CN101768625A

CN101768625A - 致病菌的检测方法

Info

Publication number: CN101768625A
Application number: CN201010115955A
Authority: CN
Inventors: 吴丽娜; 黄婷婷; 潘建波; 颜晓梅
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2010-02-23
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2010-07-07

Abstract

致病菌的检测方法，涉及一种病原微生物检测方法。提供一种致病菌的检测方法，该检测方法利用基因改造的噬菌体简单、快速、灵敏、特异地鉴别致病菌。设计并合成具有粘性末端的编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；将编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地连于噬菌体衣壳蛋白的表达调控序列中，形成四半胱氨酸重组噬菌体；用重组噬菌体侵染宿主细胞，并在其中繁殖，生成带有表达四半胱氨酸重组噬菌体的重组细胞；在重组细胞中加入双砷染料，经洗涤去除非特异性结合后，被重组噬菌体特异识别侵染的细菌，在激发光照射下可发出特异荧光，经流式细胞仪或荧光显微镜进行特异性检测。

Description

致病菌的检测方法

技术领域

本发明涉及一种病原微生物检测方法，尤其是涉及一种双砷染料-四半胱氨酸重组噬菌体对致病菌进行快速鉴别诊断的方法和应用。

背景技术

快速、灵敏、特异的致病菌检测分析对食品安全、环境监测、疾病诊断治疗和生物恐怖袭击的防范等具有重要意义。传统的病原微生物检测方法需要对细菌进行分离、培养及一系列生化反应，操作复杂、检测周期长，且无法适用于难以培养的病原菌，远不能满足实际需求([1]Iqbal，S.S.，et al.，A review of molecular recognition technologies for detection of biologicalthreat agents.Biosens Bioelectron，2000.15(11-12)：549-578；[2]Deisingh，A.K.and M.Thompson，Strategies for the detection of Escherichia coli O157：H7 in foods.J Appl Microbiol，2004.96(3)：419-429)。近年来，运用分子生物学及生物技术的最新研究成果，科研人员发展了一系列新的细菌快速检测技术，如PCR相关技术、基因芯片技术、ELISAs技术、噬菌体鉴定技术、流式细胞检测技术和生物传感技术等等([3]Hahn，M.A.，J.S.Tabb，and T.D.Krauss，Detectionof single bacterial pathogens with semiconductor quantum dots.Anal.Chem.，2005.77(15)：4861-4869；[4]Czechowska，K.，D.R.Johnson，and J.R.van der Meer，Use of flow cytometricmethods for single-cell analysis in environmental microbiology.Curr Opin Microbiol，2008.11(3)：205-212；[5]Karo，O.，et al.，Bacteria detection by flow cytometry.Clin Chem Lab Med，2008.46(7)：947-953.)。其中，流式细胞术(flow cytometry，FCM)因其具有检测速度快、精度高和多参数分析等特点，在细菌检测和鉴定方面独具优势，已成为产品质量控制、细菌致病机理以及微生物群落结构研究的重要手段([4]Czechowska，K.，D.R.Johnson，and J.R.van der Meer，Use of flow cytometric methods for single-cell analysis in environmental microbiology.Curr OpinMicrobiol，2008.11(3)：205-212)。例如，通过对细菌的核酸或蛋白进行荧光标记，FCM可以快速、准确地检测样本中的细菌总数、活菌数目和死菌数目。随着技术的不断改进，流式技术在细菌检测方面的成功应用层出不穷，Hammes等([6]Hammes，F.，et al.，Flow-cytometrictotal bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatmentprocesses.Water Res，2008.42(1-2)：269-277)用FCM快速检测饮用水中污染的细菌数量，灵敏度比传统的平板培养法高出两个数量级；Burney等([7]Berney，M.，et al.，Assessment andinterpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flowcytometry.Appl Environ Microbiol，2007.73(10)：3283-3290)用FCM通过LIVE/DEAD荧光试剂盒鉴定了多种细菌的生理性能；流式细胞技术结合荧光原位杂交可以识别特定的核苷酸靶标，已被应用于基于16S rRNAs的细菌特异性识别及筛选表达特异mRNA的细菌([8]Jen，C.J.，et al.，Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solidbio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target.Appl Microbiol Biotechnol，2007.74(5)：1126-1134；[9]Kalyuzhnaya，M.G.，et al.，Fluorescence in situ hybridization-flowcytometry-cell sorting-based method for separation and enrichment of type I and type IImethanotroph populations.Appl Environ Microbiol，2006.72(6)：4293-4301)。

致病菌的快速、灵敏检测将为食品安全、环境监测、疾病的诊断与治疗等提供重要科学依据。建立在抗体特异性识别基础上的免疫分析方法是致病菌特异检测的传统方法，然而特异性的单克隆抗体不仅价格昂贵，重复性不高，而且难以获取。自然界中存在着数量众多、种类各异的噬菌体为致病菌的特异性检测提供了一个天然的宝库。噬菌体能在活的具有感受性的菌体内繁殖，并且每种细菌基本上都有特异的噬菌体。基于噬菌体的寄生专一性以及生长速度快等特点，近年来发展了一些噬菌体检测特定致病菌的方法：如噬菌斑法检测结核分支杆菌技术([10]McNerney，R.，et al.，Development of a bacteriophage phage replication assayfor diagnosis of pulmonary tuberculosis.J Clin Microbiol，2004.42(5)：2115-2210)；荧光标记噬菌体结合免疫磁性分离法检测大肠杆菌O157：H7([11]Goodridge，L.，J.Chen，and M.Griffiths，The use of a fluorescent bacteriophage assay for detection of Escherichia coli O157：H7 ininoculated ground beef and raw milk.Int J Food Microbiol，1999.47(1-2)：43-50；[12]Goodridge，L.，J.Chen，and M.Griffiths，Development and characterization of a fluorescent-bacteriophageassay for detection of Escherichia coli O157：H7.Appl Environ Microbiol，1999.65(4)：1397-1404)；基于噬菌体的电化学方法([13]Neufeld，T.，et al.，Combined phage typing andamperometric detection of released enzymatic activity for the specific identification andquantification of bacteria.Anal Chem，2003.75(3)：580-585)；荧光素酶报告的分枝杆菌噬菌体和李斯特噬菌体检测法([14]Banaiee，N.，et al.，Luciferase reporter mycobacteriophages fordetection，identification，and antibiotic susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis inMexico.J Clin Microbiol，2001.39(11)：3883-3888；[15]Loessner，M.J.，et al.，Construction ofluciferase reporter bacteriophage A511：：luxAB for rapid and sensitive detection of viable Listeriacells.Appl Environ Microbiol，1996.62(4)：1133-1140)；检测由噬菌体介导的细菌裂解后释放的酶(如腺苷酸激酶)([16]Blasco，R.，et al.，Specific assays for bacteria using phage mediatedrelease of adenylate kinase.JAppl Microbiol，1998.84(4)：661-666)；利用噬菌体对沙门氏菌和大肠杆菌O157：H7等进行检测，从标本收集到结果读取仅需3～5h([17]Ulitzur，N.and S.Ulitzur，New rapid and simple methods for detection of bacteria and determination of theirantibiotic susceptibility by using phage mutants.Appl Environ Microbiol，2006.72(12)：7455-7459)。Oda等人将绿色荧光蛋白GFP嵌入对大肠杆菌O157：H7特异的噬菌体PP01的衣壳蛋白中进行表达，进而通过荧光显微镜可以快速敏感的检测到细菌([18]Kottegoda，S.，et al.，Biarsenical-tetracysteine motif as a fluorescent tag for detection in capillary electrophoresis.Anal Chem，2008.80(14)：5358-5366)。但是由于GFP体积较大(由238个氨基酸组成)，它在活体标记中可能会影响被标记的蛋白质或细胞的正常生理功能，而且它的中等光稳定性也限制了它在单分子研究中的应用。另外，由于GFP是一个自发荧光蛋白，表达GFP的噬菌体不管对活菌，死菌还是不可培养菌均能识别而发光，从而无法区分细菌的生理状态。2006年Edgar等人在《美国国家科学院院刊》上发表论文，他们利用活的细菌体内会产生biotin的特点，将噬菌体进行基因改造，使其表达与biotin相结合的肽段，再将亲和素与量子点相连，利用生物素与亲和素的结合使噬菌体标记上荧光，从而可以在荧光显微镜和流式细胞仪上快速检测到被相应噬菌体侵染的细菌([19]Edgar，R.，et al.，High-sensitivity bacterial detectionusing biotin-tagged phage and quantum-dot nanocomplexes.Proc Natl Acad Sci U S A，2006.103(13)：4841-4845)。然而这个方法，操作比较烦琐，且用于检测的噬菌体必须一直处于biotinfree状态。

双砷染料是诺贝尔化学奖得主钱永健实验室发展的一种很有前途的活细胞蛋白标记方法([20]Griffin，B.A.，S.R.Adams，and R.Y.Tsien，Specific covalent labeling of recombinant proteinmolecules inside live cells.Science，1998.281(5374)：269-272)，该方法所用的荧光标记探针为一类能够穿透细胞膜和含有双砷基团的有机小分子(如FlAsH-EDT₂)。双砷荧光标记分子进入细胞后，与连在重组蛋白上的六肽标签CCXXCC序列(简称TC，其中X是除了半胱氨酸以外的其他氨基酸)发生特异性作用，形成强荧光的共价结合的双砷染料-四半胱氨酸体系(荧光强度约为FlAsH-EDT2的50000倍)。目前，已经开发出可产生蓝色(ChoXAsH)、绿色(FlAsH)及红色(ReAsH)荧光的双砷染料。双砷染料-四半胱氨酸体系具有背景噪音低、母体蛋白功能影响小、荧光团共价连接牢固等优点，并且整个体系可以通过电子显微镜监测。双砷染料体系较之广泛应用的荧光蛋白，最明显的特点在于四半胱氨酸六肽标签序列体积小，不会影响被标记蛋白质或细胞的正常生理功能，另外染料量子产率高、稳定性强、标记速度快并且能够提供除了荧光之外的其它读出方式，成为更理想的蛋白质荧光探针([21]Keppler，A.，et al.，Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.Proc Natl Acad Sci U S A，2004.101(27)：9955-9959；[22]Miller，L.W.，et al.，In vivo protein labeling with trimethoprim conjugates：a flexible chemical tag.Nat Methods，2005.2(4)：255-257)

发明内容

本发明的目的在于针对现有的细菌检测操作较复杂、检测周期较长和细菌特异性检测中特异性单克隆抗体难以获取、价格较昂贵等缺陷，提供一种致病菌的检测方法，该检测方法利用基因改造的噬菌体简单、快速、灵敏、特异地鉴别致病菌。

本发明所述双砷染料-四半胱氨酸重组噬菌体是对噬菌体进行基因改造，在其外壳PIII蛋白上插入可以和新型双砷染料特异结合的四半胱氨酸序列。改造后的噬菌体侵染特异的宿主菌并在其体内大量繁殖，其衣壳蛋白上所表达的四半胱氨酸与后续加入的跨膜双砷染料结合，荧光大大增强，可以用流式细胞仪或荧光显微镜进行方便快速的检测。

本发明包括以下步骤：

1)设计并合成具有粘性末端的编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；

2)将编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地连于噬菌体衣壳蛋白的表达调控序列中，形成四半胱氨酸重组噬菌体；

3)用步骤2)中的重组噬菌体侵染宿主细胞，并在其中繁殖，生成带有表达四半胱氨酸重组噬菌体的重组细胞；

4)在重组细胞中加入双砷染料，经洗涤去除非特异性结合后，被重组噬菌体特异识别侵染的细菌，在激发光照射下可发出特异荧光，经流式细胞仪或荧光显微镜进行特异性检测。

在步骤1)中，所述四半胱氨酸多肽是指FLNCCPGCCMEP，所述编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列是指：“TTC CTG AAC TGT TGT CCC GGC TGC TGC ATG GAG CCT”。

在步骤2)中，所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中所述噬菌体可选用本领域已知的各种噬菌体，如市售的噬菌体，包括T7，M13等。在生产本发明的四半胱氨酸重组噬菌体时，可以将编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地连于噬菌体衣壳蛋白的表达调控序列中，从而形成在衣壳蛋白上表达四半胱氨酸的重组噬菌体。

在步骤3)中，所述宿主细胞为原核细胞，是步骤2)中所用噬菌体特异识别的待检测细菌，可以为E.coli BLT5403；E.coli TG1；E.coli O157和salmonella等。重组噬菌体侵染宿主细胞时，应控制噬菌体和宿主细胞的比例小于1000∶1，侵染繁殖时间可以为30～90min。

在步骤4)中，所述双砷染料可以为FLAsH和ReAsH等荧光物质中的至少一种，其终浓度为1～10μM，反应时间为30～90min，反应温度为室温，所述洗涤可分别用BAL(3-羟基-1，2-丙二硫醇)和HBSS(Hank′s平衡盐溶液)洗至少1次；在经流式细胞仪或荧光显微镜进行特异性检测前可加入HBSS重悬。

本发明制备的双砷染料-四半胱氨酸-重组噬菌体，可根据待检测致病菌的种类，选择特定的专一识别的噬菌体进行基因改造，在其衣壳蛋白上插入四半胱氨酸序列后，该重组噬菌体可以识别特定的致病菌，在其体内生长繁殖，并表达可被双砷染料识别的四半胱氨酸序列。被重组噬菌体侵染的致病菌，经双砷染料染色后，在合适的激发光照射下，该致病菌能够发射荧光，并可以在流式细胞仪或荧光显微镜下明显观察和区分，从而实现对特定致病菌的快速鉴别。

附图说明

图1为多价噬菌体侵染细菌用流式分析仪检测的荧光信号图。在图1中，横坐标为荧光强度(A.U)，纵坐标为侧向散射强度(A.U)。

图2为图1中阴性对照和实验组的直方图及荧光统计值。在图2中，横坐标为荧光强度(A.U)，纵坐标为统计数占最大统计数比例；曲线a为M13侵染后的细菌，曲线b为M13-TC侵染后的细菌。

图3为单价噬菌体侵染细菌用流式分析仪检测的荧光信号图。在图3中，横坐标为荧光强度(A.U)，纵坐标为侧向散射强度(A.U)。

图4为图3中阴性对照和实验组的直方图及荧光统计值。在图4中，横坐标为荧光强度(A.U)，纵坐标为统计数占最大统计数比例；曲线a为M13KO7侵染后的细菌，曲线b为M13KO7-TC侵染后的细菌。

图5为8种不同细菌用M13-TC侵染后的荧光信号值。在图5中，横坐标为菌种，给坐标为荧光强度(A.U)；1为大肠杆菌E2738-空白对照，2为大肠杆图E2738-阴性对照，3为大肠杆菌E2738，4为大肠杆菌K12，5为大肠杆菌BL21，6为迟钝爱德华杆菌，7为溶壁微球菌，8为哈维氏弧菌，9为溶藻酸弧菌，10为副溶血弧菌。

图6为噬菌体侵染细菌的荧光显微镜图：阴性对照为用原噬菌体侵染的细菌经双砷染料染色后的样本；实验组为用含有TC片段的重组噬菌体侵染的细菌经双砷染料染色后的样本。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1多价噬菌体M13KE-TC的制备

四半胱氨酸TC片段的制备：

设计两条带有Acc65 I，Eag I粘性末端的TC DNA互补序列并于生工合成。

P1：5′-GTACCTTTCTATTCTCACTCTTTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCTTC-3′(记为SEQ ID NO.1)；

P2：5′-GGCCGAAGGCTCCATGCAGCAGCCGGGACAACAGTTCAGGAAAGAGTGAGAATAGAAAG-3′(记为SEQ ID NO.2)。

分别取P1，P2以终浓度10M混合于Taq Buffer中，于PCR仪进行退火反应，设置程序如下：95℃，2min；连续降至25℃，约60min；4℃保存。

对7222bp的多价噬菌体M13KE DNA进行Eag I、Acc65 I双酶切回收，双酶切片段与退火的带有Eag I、Acc65 I粘性末端的TC DNA片段连接后，转染到大肠杆菌TG 1感受态中，铺板培养，随机调取单噬菌斑，扩增，提取噬菌体ssDNA，寄往生工测序。

阳性重组噬菌体测序结果如下所示，与理论M13KE-TC DNA序列完全匹配，其中s为理论序列的一部分，1为噬菌体ssDNA测序的一部分碱基序列。

s ATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATG

1 ATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATG

************************************************************

s CGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAAT

1 CGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAAT

************************************************************

s TCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTT

1 TCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTT

************************************************************

s TTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTAT

1 TTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTAT

************************************************************

s TCTCACTCTTTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCTTCGGCCGAAACTGT-

1 TCTCACTCTTTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCTTCGGCCGAAACTGTT

***********************************************************

s ------------------------------------------------------------

1 GAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCATACAGAAAATTCATTACTAACGTCGAAAGACGACAAT

上列：理论序列的一部分核酸序列；

下列：阳性重组噬菌体ssDNA测序的一部分。

实施例2单价噬菌体M13KO7-TC的制备

1、重组噬菌粒pCANTAB 5E-TC构建及鉴定

设计两条带有Not I，Sfi I粘性末端的TC DNA互补序列并于生工合成。

P3：5`-CGGCCATTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCTGC-3`(记为SEQID NO.3)；

P4：5`-GGCCGCAGGCTCCATGCAGCAGCCGGGACAACAGTTCAGGAATGGCCGGCT-3`

(记为SEQ ID NO.4)。分别取P3，P4以终浓度10M混合于Taq Buffer中，于PCR仪进行退火反应，设置程序如下：95℃，2min；连续降至25℃，约60min；4℃保存。

对5.3kb的噬菌粒DNA pCANTAB 5E进行Not I，Sfi I双酶切，回收，双酶切片段与退火的带有Not I，Sfi I粘性末端的TC DNA片段连接，构建重组噬菌粒，按常规方法进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。

S TTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGCGGCCCAGCCGGCCATTC

2 TTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGCGGCCCAGCCGGCCATTC

************************************************************

S CTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTAT

2 CTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTAT

************************************************************

S CCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCAT

2 CCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCAT

************************************************************

S ACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAAC

2 ACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAAC

************************************************************

S TATGAGGGCTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTGGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAG

2 TATGAGGGCTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTGGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAG

************************************************************

上列：理论序列的一部分核酸序列；

下列：阳性重组噬菌粒ssDNA测序的一部分。

2、单价噬菌体M13KO7-TC的获取

对以上重组噬菌粒pCANTAB 5E-TC通过辅助噬菌体M13KO7的补救，便得到了含有一个TC肽段的单价噬菌体M13KO7-TC，具体步骤如下：

(1)取100L过夜培养含有重组噬菌粒pCANTAB 5E-TC的大肠杆菌TG1菌液接种到10mL 2xYT-AG(100g/mL Amp，2％ Glucose)中，37℃，150rpm，培养1.5h；

(2)加入1.2x10¹⁰pfu辅助噬菌体M13KO7，37℃，250rpm，培养1h；

(3)10000rpm室温离心10min，去上清；

(4)将细胞沉淀重新接种到10mL 2xYT-AK(100mg/L Amp，25mg/L Kanamycin)中，37℃，250rpm培养8h；

(5)10000rpm室温离心2min，保留上清液；

(6)用PEG 8000/NaCI，冰浴沉降30-60min，4℃，10000rpm离心20min，去上清，用2xYT重新溶解沉淀，4℃保存，便得到单价噬菌体M13KO7-TC。

实施例3四半胱氨酸重组噬菌体对特异致病菌的侵染及双砷染料染色

挑取待检菌E.coli TG1单菌落于2mL 2×YT，37℃，250rpm过夜培养，取过夜培养的E.coliTG1菌液100L加入到10mL 2×YT-G，37℃，250rpm摇至OD＝0.6，各取2mL相应菌液于培养管中，分别加入重组噬菌体及原噬菌体，37℃，250rpm，侵染1h。各取侵染液80uL，用100L HBSS洗两次，最后加入HBSS，加入终浓度5μM的双砷染料FlAsH-EDT₂，孵育30min，离心弃上清，加入洗涤剂BAL，孵育15min，离心弃上清，重复洗涤一次，加入HBSS80uL重悬。这样用原噬菌体侵染的细菌样本为阴性对照组；用重组噬菌体侵染的细菌样本为实验组。

实施例4含双砷染料-四半胱氨酸重组噬菌体的致病菌的快速检测

1、传统流式细胞仪检测

取实施例3中HBSS重悬液300L于传统流式细胞仪进行检测，实验条件如下：488nm激发电压：400V；SSC：300V；FSC：300V；检测个数：10000。

1)对于多价噬菌体，结果如图1和2所示，图1为多价噬菌体侵染细菌用流式分析仪检测的荧光信号图。在图1中，图A为阴性对照(用原噬菌体侵染的细菌经双砷染料染色后的样本，即双砷标记M13侵染后的细菌)的散点图；图B为实验组(用含有TC片段的重组噬菌体侵染的细菌经双砷染料染色后的样本，即双砷标记M13-TC侵染后的细菌)的散点图。图2为图1中阴性对照和实验组的直方图。在图2中，曲线a为M13KE侵染的细菌，曲线b为M13KE-TC侵染的细菌。阴性对照和实验组的荧光统计值如表1所示。实验组的荧光峰明显比阴性组向右偏移，即信号可以与背景相分离。表面该体系可适用于传统的流式细胞仪的对致病菌的快速检测。

表1

样品	％ in P2
样品	％ in P2	M13	24.53
M13-TC	87.97	M13	24.53

2)对于单价噬菌体：结果如图3和4所示，图3为单价噬菌体侵染细菌用流式分析仪检测的荧光信号图。在图3中，图A为阴性对照(用原噬菌体侵染的细菌经双砷染料染色后的样本，即双砷标记M13KO7侵染后的细菌)的散点图；图B为实验组(用含有TC片段的重组噬菌体侵染的细菌经双砷染料染色后的样本，即双砷标记M13KO7-TC侵染后的细菌)的散点图。图4为图3中阴性对照和实验组的直方图。在图4中，曲线a为M13KO7侵染的细菌，曲线b为M13KO7-TC侵染的细菌。阴性对照和实验组的荧光统计值如表2所示。实验组的荧光峰明显比阴性组向右偏移，即信号可以与背景相分离。表面该体系可适用于传统的流式细胞仪的对致病菌的快速检测。

表2

样品	％ in P2
样品	％ in P2	M13KO7	24.82％
M13KO7-TC	86.81％	M13KO7	24.82％

2、荧光显微镜检测

取实施例3中HBSS重悬液20L于荧光显微镜下观察，分别在明场和蓝光激发下观察，结果如图6所示，在蓝色激光照射下，实验组可以观察到带有荧光的细菌而阴性组无法看到，表明该体系可适用于荧光显微镜下对致病菌的快速检测。

实施例5双砷染料-四半胱氨酸重组噬菌体对致病菌检测的特异性考察

分别取8种不同种类细菌：E.coli 2378；E.coliK12；E.coli BL21；Edwardiella tarda；M.Lysodeikticus；Vibrio harveryi Vibrio alginolyticus；Vibrio parahemolyticus(其中仅E.coli2378为重组噬菌体的宿主菌)单菌落于2mL 2×YT，37℃，250rpm过夜培养，取过夜培养的各菌液100L加入到10mL 2×YT-G，37℃，250rpm摇至OD＝0.6，各取2mL相应菌液于培养管中，分别加入重组噬菌体及原噬菌体，37℃，250rpm，侵染1h。各取侵染液80uL，用100L HBSS洗两次，最后加入HBSS，加入终浓度5μM的双砷染料FlAsH-EDT₂，孵育30min，离心弃上清，加入洗涤剂BAL，孵育15min，离心弃上清，重复洗涤一次，加入HBSS 80uL重悬。另外加入用原噬菌体侵染的细菌样本为阴性对照组；用重组噬菌体侵染，不加入双砷染料但经历同样洗涤过程的细菌作为空白对照组。将以上样本用流式分析仪进行分析，取每一组的荧光值进行比较，阴性对照和实验组的直方图及荧光统计值如图5所示；宿主菌E.coli2378的信号明显高于其他任何其他细菌，因此双砷染料-四半胱氨酸重组噬菌体对致病菌检测具有很强的特异性。

序列表

<110>厦门大学

<120>致病菌的检测方法

<130>致病菌的检测方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>36

<212>DNA

<213>

<220>

<222>(1)..(1)

<223>

<400>1

TTCCTGAACT GTTGTCCCGG CTGCTGCATG GAGCCT 36

Claims

1.致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述四半胱氨酸多肽是指FLNCCPGCCMEP。

3.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述编码具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列是指：“TTC CTG AAC TGT TGT CCC GGC TGC TGC ATG GAGCCT”。

4.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述可操作地连于，是指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性；如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。

5.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述可操作地连于，意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

6.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述宿主细胞为原核细胞，是步骤2)中所用噬菌体特异识别的待检测细菌。

7.如权利要求6所述的致病菌的检测方法，其特征在于所述待检测细菌为E.coli BLT5403；E.coli TG1；E.coli O157或salmonella。

8.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤3)中，重组噬菌体侵染宿主细胞时，控制噬菌体和宿主细胞的比例小于1000∶1，侵染繁殖时间为30～90min。

9.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述双砷染料为FLAsH和ReAsH荧光物质中的至少一种，其终浓度为1～10μM，反应时间为30～90min，反应温度为室温。

10.如权利要求1所述的致病菌的检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述洗涤分别用BAL(3-羟基-1，2-丙二硫醇)和HBSS(Hank′s平衡盐溶液)洗至少1次；在经流式细胞仪或荧光显微镜进行特异性检测前加入HBSS重悬。