalysed hairpin assembly circle amplification with microchip electrophoresis | |
Wu et al. | A novel recyclable surface-enhanced Raman spectroscopy platform with duplex-specific nuclease signal amplification for ultrasensitive analysis of microRNA 155 | |
Hua et al. | Rapid detection of miRNA via development of consecutive adenines (polyA)-based electrochemical biosensors | |
Xu et al. | Novel rolling circle amplification biosensors for food-borne microorganism detection | |
CN106755358B (zh) | 多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法 | |
Liu et al. | A label-free sensitive method for membrane protein detection based on aptamer and AgNCs transfer | |
Khalil et al. | DNA/Nano based advanced genetic detection tools for authentication of species: Strategies, prospects and limitations | |
Wei et al. | A novel multiplex signal amplification strategy based on microchip electrophoresis platform for the improved separation and detection of microRNAs | |
Hua et al. | A specially designed DNA-assembled framework structure probe coupled with loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-DNA signal transducer for rapid and sensitive electrochemical detection of miRNA | |
Wu et al. | A universal CRISPR/Cas9-based electrochemiluminescence probe for sensitive and single-base-specific DNA detection | |
Wen et al. | DNA based click polymerization for ultrasensitive IFN-γ fluorescent detection | |
Yang et al. | Electrogenerated chemiluminescence biosensor for microRNA detection incorporating enzyme-free dual DNA cyclic amplification and Ru (bpy) 32+-functionalized metal-organic framework | |
Fu et al. | Lateral flow strip biosensor based on streptavidin-coated gold nanoparticles with recombinase polymerase amplification for the quantitative point-of-care testing of Salmonella | |
Wang et al. | Allosteric probe-triggered isothermal amplification to activate CRISPR/Cas12a for sensitive electrochemiluminescence detection of Salmonella | |
Pareek et al. | Nitrogen-doped carbon dots for selective and rapid gene detection of human papillomavirus causing cervical cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |