CN101730847B

CN101730847B - 组合物及检测方法

Info

Publication number: CN101730847B
Application number: CN200880019228.8A
Authority: CN
Inventors: D·J·帕克; Z·卡恩; K·F·波特
Original assignee: GENERA BIOSTSTEM Pty Ltd
Current assignee: GENERA BIOSTSTEM Pty Ltd
Priority date: 2007-04-05
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2028-04-04
Also published as: US8278429B2; NZ580242A; BRPI0809958B8; EP2142926A2; EP2142926A4; AU2008236678A1; US20130184170A1; RU2009140736A; BRPI0809958A2; MX2009010751A; ES2403729T3; RU2480732C2; BRPI0809958B1; WO2008124091A2; AU2008236678B2; CN101730847A; JP2010523114A; HK1140019A1; EP2142926B1; WO2008124091A3

Abstract

本发明总的来说涉及诊断和检测试验领域。更具体地，本发明提供用于如下方面的方法和包括生物芯片在内的试剂：检测样品中一种或多种分析物的存在情况，或区分样品中的一种或多种分析物。

Description

组合物及检测方法

相关申请的交叉引用

本申请要求保护于2007年4月5日提交的美国临时专利申请顺序号60/910,373和60/910,381的权益，其公开内容以其整体在此引作参考。

发明领域

发明背景

在本说明书中提供的参考文献的详细出处在说明书的最后列出。

在本说明书中对任何现有技术的引用不能并且不应该理解为承认或以任何形式提示所述现有技术在任何国家中构成一般常识的部分。

对在一次分析中检测多种分析物的快速可靠的筛选方法的需要不仅仅在临床诊断至关重要，而且在筛选应用(例如用于环境毒素和药物筛选)中也是必需的。

一个极为需要改进的筛选方法和试剂的这样的领域是传染病领域。例如，全世界用于性传播疾病例如人乳头瘤病毒(HumanPapilloma Virus，HPV)的诊断检测应用的保守估计大约为每年20,000,000次检测。

很多用于筛选传染病源的现有检测费时、耗力、昂贵，通常仅对一种特定病原体具有特异性和/或不能区分病原体的不同株。

HPV是子宫颈癌的主要病原体。然而，HPV分类群包含很多病原体“毒株”，但只有少量与发展子宫颈癌和其它癌有关。因此，HPV毒株通常分为“高危”毒株(包括引起大约98％的子宫颈病例的13种毒株)或通常与发展子宫颈癌无关的“低危”毒株。

目前，子宫颈癌通过巴氏涂片(Pap smear)来检测。在该技术中，通过刮擦或洗涤从子宫颈采集细胞。随后将这些细胞置于显微镜玻璃载玻片上，以制作“涂片”。然后病理学家检查该载玻片，寻找异常细胞。然而，巴氏涂片试验有些差强人意，不能明确确定子宫颈癌风险，因为该技术的假阴性率为大约20％，并且该技术不能区分“高危”和”低危”分类群。

很多用于检测HPV的试剂和/或方法关系到高成本和/或耗费非常大量的时间才能完成。存在对总花费较低和较易使用的更快速和/或简化的分析方法的需要。本发明涉及这些目标和其它重要目标。

发明简述

本发明提供能够检测一种或多种分析物和/或区分一类分析物中各成员的测定法。具体而言，采用基于分析物和测定组分的性质的多重分析法(multiplexing analysis)来鉴定或区分分析物。

因此，本发明某些方面提供用于检测一种或多种分析物和/或用于区分一类分析物中的两种或更多种成员的珠粒集合(beadset)，其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或珠粒子集，所述珠粒集合中：(a)各子集的珠粒尺寸均一；(b)各子集内的珠粒与反应物偶联，所述反应物将与待测样品中既定的目标分析物起特异性反应；(c)各珠粒上的反应物用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记，以形成基于荧光强度不均一的珠粒子集混合物；和(d)将至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合，其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物差异的流式细胞术来鉴定出所述子集本身(subset identidy)，从而鉴定出所述珠粒所偶联的反应物。

本发明在其它方面包括用于检测和/或区分样品中两种或更多种分析物的方法，该方法包括以下步骤：(a)使样品与对目标分析物具有特异性的珠粒集合接触；(b)使所述珠粒集合与所述样品在足以使所述样品中的所述分析物与所述珠粒集合内的珠粒上的反应物起特异性反应的条件下孵育一段时间；和(c)检测和/或区分与所述珠粒上的反应物结合的样品中的分析物。

在某些其它方面，所述反应物可用能进一步使一类分析物中的各成员区分开的一种或多种荧光染料来标记。在某些优选方面，本发明提供能够检测和/或区分生物学样品中的分析物的方法和珠粒集合，其中分析物为对传染性病原体具有特异性。

本文涵盖的生物学样品包括血液、血清、唾液、粪便、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁和呼吸液(respiratory fluid)和粘液及来自局部溃疡、癌症和病灶的拭抹物。

术语“病原体”指感染样品或在样品中群集的微生物或病毒。例示性病原体包括病毒、细菌、真菌和真核微生物。病毒包括慢病毒(Lentivirus)(例如AIDS病毒HIV-I、HIV-II、HTLV-IV)、逆转录病毒(Retrovirus)和禽流感病毒(avian flu virus)。在某些优选实施方案中，“病原体”包括感染多细胞生物体例如动物或植物的微生物或病毒。因此，在某些实施方案中，分析物可看作是动物或植物病原体。然而，本发明包括检测和/或区分在多细胞生物体内群集的非病原体，例如共生生物、内生物、胃肠群集生物等。本发明方法还适用于检测样品中的分析物，所述分析物表明存在治疗剂或滥用药物。本发明方法和试剂还可用于检测并非来源于从动物或植物分离的生物样品的样品中的分析物。因而，除上面所列的生物学样品外，本发明试剂和方法还可延伸至检测环境样品中的一种或多种分析物和/或区分环境样品中的分析物，所述环境样品还包括空气、水和土壤样品(包括地球外土壤、灰尘或类似样品)、工业样品等。

在某些实施方案中，本发明提供用于人受检者的HPV的诊断方法和试剂，其能够检测和区分不同毒株，以区分“高危”HPV分类群与“低危”HPV分类群。因此，在某些优选实施方案中，本发明提供能够区分众多不同HPV毒株的珠粒集合。因此，在一个方面，所述分析物对多种HPV分类群具有特异性，所述方法和/或试剂对于检测对众多HPV分类群具有特异性的核酸或抗原或抗体具有特异性。

甚至更优选将能够结合HPV基因组的毒株特异性部分的核酸引物或探针固定在各珠粒子集的珠粒上。然后将针对毒株特异性区侧翼的HPV基因组保守区的引物用于扩增HPV基因组。然后将针对任何一种HPV毒株的每一个珠粒家族或珠粒子集用于检测或区分HPV毒株。

本发明其它方面涉及用于检测一种或多种HPV毒株和/或用于区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合，其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或珠粒子集，其中：(a)各子集的珠粒尺寸均一；(b)各子集内的珠粒与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的核酸捕获探针缀合，或任选与对照核酸序列缀合；(c)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记，以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物；和(d)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合，其中可由基于尺寸、荧光强度和序列区别的流式细胞术来鉴定出所述子集本身，从而鉴定出HPV毒株。

本发明其它方面包括用于检测和/或区分样品中两种或更多种HPV毒株的方法，所述方法包括如下步骤：(a)使样品与包含多个珠粒家族或珠粒子集的珠粒集合接触，其中：(i)各子集的珠粒尺寸均一；(ii)各子集内的珠粒与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的核酸捕获探针偶联，或任选与对照核酸序列偶联；(iii)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记，以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物；和(iv)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合，其中可由基于尺寸、强度和序列区别的流式细胞术来鉴定出所述子集本身，从而鉴定出HPV毒株；(b)使所述珠粒集合与所述样品在以下条件下孵育一段时间：所述条件足以使所述探针与被扩增以产生包含毒株特异性区域的复制子(replicon)的HPV基因组结合；和(c)检测和/或区分样品中产生的与所述珠粒结合的扩增子(amplicon)，从而鉴定出或区分两种或更多种HPV毒株。

在某些优选方面，珠粒集合内的珠粒可基于其尺寸、荧光强度水平、荧光染料类型及能够与特定分析物反应的反应物来区分。

本发明在其它方面涉及用于检测HPV毒株和/或用于区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合，其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集，所述珠粒集合具有：(a)至少两个珠粒子集，其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开；或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集，其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一，并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族；或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合；和其中：所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联，或任选与至少一种对照核酸序列偶联，前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与珠粒子集中其它被标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记，并且在任何单个珠粒子集内，其各珠粒家族具有不同荧光强度；和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的，其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族；其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。

本发明还涉及制备用于区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合的方法的部分，其包括基于尺寸、荧光强度或所述二者选出多个珠粒家族或珠粒子集，所述方法包括提供：(a)至少两个珠粒子集，其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开；或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集，其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一，并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族；或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合；和其中：所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联，或任选与至少一种对照核酸序列偶联，前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记，并且在任何单个珠粒子集内，其各珠粒家族具有不同荧光强度；和每一珠粒家族对检测HPV毒株都是特异性的，其不同于珠粒集合内的任何其它珠粒家族；其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定出一种或多种特异性HPV毒株。

涉及HPV检测的本发明方法可用于区分2-16种HPV毒株，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16种毒株。考虑到对照的使用，本发明因此可使用2-17个不同珠粒或珠粒集合。在另一实施方案中，珠粒集合包含用于HPV毒株6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的至少16个珠粒子集及通常一个对照珠粒集合。合适的捕获探针为列入表2中的探针。

预期检测分析物的超过16种毒株。因此，本发明还包括含2-30种不同珠粒或珠粒集合的珠粒集合，其包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30种珠粒或珠粒集合。

本发明部分涉及用于扩增核酸序列的多种PCR技术中的任何一种的某些引物对，其中正向引物和反向引物任选地具有与所述引物的5’端缀合的后跟(heel)。在某些实施方案中，本发明涉及用于靶向致癌的HPV的寡核苷酸扩增引物对，所述引物对中的正向引物选自：TR TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY A；CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GAT A；CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA；AAY CAR YTR TTT GTT ACT GTK GT；TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCG；TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCG YAG；GTK GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC和GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA；而所述引物对中的反向引物选自：TGA AAA ATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCA TG；CAY ARY TGA AAA ATA AAY TGY AAA TC；TR CAY ARY TGA AAA ATA AAY TG；和TR CAY ARY TGA AAA ATA AA；其中正向引物和反向引物各自任选在所述引物的5’端缀合有后跟。

可使用能区分珠粒集合内不同珠粒的任何方法，来测定分析物和珠粒上存在的反应物之间是否发生结合。在某些特别优选的实施方案中，区分珠粒集合内不同珠粒的方法采用流式细胞术。

本发明进一步包括用于本发明试剂和方法的诊断试剂盒。具体而言，本发明延伸至生物芯片和固相测定组分微型化，以产生纳级测定(nanoassay)试剂。在一个实施方案中，所述珠粒集合或其部分或其它试剂固定在固相例如生物芯片上。生物芯片也可看作是“生物实验室(biolab)”，在其上面至少可进行部分测定和/或记录结果。

本文所用缩写名单提供在表1中。表1-缩写

缩写	说明
		FITC	异硫氰酸荧光素
HEX	六氯荧光素
		HIV	人免疫缺陷病毒
HPV	人乳头瘤病毒
		JOE	7’-二甲氧基荧光素
PCR	聚合酶链式反应
		PE	藻红素
PMT	光电倍增管
		QD	量子点
TAMRA	羧基四甲基罗丹明
		TET	四氯荧光素
TMR	四甲基罗丹明
		VRE	万古霉素耐药肠球菌

本文所用序列概要示于表2中。表2-序列(5’在左边，3’在右边)

PCR引物序列
		GP5+	TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
GP6+	GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C
		GP5d+	TTTKTTACHGTKGTDGATACYAC
GP6d+	GAAAHATAAAYTGYAADTCATAYTC
		GP5+(5Phos)	/5Phos/TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
GP6+(5AmMC6)	/5AmMC6/GAA AAA TAA ACT GTA AAT CATATT C
		GP5d+(5Phos)	/5Phos/TTTKTTACHGTKGTDGATACYAC
GP6d+(5AmMC6)	/5AmMC6/GAAAHATAAAYTGYAADTCATAYTC
		GP5d2+	TTT KTT ACH GTK GTD GAT ACH AC-3′
T7aGP6d+(后跟GP6d+)	AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGAAAH ATA AAY TGY AAD TCA TAY TC
		GP5d3+	TTT GTT ACH GTD GTD GAY ACH AC
T7aGP6d+*(后跟GP6d+)	AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGAAAH ATA AAY TGY ARD TCA WAY TC
		GP5d2+(5Phos)	/5Phos/TTT KTT ACH GTK GTD GAT ACH AC-3′
T7aGP6d+(后跟GP6d+)(5AmMC6)	/5AmMC6/AAT TCT AAT ACG ACT CAC TATAGG GGA AAH ATA AAY TGY AAD TCATAY TC
		GP5d3+(5Phos)	5Phos TTT GTT ACH GTD GTD GAY ACH AC
T7aGP6d+*(5AmMC6)	/5AmMC6/AAT TCT AAT ACG ACT CAC TATAGG GGA AAH ATA AAY TGY ARD TCAWAY TC
		mlc1_95f	GGC ACC CAG ACA ATA CAC
T7amlc1_275r(后跟MLCR)	AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTAAGT TGA AGA GGT GAA GAA
		mlc1_95f(5Phos)	/5Phos/GGC ACC CAG ACA ATA CAC
T7amlc1_275r(后跟MLCR)(5AmMC6)	/5AmMC6/AAT TCT AAT ACG ACT CAC TATAGG GTA AGT TGA AGA GGT GAA GAA
		GBHPVf1	/5Phos/caatcagc TR TTT GTT ACT GTK GTDGAT ACY A
GBHPVf2	/5Phos/acaat CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD

	GAT A
		GBHPVf3	/5Phos/acaat CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTDGA
GBHPVf3+	/5Phos/ggaacaat CAR YTR TTT GTT ACT GTKGTD GA
		GBHPVf4	/5Phos/ggaac AAY CAR YTR TTT GTT ACT GTKGT
GBHPVf5	/5Phos/cagctt TTT GTT ACT GTK GTD GATACY AC HCG
		GBHPVf6	/5Phos/cagctt TTT GTT ACT GTK GTD GATACY AC HCG YAG
GBHPVf7	/5Phos/attacc GTK GTD GAT ACY AC HCGYAG TAC
		GBHPVf8	/5Phos/ctgtt GTD GAT ACY AC HCG YAG TACHAA
GBHPVr1	/5AmMC6/actcactatagg TGA AAA ATA AAYTGY AAA TCA TAT TCY TCM MCA TG
		GBHPVr2	/5AmMC6/aatacgactcactatagg CAY ARY TGAAAA ATA AAY TGY AAA TC
GBHPVr3	/5AmMC6/tctaatacgactcactatagg TR CAY ARYTGA AAA ATA AAY TG
		GBHPVr4	/5AmMC6/aattctaatacgactcactatagg TR CAY ARYTGA AAA ATA AA

捕获探针序列
		探针6：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CAT CCG TAA CTA CAT CTT CCA CATACA CCA A
探针11：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CAT CTG TGT CTA AAT CTG CTA CATACA CTA A
		探针16：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CGT CAT TAT GTG CTG CCA TAT CTACTT CAG A
探针18b：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGC

	TAT GGA CC TCC TGT ACC TGG GCA ATA TGATGC TAC CA
		探针31：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CTG TTT GTG CTG CAA TTG CAAACA GTG ATA C
探针33：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CTT TAT GCA CAC AAG TAA CTAGTG ACA GTA C
		探针35：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CGT CTG TGT GTT CTG CTG TGT CTTCTA GTG A
探针39：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CTC TAC CTC TAT AGA GTC TTC CATACC TTC T
		探针45：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CAC ACA AAA TCC TGT GCC AAGTAC ATA TGA C
探针51：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CAG CAC TGC CAC TGC TGC GGTTTC CCC AAC A
		探针52：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CTG CTG AGG TTA AAA AGG AAAGCA CAT ATA A
探针56：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CGT ACT GCT ACA GAA CAG TTAAGT AAA TAT G
		探针58b：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CG CAC TGA AGT AAC TAA GGA AGGTAC
探针59：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CTC TAC TAC TTC TTC TAT TCC TAATGT ATA C
		探针66：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CTA TTA ATG CAG CTA AAA GCACAT TAA CTA A
探针68：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CTC TAC TAC TAC TGA ATC AGC TGT

	ACC AAA T
		探针68b：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CT CCA CTA CTA CAG ACT CTA CTGTAC CA
探针MLC_Int：	/5Acryd/AAT/iAmMC6T/AA AGG GAG GAC AGCTAT GGA CCA AAC ACA GAC ACA GAG AGACCC ACA GAC A

*其中阴影碱基对应于差异。

信号寡核苷酸序列

HPV信号a：	/5AmMC6/TTT TTT CAT GKK GAR GARTAT GA/3Phos/
		HPV信号b：	/5AmMC6/TTT TTT CAT GKK GAR GARTAT/3Phos/
MLC信号a：	/5AmMC6/TTT TTT ACA GAC ACA GACAAC/3Phos/
		MLC信号b：	/5AmMC6/TTT TTT ACA GAC ACA GACAAC A/3Phos/
MLC信号c：	/5AmMC6/TTT TTT ACA GAC ACA GACAAC AC/3Phos/

本文使用以下的变量：“K”为G或T的变量；“H”为核苷酸T、A或C的变量；“M”为核苷酸A或C的变量；“Y”为核苷酸T或C的变量；“R”为核苷酸A或G的变量；“W”为核苷酸A或T的变量；“D”为核苷酸A、T或G的变量；3Phos为3’磷酸基；5Phos为5’磷酸基；和5AmMC6为经由磷酸基连接的5’H2N-(CH2)6-基团。

附图简述

图1为显示在HPV诊断方法中使用的DNA提取方案实例的简图的图示。

图2为显示可用于扩增DNA样品中的HPV和人DNA的PCR方案的图示。GP5+和GP6+指通用HPV引物，其结合HPV的保守序列(Y)，并产生包含HPV毒株(X_1-16)之间可变区域的扩增子。引物LC1F和LC1R扩增人基因组DNA区域(Z)，该区域在随后的杂交步骤中作为对照。引物GP6+和LC1_R包含掺入到所产生的扩增子中的荧光标记物。

图3为显示基于尺寸区别的微球体的图示。显示了包含对应于3.0μm、3.5μm、4.1μm、5.0μm、5.6μm和6.8μm直径的6簇微球体。

图4为显示基于荧光标记物强度的相同尺寸微球体的差异的图示。0％、4％、20％和100％的TMR相对强度可明显区分开。

图5为显示可用于阵列中的结合剂实例的示意图。该阵列包含包括3.0μm、3.5μm、4.1μm、5.0μm、5.6μm和6.8μm直径和0％、4％、20％和100％的荧光标记物信号强度的微球体。在珠粒较小的情况下，即3.0μm、3.5μm和4.1μm下，使用0％和100％的TMR强度；对于5.0μm的微球体，使用0％、20％和100％的TMR强度；对于5.6μm和6.8μm直径的最大微球体，使用所有的信号强度。

图6显示本发明珠粒集合的实例。

图7为显示已经结合扩增子的结合剂阵列实例的图示。结果显示了与病毒的保守序列Y、人对照序列Z和病毒的毒株特异性序列X₁₆的结合。

发明详述

本发明提供能够检测一种或多种分析物和/或区分一类分析物中各成员的测定法和包括生物芯片在内的试剂。具体而言，通过基于分析物和测定组分的性质的多重分析法，来鉴定或区分分析物。本发明诊断和检测的试验和试剂特别适用于诊断多细胞真核受检者的病原体感染。在一个特定实施方案中，本发明提供了用于人受检者的HPV诊断试验，并能够区分HPV分类群，以辨别“高危”HPV感染与“低危”HPV感染。此外，本发明还提供了诊断或评估多细胞真核受检者中发展与分析物感染有关的疾病(尤其包括人受检者的子宫颈癌)的风险的方法。

应该理解，除非另外指出，否则本发明不限于特定的诊断或测定方案，因此它们可以变化。还应该理解，本文所用术语仅作为阐述具体实施方案的目的，并非意欲限制。

必需注意，除非上下文已经另外指出，否则本说明书中使用的“所述”和“该”包括复数方面。因此，例如提及“所述分析物”包括单种分析物以及两种或更多种分析物；“所述可从物理化学上区分的基材”包括单种基材以及两种或更多种基材；提及“所述靶标”包括单一靶标以及两种或更多种靶标；提及“所述扩增”包括单次扩增以及多个扩增步骤；提及“该扩增子”包括单个或多个或复合扩增子；等等。

因此，本发明在一个方面提供了能够检测和/或区分样品中两种或更多种分析物的珠粒集合，所述珠粒集合包括：(a)各子集的珠粒尺寸均一；(b)各子集内的珠粒与反应物偶联，所述反应物将与待测样品中既定的目标分析物起特异性反应；(c)各珠粒上的反应物用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记，以形成基于荧光强度不均一的珠粒子集混合物；和(d)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合，其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物区别的流式细胞术来鉴定出所述子集本身，从而鉴定出所述珠粒所偶联的反应物。

在某些实施方案中，可进一步对反应物进行不同标记以形成掺入不同荧光染料的另外的珠粒亚群。

在其它实施方案中，本发明提供了用于检测和/或区分分析物的方法或珠粒集合。

在某些优选方面，本发明方法或珠粒集合能够检测和/或区分病原体分析物。

本发明还提供了用于检测和/或区分样品中一种或多种分析物的方法，该方法包括以下步骤：(a)使样品与对目标分析物具有特异性的珠粒集合接触；(b)使所述珠粒集合与所述样品在足以使所述样品中的所述一种或多种分析物与所述珠粒集合内的珠粒上的反应物起特异性反应的条件下孵育一段时间；和(c)检测和/或区分与所述珠粒上的反应物结合的样品中的分析物。

本文所用术语“病原体分析物”指被推定感染、群集于或污染样品的微生物或病毒。例示性病原体分析物包括病毒、细菌、真菌和真核微生物。在优选实施方案中，“分析物”包括感染多细胞生物体例如动物或植物的微生物或病毒。因此，在某些实施方案中，可将病原体分析物看作动物或植物病原体。然而，本发明包括检测和区分群集于多细胞生物体的非病原体分析物，例如：动物的共生微生物(例如乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)、反刍动物细菌)、昆虫的共生微生物(例如链霉菌(Streptomyces spp.)、沃尔巴克氏体(Wolbachia spp.))、海绵动物的共生微生物(例如绿藻、沟鞭藻类、蓝细菌)等；植物的内生物(例如菌根、根瘤菌(Rhizobium spp.)、弗兰克氏菌(Frankia spp.)、链霉菌(Streptomyces spp.))；等等。此外，分析物可为与多细胞生物体不相关的分析物。这样的分析物包括细菌、真菌、病毒、原生生物、线虫等，它们群集在特定的环境中，包括：“自然”环境，例如土壤、海洋、淡水、冰、岩石、热水流火山口和空气；卫生保健环境，包括医院、医院设施、手术设备、卫生保健人员工作服等；“工业”环境，包括制造厂、药厂、酿酒厂、葡萄酒酿酒厂等；“实验室”环境，包括发酵罐、培养物、实验台、设备等。

因此，本发明涵盖的样品包括工业样品(例如空气、水和土壤等)和生物学样品(例如血液、血清、唾液、粪便、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁、呼吸液和粘液及来自局部溃疡、癌症和病灶的拭抹物)。另外，样品可为地球外样品，例如来自陨星或另一行星的样品。就后者而言，本发明的测定可适合在星际间遥远的交通工具上使用，用于检测土壤或灰尘或冰样品，或用于检测行星上的核心物质。

在某些优选实施方案中，分析物包括感染动物受检者的细菌、真菌、病毒和/或真核寄生虫。本文涵盖的“动物受检者”包括任何动物，优选哺乳动物，更优选灵长类，包括低级灵长类，甚至更优选人。就方便而言，“动物”还具体包括家畜(例如牛、马、绵羊、猪、山羊和驴)以及实验室动物(包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠)。

可用本发明试剂和方法检测的例示性人分析物包括：病毒，例如人乳头瘤病毒(HPV)、包括SARS病毒在内的冠状病毒、流感病毒、禽流感病毒、包括HIV-1、HIV-II或HLTV-IV在内的HIV、一般慢病毒、肝炎病毒等；性传播疾病病原体，例如衣原体、淋病、支原体(Mycoplasma spp.)和梅毒；食物传源性病原体，例如李斯特氏菌(Listeria spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌(E.coli)(特别是大肠杆菌HO 567)、志贺氏菌(Shigella spp.)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；医院感染性病原体，例如包括甲氧西林耐药性的金黄色葡萄球菌(MRSA)在内的金黄色葡萄球菌和包括万古霉素耐药性肠球菌(VRE)在内的肠球菌；环境获得性病原体，例如军团菌(Legionella spp.)、贾第虫(Giardia spp.)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthacis)(炭疽)等。

在其它方面，检测其中的分析物的样品优选来源于被认为受分析物感染或分析物群集的多细胞受检者的样品。因此，在一个方面，所述样品优选“生物学样品”。决不限制本发明的例示性生物学样品包括组织或细胞样品，例如细胞刮擦物(cell scapes)、活组织切片等和体液样品，包括血液、尿液、淋巴、羊水、脑脊液等。

在某些其它方面，本发明方法还适用于检测并非专门来源于多细胞真核生物体的样品中的“分析物”。因此，本发明延伸至检测和/或区分样品中的一种或多种特定分类群或毒株分析物，例如环境样品(包括空气、水和土壤样品)、工业样品、实验室样品等。例如，本发明方法可用于评估土壤、水或空气样品或来源于人造物品或表面的样品的原核微生物区系、真核微生物区系和/或病毒量。

在本发明某些特别优选实施方案中，待检测的分析物为HPV或其毒株，并且样品优选为来源于人受检者的生物学样品。在另一优选实施方案中，生物学样品包含一种或多种受检者细胞、血液或尿液。最优选生物学样品包含采集自受检者的子宫颈细胞。HPV详述于Gearhart等(www.emedicine.com/MED/topic1037.htm，2004)中，其将在下文部分地进行重新叙述。HPV引起皮肤和粘膜的上皮肿瘤。已经检测出超过100种HPV类型，差不多有70种的基因组已被完全测序。目前基于其基因组序列相似性的分类系统，通常与用于临床上描述HPV的3种类别相关：肛门生殖器和/或粘膜类别、非生殖器皮肤类别和疣状表皮发育不良(EV)类别。经由互联网在HPV序列数据库中可得到HPV基因组序列数据库和系统发生树。

粘膜HPV感染进一步分为潜伏(无症状)感染、亚临床感染或临床感染。临床的病灶非常明显，但潜伏感染只能通过检测病毒DNA来检出。通过应用5％乙酸并在放大镜下检查来鉴定亚临床病灶。大部分HPV感染是潜伏感染；临床上明显的感染通常产生疣而不是癌。

通常将6型和11型HPV表现为低危，因为这些类型感染具有低致癌可能性，且通常导致形成湿疣和低级别癌症前期病灶。16型和18型HPV呈现为高危HPV类型，因为它们导致形成最高级别的可发展为癌的上皮内病灶，尤其是在肛门生殖器和/或粘膜类别中的HPV。

单独HPV感染不引起感染组织的恶性转化。辅助因素例如吸烟、紫外辐射、怀孕、叶酸缺乏和免疫抑制等参与到该过程中。表3列举多种疾病及相关的HPV亚型。表3-疾病及相关HPV亚型

乳头瘤病毒具有高度物种特异性，不感染其它物种，即使是在实验室条件下。人是HPV唯一已知的宿主(reservoir)。

乳头瘤病毒是二十面体对称的非包膜病毒，具有包围基因组的72个壳粒，基因组含有具大约8000个碱基对的双链环状DNA。

乳头瘤病毒被认为具有两种复制方式以产生子代病毒，即在基细胞中附加型基因组的稳定复制和在分化程度更大的细胞中的失控复制或营养复制。尽管所有病灶细胞都含有病毒基因组，但病毒基因组的表达与细胞的分化状态紧密相关。只有受感染的角质形成细胞离开基底层，大部分病毒基因才被激活。毒粒的产生可仅发生在高度分化的角质形成细胞中；因此，病毒产生可仅发生在上皮表面，此处细胞最终脱落到环境中。

HPV病灶被认为起因于受感染的基底角质形成细胞增殖。当基细胞与通过损坏的上皮屏障(性交期间或在较少皮肤磨损后发生)的有传染性的病毒接触时，通常会发生感染。一直都没有研究表明HPV感染是溶细胞的，更合适地说是毒粒由于脱落细胞(desquamating cell)退化而释放。此外，HPV病毒可在没有宿主时在低温下存活很多个月。

病毒增殖通常限制在细胞核中。因此，受感染的细胞通常展示高度的核异型。凹细胞病(Koilocytosis，来自希腊文koilos，意即排空)描述了核周透明(晕轮)与固缩或缩小(rasinoid)的细胞核的结合，是生产性乳头瘤病毒感染的特征。

HPV基因组在良性或低危HPV病灶中作为独立于宿主细胞核的环状附加型DNA存在，例如在通常与6型及11型有关的HPV病灶中。在恶性病灶中高危16和18型HPV的基因组通常整合到宿主细胞DNA中。然而，本发明延伸至任何HPV毒株，包括但不限于毒株6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。病毒基因组整合到宿主细胞基因组被认为是恶性转化的特征。已经证明高危血清型HPV蛋白E6和E7使宿主肿瘤抑制蛋白p53和Rb失活，从而导致宿主细胞增殖失控和恶性转化。

因此，本发明在其它方面提供用于检测和/或区分生物学样品中一种或多种特定HPV毒株的方法，所述方法包括以下步骤：(i)从人受检者获得被推定包含HPV的生物学样品；(ii)从所述样品分离出核酸；(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸，其中各个HPV毒株的扩增子不同；(iv)任选地扩增对照核酸序列；(v)对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多种扩增子进行标记；(vi)使所述被标记的一种或多种扩增子与用反应物包被的珠粒集合杂交，其中珠粒集合的每一成员都包含与特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子，所述核酸分子与可从物理化学上区分的珠粒结合或缔合；和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合；其中扩增子与特定反应物的缔合表明样品中存在特定HPV毒株。

在另外方面，在至少一种信号寡核苷酸序列存在下发生杂交。

在另外方面，在至少一种阻断寡核苷酸序列(blockingoligonucleotide sequence)存在下发生杂交。本发明使得能够检测扩增的HPV的DNA或者相应的RNA(在利用反转录酶情况下)。因此，本发明涵盖了含RNA或DNA或其化学类似物的珠粒。

本发明方法部分地基于用于检测和/或区分样品中受检者分析物的一种或多种特定毒株。本文提及“受检者分析物的特定毒株”包括分析物的种类或分类群的任何变种。分析物“毒株”的实例包括分析物的亚种、具不同毒力水平的分析物变种、当感染或群集于宿主时显示不同预后的分析物变种、分析物的生化变种等。

在某些优选实施方案中，本发明方法可适用于检测和/或区分与在人中具有较高风险或较高致癌可能性有关的特定HPV毒株(高危毒株)，和与较低癌症风险或较低致癌可能性有关的特定HPV毒株(低危毒株)。因此，术语“高危”HPV毒株包括与发展人受检者癌症(包括子宫颈癌)有关的任何HPV毒株。如上所述，决不限制本发明的例示性高危HPV毒株包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。用于这些HPV毒株的珠粒上的合适的捕获探针如表2所示。术语“探针”和“引物”在本文中可交互使用。“低危”HPV毒株包括与增加人受检者癌症风险无关或关系不大的毒株。通常低危HPV毒株为形成疣的毒株，包括HPV6和HPV11。

本发明珠粒偶联了与样品中既定目标分析物起特异性反应的反应物。在某些方面，本发明反应物为核酸，且与反应物起特异性反应的样品内的分析物也为核酸。

因此，本发明该方面利用了引物，该引物针对HPV毒株保守区，但该区域在毒株特异性基因组序列的侧翼。毒株特异性序列指“可变”序列，因为与毒株间的恒定的保守序列相比，它们在不同毒株间变化。扩增后，让扩增子与珠粒集合中的珠粒子集接触，其中各子集的每一珠粒都携带能够与毒株特异性扩增子杂交的捕获核酸引物或探针。使用珠粒尺寸、荧光强度和DNA结合特异性的多重分析法(multiplexing)使得能够鉴定、分选及区分HPV毒株。

因此，本发明其它方面涵盖了用于检测一种或多种HPV毒株和/或用于区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合，其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或珠粒子集，其中：(a)各子集的珠粒尺寸均一；(b)各子集内的珠粒与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的核酸捕获探针偶联，或任选与对照核酸序列偶联；(c)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记，以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物；和(d)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合，其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物区分的流式细胞术来鉴定出所述子集本身，从而鉴定出HPV毒株。

本发明其它方面涵盖了用于检测和/或区分样品中两种或更多种HPV毒株的方法，所述方法包括如下步骤：(a)使样品与包含多个珠粒家族或珠粒子集的珠粒集合接触，其中：(i)各子集的珠粒尺寸均一；(ii)各子集内的珠粒与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的核酸捕获探针偶联，或任选与对照核酸序列偶联；(iii)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记，以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物；和(iv)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合，其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物区分的流式细胞术来鉴定出所述子集本身，从而鉴定出HPV毒株；(b)使所述珠粒集合与所述样品在以下条件下孵育一段时间：所述条件足以使所述引物与被扩增以产生包含毒株特异性区域的复制子的HPV基因组结合；(c)检测和/或区分样品中产生的扩增子，所述扩增子与所述珠粒结合从而鉴定出或区分两种或更多种HPV毒株。

核酸捕获探针对其具有特异性的扩增子也可用荧光报告分子标记。

可用就样品本身和分析物的性质而言方便的任何方法从受检者样品分离出核酸。本文所用术语“核酸”指DNA和/或RNA。通常尽管在本领域技术人员显而易见的一些情况下分离DNA，但例如当目标分析物为RNA病毒时，更优选分离RNA。若分离RNA，则可扩增RNA，或可用标准方法将RNA逆转录为cDNA，用于随后的扩增和分析。

优选“核酸”为DNA。可用任何方便的手段从样品分离出DNA。例如，在人细胞样品中病毒例如HPV情况下，可将胍或功能等同的试剂用于溶解细胞。用于细胞溶解和DNA提取的基于胍的例示性的方法为Nelson和Krawetz法(Anal.Biochem.207(1)：97-201，1992)。基于胍的溶解液也可从供应商例如Qiagen(例如QIAamp)、PAXgene等市购。然而，溶解方法可视样品和分析物的性质而变化。例如，对于检测环境样品例如土壤或沉淀样品中的分析物而言，基于玻璃珠的细胞溶解系统更适当，例如Kuske等的方法(Appl.Environ.Microbiol.64(7)：2463-2472，1998)。在任何情况下，本领域一般技术人员不用经历不恰当实验就能轻易地决定用于既定分析物和样品的适当的溶解方案。

在将细胞溶解后，可通过本领域技术人员显而易见的任何方便的手段纯化DNA(例如参见上文的市售试剂盒)。在本发明某些优选实施方案中，用有限量的DNA结合剂(例如但不限于二氧化硅)来纯化DNA。通过使用有限量的DNA结合剂，可从不同样品分离出一致量的DNA，因为在每种情况下回收的DNA量都等于可由所述有限量的DNA结合剂所结合的DNA的最大量。随后可回收与DNA结合剂结合的DNA，或用任何方便的手段从DNA结合剂洗脱DNA。

尽管DNA是优选的核酸，但也可用任何标准RNA分离方案从样品分离出RNA。RNA的分离通常涉及细胞破碎步骤和RNA分离步骤。适用于分离RNA的例示性的细胞破碎技术包括Ambion TechnicalBulletin#183中提出的技术(www.ambion.com/techlib/tb/tb 183.html)。此外，在www.ambion.com/techlib/basics/products/rnaisol compchart.html中提出适用于多种样品类型的大量例示性的RNA分离试剂盒。然而，应该理解，本发明决不受这些用于RNA分离和纯化的特定方法和试剂盒的限制，本发明可使用本领域技术人员显而易见的任何RNA分离方法。

就HPV检测而言，珠粒集合可包含数量与HPV毒株一样多的珠粒子集。因此，测定可采用各自用于HPV毒株6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个珠粒子集。另外的珠粒还可用于对照。合适的捕获探针公开于表2中。

因此，本发明其它方面涉及用于检测一种或多种HPV毒株和/或用于区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合，其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集，其中：(a)各子集的珠粒尺寸均一；(b)各子集内的珠粒与选自表2所列的核酸捕获探针偶联，所述探针能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域或任选的对照核酸序列；(c)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记，以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物；和(d)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合，其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物区别的流式细胞术来鉴定出所述子集本身，从而鉴定出HPV毒株。

本发明又一方面涵盖了用于检测和/或区分样品中两种或更多种HPV毒株的方法，所述方法包括如下步骤：(a)使样品与包含多个珠粒家族或珠粒子集的珠粒集合接触，其中：(i)各子集的珠粒尺寸均一；(ii)各子集内的珠粒与选自表2所列的核酸捕获探针偶联，该探针能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域或任选的对照核酸序列；(iii)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记，以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物；和(iv)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合，其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物区别的流式细胞术来鉴定出所述子集本身，从而鉴定出HPV毒株；(b)使所述珠粒集合与所述样品在以下条件下孵育一段时间：所述条件足以使所述引物与被扩增以产生包含毒株特异性区域的复制子的HPV基因组结合；和(c)检测和/或区分样品中产生的扩增子，所述扩增子与所述珠粒结合从而鉴定出或区分两种或更多种HPV毒株。

因此，珠粒集合可包含2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16个珠粒子集，每一个子集含有选自表2所列的核酸分子中的一种。对表2中这些HPV毒株特异性序列的提及包括以下核酸分子：具有与这些序列至少90％同一性的核酸分子；或在严格性低的条件下能够与这些序列杂交或与其互补形式杂交的核酸分子。提及至少90％包括90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％。

本发明方法部分依靠用引物扩增样品中的核酸，所述引物结合受检者分析物不同毒株的保守序列，但产生的扩增子包含分析物的每种毒株的不同的核苷酸序列。实际上，本发明所用的引物结合受检者分析物毒株的保守序列，该序列位于在毒株间至少部分非保守区域或多态性区域的侧翼。分析物的示意性扩增区域具有以下通式结构：C-X-C’其中：C为在分析物的两种或更多种毒株之间保守的核苷酸序列，且为“正向”引物结合位点；X为部分或全部包含分析物的不同毒株之间的变化的核苷酸序列；C’为在分析物的两种或更多种毒株间保守的核苷酸序列，且为“反向”引物结合位点。

在某些实施方案中，期望将后跟掺入到一种或多种引物中以修改核酸扩增过程。优选这些后跟与所述引物的5’端缀合。更优选一种或多种后跟任选进一步地在所述后跟的5’端与5Phos或5AmMC6部分缀合。在某些优选实施方案中，与正向引物缀合的后跟选自：caatcagc、acaat、ggaac、cagctt、attacc和ctgtt，更优选acaat和ctgtt。在其它优选实施方案中，与反向引物缀合的后跟选自：actcactatagg、aatacgactcactatagg、tctaatacgactcactatagg和aattctaatacgactcactatagg，更优选actcactatagg和tctaatacgactcactatagg。

在涉及用于靶向致癌性HPV的寡核苷酸扩增引物对的某些实施方案中，引物对的正向引物选自：/5Phos/caatcagc TR TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY A；/5Phos/acaat CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GAT A；/5Phos/acaat CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA；/5Phos/ggaac AAY CAR YTR TTT GTT ACT GTK GT；/5Phos/cagctt TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCG；/5Phos/cagctt TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCGYAG；/5Phos/attacc GTK GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC；和/5Phos/ctgtt GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA；引物对的反向引物选自：/5AmMC6/actcactatagg TGA AAA ATA AAY TGY AAA TCATAT TCY TCM MCA TG；/5AmMC6/aatacgactcactatagg CAY ARY TGA AAA ATA AAYTGY AAA TC；/5AmMC6/tctaatacgactcactatagg TR CAY ARY TGA AAA ATAAAY TG；和/5AmMC6/aattctaatacgactcactatagg TR CAY ARY TGA AAAATA AA。如上所示，引物以大写字母表示，在每种情况下任选的后跟以下划线的小写字母表示。优选引物对的正向引物选自：/5Phos/acaat CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA和/5Phos/ctgttGTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA。在其它优选实施方案中，引物对的反向引物选自：/5AmMC6/actcactatagg TGA AAA ATA AAYTGY AAA TCA TAT TCY TCM MCA TG和/5AmMC6/tctaatacgactcactatagg TR CAY ARY TGA AAA ATA AAYTG。

在本发明某些方面，所述引物掺入了非引物结合区5′外源核苷酸序列，该序列与3’结合模板引物区的5’端缀合。本文中将5′外源核苷酸序列简称为“后跟”、“后跟夹”、“后跟序列”或”外源后跟序列”，但这决不限制本发明。

在某些优选实施方案中，正向引物和反向引物中至少一个以所述引物的5’端与后跟缀合。优选当正向引物以所述正向引物的5’端与后跟缀合时，该正向引物后跟选自：CAATCAGC、ACAAT、GGAACAAT、GGAAC、CAGCTT、ATTACC、CTGTT、/5Phos/CAATCAGC、/5Phos/ACAAT、/5Phos/GGAACAAT、/5Phos/GGAAC、/5Phos/CAGCTT、5Phos/ATTACC和/5Phos/CTGTT。优选当反向引物以所述反向引物的5’端与后跟缀合时，该反向引物后跟选自：ACTCACTATAGG、AATACGACTCACTATAGG、TCTAATACGACTCACTATAGG、AATTCTAATACGACTCACTATAGG、/5AmMC6/ACTCACTATAGG、/5AmMC6/AATACGACTCACTATAGG、/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG和/5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTATAGG。在含有任选的后跟核酸序列的寡核苷酸扩增引物对的某些更优选实施方案中，所述引物对的正向引物选自：CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA，其任选地具有与所述引物5’端缀合的ACAAT、/5Phos/ACAAT、GGAACAAT或/5Phos/GGAACAAT；和GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA，其任选地具有与所述引物5’端缀合的CTGTT或/5Phos/CTGTT。在某些含有任选的后跟核酸序列的寡核苷酸扩增引物对的更优选实施方案中，所述引物对的反向引物选自：TGA AAA ATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCATG，其任选地具有与所述引物5’端缀合的ACTCACTATAGG或/5AmMC6/ACTCACTATAGG；TR CAY ARY TGA AAA ATA AAYTG，其任选地具有与所述引物5’端缀合的TCTAATACGACTCACTATAGG或/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG；和TR CAY ARY TGAAAA ATA A(SEQ ID NO：12)，其任选地具有与所述引物5’端缀合的TCTAATACGACTCACTATAGG或/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG。

3′结合模板引物区指其3′部分与模板结合的引物(例如在第一个引发聚合的退火步骤期间)。上述引物设计导致在初始引发事件(initialpriming event)后将后跟序列掺入到扩增产物中。随后，5′后跟序列起夹子作用以使扩增子同源物间的扩增效率均等。

外源后跟序列可在正向引物或反向引物上或二者上都有。

因此，本发明某些方面涵盖了用于扩增核酸靶分子的方法，所述方法包括用正向引物和反向引物对所述核酸靶标的核酸模板进行扩增，其中至少一个引物含有与3’结合模板引物区缀合的非引物结合区5′外源核苷酸序列，其中在初始引发后所述外源核苷酸序列被掺入到扩增产物中。

如上所述，正向或反向引物可包含所述外源序列，或二者都可携带所述序列。当二者都携带外源序列时，后跟可相同或不同。

本发明尤其适用于能够潜在地引发一系列核酸靶标同源物的引物。

本发明进一步涵盖了通过用正向引物和反向引物的扩增来扩增包括在一群相关核酸分子内的核酸分子的改进的方法，所述方法包括：选出正向或反向引物中的一个或二者，使所选的一个或二者含有与3’结合模板引物区缀合的非引物结合区5′外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列在初始引发后被掺入到扩增产物中。

因此，提及“核酸分子”包括相关的核酸分子家族，例如一组同源的核酸分子。

用于减少扩增偏差的试剂盒也构成了本发明的一部分。

在本文献中所引用或描述的所有科技引文、专利、专利申请书和厂商技术说明书都以其整体在此引作参考。

应该理解，除非另外说明，否则本发明不限于特定的试剂、方法步骤或应用等，因而它们可以变化。还应该理解，本文所用术语仅为阐述特定实施方案的目的，并非意欲限制。

本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论文和教科书中的术语和符号，例如Kornberg和Baker，DNA Replication，第二版(W.H.Freeman，New York，1992)；Lehninger，Biochemistry，第二版(Worth Publishers，New York，1975)；Strachan和Read，Human Molecular Genetic，第二版(Wiley-Liss，New York，1999)；Eckstein编辑的Oligonucleotides and Analogs：APractical Approach(Oxford University Press，New York，1991)；Gait编辑的Oligonucleotides Synthesis：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，1984)；等等。

“扩增子”意即多核苷酸扩增反应的产物。也就是说，它是一群多核苷酸，通常不必是双链，由一个或多个起始序列复制得到。所述一个或多个起始序列可为相同序列的一个或多个拷贝，或其可为不同序列的混合物。扩增子可由多个扩增反应产生，所述扩增反应的产物是一种或多种靶核酸的多复制物(multiple replicate)。通常产生扩增子的扩增反应为“模板驱动”的，因为反应物(核苷酸或寡核苷酸)的碱基配对能在模板多核苷酸中获得互补物(complement)，所述互补物为产生反应产物所需。在一个方面，模板驱动的反应是用核酸聚合酶进行的引物延伸或用核酸连接酶进行的寡核苷酸连接。这样的反应包括但不限于PCR线性聚合酶反应、NASBA、滚环扩增等，其公开于以下参考文献(在此引作参考)中：Mullis等，美国专利第4,683,195号；第4,965,188号；第4,683,202号；第4,800,159(PCR)号；Gelfand等，美国专利第5,210,015号(用“Taqman”或”Taq”[注册商标]探针进行的实时PCR)；Wittwer等，美国专利第6,174,670号；Kacian等，美国专利第5,399,491号(“NASBA”)；Lizardi，美国专利第5,854,033号；Aono等，日本专利公开第JP 4-262799号(滚环扩增)；等等。

扩增反应可为“实时”扩增，其中检测化学使得反应产物可在扩增反应进行时得到测量。

本发明尤其涉及减少跨相关或同源核酸分子范围的扩增偏差。同源核酸分子的实例包括病毒同源物、多态性、相关癌细胞、细菌同源物、干细胞同源物等等。本发明一个方面为选出在同源物之间潜在的差异点处的引物。推荐引物携带与3’结合模板引物区缀合的非引物结合区5′外源核苷酸序列，在初始引发后所述外源核苷酸序列被掺入到扩增产物中。

后跟即5′外源序列长度可为约1-约400个碱基及其所有组合和亚组合。优选后跟长度为约3-约100、更优选为约4-约80个碱基，而更优选为约5-约40、更优选约5-约25、甚至更优选约10-约20个碱基。

实际上，5′外源序列任选地与靶序列具有一定水平的互补性，但其对初始引物结合步骤基本上不起作用。期望的是，所述后跟对核心引物具有小于95％的互补性。互补水平的另外实例可包括小于90％、85％、80％、75％、70％、65％和60％。用标准的算法可确定互补性。

本文所用术语“扩增”意即实施扩增反应。“反应混合物”或“反应器(reaction vessel)”意即含有用于实施反应的所有必需反应物的溶液或隔室(compartment)，其可包括但不限于在反应期间使pH维持在所选水平的缓冲剂、盐、辅助因子、清除剂(scavenger)等。

“互补或基本上互补”指杂交或碱基配对或核苷酸或核酸之间形成双链体，例如在两条dsDNA分子链之间或在寡核苷酸引物与单条核酸链上的引物结合位点之间。互补的核苷酸通常为A与T(或A与U)或C与G。当一条链上的核苷酸与另一条链上的核苷酸匹配至少约80％、通常至少约90％-95％和更优选约98-100％(任选经过用合适的核苷酸插入或缺失进行比对和比较)时，认为这两条单独的RNA或DNA分子链基本上互补。或者，当例如DNA链在选择性杂交条件下能与其互补物杂交时，就存在基本上互补。当在至少为14-25个核苷酸的片段内存在至少约65％互补、优选至少约75％、更优选至少约90％互补时，通常发生选择性杂交。参见Kanehisa Nucleic Acids Res.12：203，1984，该文以其整体在此引作参考。

“双链体”意即至少两条完全或部分互补的寡核苷酸和/或多核苷酸在其所有或大部分核苷酸之中经过Watson-Crick碱基配对，以形成稳定复合体。术语“退火”和“杂交”可互换使用，意即形成稳定的双链体。关于双链体的“完美配对”意即构成双链体的多核苷酸链或寡核苷酸链彼此形成双链结构，结果各链中的每一个核苷酸都与另一条链的核苷酸发生Watson-Crick碱基配对。

关于基因组或靶多核苷酸的“遗传基因座(Genetic locus)”或“基因座(locus)”，意即基因组或靶多核苷酸的邻接的亚区或区段。本文所用遗传基因座或基因座可指基因组中基因或部分基因的位置，或可指基因组序列的任何邻接部分而不管它是否在基因内或是否与基因有关。优选遗传基因座是指基因组序列的任何部分，其长度可从几十个核苷酸(例如10-30或10-100)到几百个核苷酸(例如100-1000或100-500)甚至到几千个核苷酸(例如1000-10,000或1000-3000)。在某些上下文中，遗传基因座可指基因组内核苷酸的位置。

“试剂盒”指用于递送实施本发明方法所用的材料或试剂的任何递送系统。在反应物测定方面，这样的递送系统包括使得能够储存反应试剂(例如在合适容器中的探针、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施测定的说明书等)；或将其从一个位置运输或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)。这样的内容物可一起或分开递送给既定的接受者。例如，第一个容器可含有用于测定的酶，而第二个容器含有探针。所述试剂盒还可含有适合容纳所述试剂的隔室。在一个实例中，隔室包含具有固定在其上参与扩增反应的寡核苷酸或引物或多核苷酸的固相基质。固相基质的实例是微阵列。因此，试剂盒可为具有试剂组分、核酸组分、硬件组分和指导组分(instructional component)的总扩增系统的一部分。

“微阵列”是指具有平坦表面的固相支持体，其具有核酸阵列，阵列中的各个成员包含固定在空间上确定的区域或位点(site)上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷贝，所述区域或位点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠；也就是说，所述区域或位点在空间上是离散的。此外，空间上确定的杂交位点可为“可寻址的”，因为其位置及其固定化的寡核苷酸的身份(identity)是已知或预先确定的(例如在其使用前是已知或预先确定的)。通常寡核苷酸或多核苷酸为单链，并通常由5′-端或3′-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的密度通常大于100/cm²，更优选大于1000/cm²。微阵列技术公开于以下参考文献中：Schena编辑的Microarrays：A PracticalApproach(IRL Press，Oxford，2000)；Southern，Current Opin.Chem.Biol.，2：404-410，1998，其全部内容通过引用结合到本文中。

“随机微阵列(random microarray)”指其中寡核苷酸或多核苷酸的空间离散区域不能在空间上寻址的微阵列。也就是说，所连接的寡核苷酸或多核苷酸的身份不能(至少最初不能)由其位置来辨别。在一个方面，随机微阵列为微珠的平面阵列(planar array)，其中各微珠连接有单种的杂交标志(tag)互补物(例如来自交叉杂交限度最低的寡核苷酸组的互补物)。同样，形成之后，随机阵列中的微珠或其寡核苷酸可根据多种方式来鉴定，包括通过光标记物(例如荧光染料比率)或量子点、形态、序列分析等等。

本文所用“核苷”包括天然核苷，包括2′-脱氧和T-羟基形式例如在Kornberg和Baker，DNA Replication，第二版(Freeman，SanFrancisco，1992)中所阐述。

“聚合酶链反应”或“PCR”意即用于通过同时的引物延伸DNA互补链来体外扩增特定DNA序列的反应。换言之，PCR是用于制备侧翼为引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制物的反应，这样的反应包括以下步骤的一次或多次重复：(i)使靶核酸变性，(ii)使引物退火至引物结合位点和(iii)在三磷酸核苷存在下通过核酸聚合酶延伸引物。反应通常在热循环仪中通过最适合每一步的不同温度来循环。具体温度、每一步的持续时间以及各步之间的变化速率取决于本领域一般技术人员熟知的多种因素，例如由以下文献举例的因素：McPherson等(编辑)，PCR：A Practical Approach and PCR2：A PracticalApproach(IRL Press，Oxford，分别1991和1995)。例如，在使用TaqDNA聚合酶的常规PCR中，双链靶核酸可在＞90℃的温度变性，引物在35-90℃范围的温度退火。术语“PCR”包括所述反应的衍生形式，其包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套式PCR、定量PCR、多重PCR、强化固相PCR(enhanced solid phase PCR)等。对于强化固相PCR的更详细资料，参见例如Park等，Analytical Biochemistry，375(2008)，第391-393页，其全部内容以其整体在此引作参考。在本发明某些实施方案中，优选使用强化固相PCR用于产生和/或扩增例如与HPV毒株相关的核酸分子。在强化固相PCR扩增与HPV毒株相关的核酸分子中，更优选使用本文所述的一对或多对正向/反向引物对。

当使用ESP-PCR(强化固相PCR)形式时，5-端磷酸基(5-prime phosphate)是任选的，因为单链扩增子不必作为最终PCR产物。在该形式中5-端胺(5-prime amine)官能团也是任选的，其可用作用荧光团进行标记以产生信号的优选手段。然而，也可用很多备选的信号产生手段，其中无需任何官能团或备选的官能团。例如，PCR引物可为非荧光标记的，并且可采用与信号缀合的单独的“信号寡核苷酸”。在另一实例中，当使用ESP-PCR形式时，可在无官能团的情况下使用所有‘水性’PCR引物，而信号则可借助掺入标记的核苷酸类似物的方法来备选地引入。在其它实施方案中，当使用ESP-PCR形式时，可在无官能团的情况下使用所有‘水性’PCR引物，而信号则可借助标记的固相引物来引入，以使双链产物中的信号增强。

产生单链扩增子的备选手段包括通过将链分开或通过除去双链体中的一条链，来使双链DNA转换为单链DNA。可通过破坏链内键的热手段或化学手段使双链体的链分开。除去一条链使得可回收所期需的链并消除其互补链，例如Nikiforov等(美国专利第5,518,900号)阐述了通过在经修饰的引物的5′端掺入硫代磷酸核苷酸衍生物，来修饰用于扩增的两条引物中的一条，使得其抵抗核酸外切酶的消化。在用聚合酶链式反应(PCR)扩增靶序列后，dsDNA受到核酸外切酶消化。未受保护的链优先被5’-3′核酸外切酶消化，留下由另一条链组成的单链产物。相似策略使用核酸外切酶抗性的分支引物(branch primer)(Shchepinov等，Nuc.Acids.Res.25：4447-4454 1997)或偏爱λ核酸外切酶的荷有5’磷酸基的底物(Higuchi等，Nucl.Acids Res.25：5685，1989)。

不对称PCR(Gyllensten和Erlich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：7652-76561998；美国专利第5,066,584号)通过采用不平衡的引物对浓度(由此一个引物处于受限浓度)在热循环期间产生ssDNA。由过量引物引发产生这种偏爱的ssDNA产物。

竞争性引物不对称PCR(Gillespie，1997；美国专利申请第08/628,417号)采用在PCR热循环后和进一步热循环之前单独加入竞争性引物，以产生ssDNA。Kaltenboeck等，Biotechniques 12：164-171，1992阐述了产生ssDNA的方法，即通过首先实施PCR以产生dsDNA，接着用首次PCR的产物作为模板用于采用一个引物的第二次线性扩增来进行单独反应。也参见美国专利第6,887,664号，例如对于异步PCR(asynchronous PCR)的阐述。

反应体积在几百纳升(例如200nL)到几百微升(例如200μL)的范围内。“逆转录PCR”或“RT-PCR”意即先进行逆转录反应然后扩增的PCR，所述逆转录反应将靶RNA转换为互补单链DNA，例如Tecott等美国专利第5,168,038号，该专利以其整体在此引作参考。“实时PCR”意即其中反应产物即扩增子的量随反应进行而受到监测的PCR。有很多种形式的实时PCR，它们主要的不同在于用于监测反应产物的检测化学，例如Gelfand等，美国专利第5,210,015号(“taqman”)；Wittwer等，美国专利第6,174,670号和第6,569,627号(插入染料)；Tyagi等，美国专利第5,925,517号(分子信标)；这些专利以其整体在此引作参考。用于实时PCR的检测化学综述于Mackay等，Nucleic AcidsResearch，30：1292-1305、2002中，该文也以其整体在此引作参考。“嵌套式PCR”意即两步PCR，其中第一次PCR的扩增子成为第二次PCR的样品，第二步PCR使用一套新引物，所述引物中的至少一个结合第一步的扩增子的内部位置。

推荐用正向引物和反向引物实施最初的引发事件，其中所述引物中的一个或二者携带与3’结合模板引物区缀合的非引物结合区5′外源核苷酸序列，其中在初次引发后所述外源核苷酸序列被掺入到扩增产物中。

与3’结合模板引物区缀合的非引物结合区5’后跟序列作为引物设计的应用，致使在初始引物结合事件后，所述后跟序列被掺入到扩增产物中。随后，该5’后跟序列起夹子作用以使同源物间的扩增效率均等。因此，扩增偏差限于初始引物结合事件。可根据需要将“后跟夹”置于正向引物和反向引物中的任一条或二者。关于“后跟夹”序列应包含什么序列以适合具体应用，这有很大的设计自由。3′模板结合引物序列可采取简并序列、共有序列或共有序列与简并序列杂合体的形式。也可采用精确匹配的目标序列库。在所有这些情况中，都可采用5’“后跟夹”原理。

“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，两者都意指核苷酸单体的线性聚合体。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体间相互作用的常规方式来与天然多核苷酸特异性结合，所述方式例如为Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen型或反Hoogsteen型碱基配对等等。

除非另外说明或上下文可明显看出，否则每当多核苷酸或寡核苷酸由字母(大写或小写)序列来表示时，例如“ATGCCTG”，就应该理解为所述核苷酸为从左到右以5’—>3′为顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，”T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。

“引物”意即寡核苷酸，为天然或合成的，其一旦与多核苷酸模板形成双链体后，就可作为核酸合成的起始点起作用，并从其3′端沿模板延伸，从而形成延伸的双链体。

通常用核酸聚合酶(例如DNA聚合酶或RNA聚合酶)来实施引物延伸。延伸过程中累加的核苷酸序列由模板多核苷酸序列决定。通常由DNA聚合酶来延伸引物。引物长度通常在14-40个核苷酸范围内或在18-36个核苷酸范围内。在多种核扩增反应中采用引物，例如线性扩增反应用单个引物，或PCR采用两个或多个引物。本领域一般技术人员熟知用于选作具体应用的引物长度和序列的指导原则，这由以下参考文献所证实：Dieffenbach(编辑)，PCR Primer：ALaboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Press，New York，2003)，该文献以其整体在此引作参考。

“样品”意即来自生物来源、环境来源、医学来源或患者来源的一定量的材料，在所述材料中探寻(seek)靶核酸的检测或测量。另一方面，它意味着包括标本或培养物(例如微生物培养物)。另一方面，它意味着同时包括生物学样品和环境样品两者。样品可包括合成来源的标本。生物学样品可为动物(包括人)、流体、固体(例如大便)或组织，以及液态及固态食物和饲料制品，和诸如奶制品、蔬菜、肉和肉类副产品及废物等成分。生物学样品可包括采自患者的材料，其包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、奶液、淋巴、痰液、精液、针吸出物等。生物学样品可获自各个科的所有的家畜以及野生家畜或野生动物，其包括但不限于诸如蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物等动物。环境样品包括环境材料(例如表面物质、土壤、水)和工业样品以及从食品和奶制品加工设备、仪器、装置、器具、一次性用品和非一次性用品获得的样品。这些实例不能理解为限制适用于本发明的样品类型。

因此，本发明的某些方面提供了用于扩增核酸靶分子的方法，所述方法包括：用正向引物和反向引物扩增所述核酸靶标的单链模板，其中至少一条引物含有与3’结合模板引物区缀合的非引物结合区5′外源核苷酸序列，其中在初次引发后将所述外源核苷酸序列掺入到扩增产物中。

本发明其它方面涵盖了通过用正向引物和反向引物的扩增来扩增包含在一群相关核酸分子内的核酸分子的改进的方法，所述方法包括：选出正向或反向引物中的一个或二者，以使所选的一个或二者含有与3’结合模板引物区缀合的非引物结合区5′外源核苷酸序列，其中在初次引发后所述外源核苷酸序列被掺入到扩增产物中。

后跟序列的实例包括：T7a启动子序列25聚体：AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G；M13/pUC测序引物(-40)GTT TTC CCA GTC ACG AC；M13/pUC测序引物(-20)，17聚体GTA AAA CGA CGG CCA GT；M13/pUC反向测序引物(-26)，17聚体CAG GAA ACA GCT ATG AC；M13/pUC测序引物(-40)，17聚体GTT TTC CCA GTC ACG AC；M13/pUC测序引物(-46)，22聚体GCC AGG GTT TTC CCA GTC ACG A；M13/pUC反向测序引物(-46)，24聚体GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG；SP6启动子测序引物，18聚体ATT TAG GTG ACA CTA TAG；SP6启动子测序引物，24聚体CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG2)；T7启动子测序引物，20聚体TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；T3启动子测序引物，17聚体ATT AAC CCT CAC TAA AG；和T3启动子测序引物，24聚体GCG CGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG。

由引物位点(例如上面所述位点)进行的扩增有效地使得可利用“通用”引物组，所述引物组在C和C’处结合以扩增来自分析物的一定范围毒株的X。此外，应该注意，用通用引物扩增的扩增子可包含保守区和可变区二者。

在某些实施方案中，使用扩增HPV序列的引物。更优选这些引物是：GP5+为5’TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3’及GP6+为5’GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C 3’。这些引物由HPV产生扩增子，所述扩增子同时包含保守区(在图2中定义为Y)和在不同HPV毒株间可变区(在图2中定义为X)两者。

在其它实施方案中，这些引物是：GP5d2+为5’TTT KTTACH GTK GTD GAT ACH AC 3’及T7aGP6d+为5’AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GGA AAH ATA AAY TGY AAD TCATAY TC 3’。

在另一实施方案中，这些引物是：GP5d3+为5’5Phos TTTGTT ACH GTD GTD GAY ACH AC 3’及T7aGP6d+*为5’/5AmMC6/AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGA AAHATA AAY TGY ARD TCA WAY TC 3’。

在其它实施方案中，引物对的正向引物选自：TR TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY A，其任选地具有与所述引物5’端缀合的caatcagc或/5Phos/caatcagc；CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GAT A，其任选地具有与所述引物5’端缀合的acaat或/5Phos/acaat；CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA，其任选地具有与所述引物5’端缀合的acaat或/5Phos/acaat；AAY CAR YTR TTT GTT ACT GTK GT，其任选地具有与所述引物5’端缀合的ggaac或/5Phos/ggaac；TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCG，其任选地具有与所述引物5’端缀合的cagctt或/5Phos/cagctt；TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCG YAG，其任选地具有与所述引物5’端缀合的cagctt或/5Phos/cagctt；GTK GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC，其任选地具有与所述引物5’端缀合的attac或/5Phos/attacc；和GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA，其任选地具有与所述引物5’端缀合的ctgtt或/5Phos/ctgtt；和引物对的反向引物选自：TGA AAA ATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCATG，其任选地具有与所述引物5’端缀合的actcactatagg或/5AmMC6/actcactatagg；CAY ARY TGA AAA ATA AAY TGY AAA TC，其任选地具有与所述引物5’端缀合的aatacgactcactatagg或/5AmMC6/aatacgactcactatagg；TR CAY ARY TGA AAA ATA AAY TG，其任选地具有与所述引物5’端缀合的tctaatacgactcactatagg或/5AmMC6/tctaatacgactcactatagg；和TR CAY ARY TGA AAA ATA AA，其任选地具有与所述引物5’端缀合的aattctaatacgactcactatagg或/5AmMC6/aattctaatacgactcactatagg。或者，所述正向引物和反向引物选自与上述引物相似的引物，但其与上述正向或反向引物可不同，不同之处在于：不同HPV毒株之间存在核苷酸取代的位点处有0-约5个核苷酸取代，优选0-约2个取代，但排除了在3′端处取代最后两个核苷酸。本发明还涵盖了如上述对正向或反向引物的取代一样对任选的后跟序列的类似取代，所述任选后跟结合上述任何正向或反向引物的5′端。在某些优选实施方案中，正向引物选自：CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA，其任选地具有与所述引物5’端缀合的acaat或/5Phos/acaat；和GTD GAT ACY ACHCG YAG TAC HAA，其任选地具有与所述引物5’端缀合的ctgtt或/5Phos/ctgtt。在某些其它优选实施方案中，反向引物选自：TGA AAAATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCA TG，其任选地具有与所述引物5’端缀合的actcactatagg或/5AmMC6/actcactatagg；和TRCAY ARY TGA AAA ATA AAY TG，其任选地具有与所述引物5’端缀合的tctaatacgactcactatagg或/5AmMC6/tctaatacgactcactatagg。

上面的阐述显示了用于本发明的引物对的实例。通过让不同的正向引物(例如GP5+、GP5d2+等)和反向引物(例如GP6+、T7aGP6d+)彼此配对可形成另外的引物对。

本发明某些实施方案涉及任何本文公开的引物的片段，包括所述引物片段的所有组合和亚组合，其下限为任何所公开引物的约20聚体的3-引发核心片段(3-prime core fragment)。本文所用“片段”指由原来的引物缺失一个或多个核苷酸而形成的截平引物或探针核酸寡聚体序列。

本发明还涵盖了对照序列的扩增。在一个实施方案中，对照序列可包括生物学样品所来源的受检者的基因组区域。然而，本发明决不受到这些具体的对照序列的限制，并且还涵盖了本领域技术人员显而易见的其它对照序列。此外，本发明方法也可在不扩增对照序列的情况下实施。

在某些实施方案中，用如下引物从人受检者基因组扩增对照序列：MLC1_F，其包含核苷酸序列5’TAC ACA CAG GTG TACACA GA 3’；和MLC1_R，其包含序列5’ACC AAG TAC TCT ACGTGT TG 3’。

在其它实施方案中，用如下引物由人受检者基因组扩增对照序列：mlc1_95f，其包含核苷酸序列5’GGC ACC CAG ACA TAC AC3’；和T7amlc1_275r(后跟MLCR)，其包含序列5’AAT TCT AAT ACGACT CAC TAT AGG GGA AAH ATA AAY TGY AAD TCA TAY TC3’。

可用任何DNA扩增方案来扩增分离的DNA。决不限制本发明的用于扩增DNA的一系列例示性方法阐述于“DNA Amplification：Current Technologies and Applications”(Demidov和Broude编辑，Horizon Bioscience，2004)中。

可用本领域已知的任何RNA方法来扩增分离的RNA，多种RNA扩增技术已被开发出。这些技术中主要的两种为：(i)采用热循环的技术，例如RT-PCR；和(ii)等温测定技术，例如基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton，Nature 350：91-92、1991；Kievits等，J.Virol.Methods 35：273-286，1991)和转录介导的扩增(TMA)(Hill，J.Clin.Ligand Assay 19：43-51，1996)。等温测定技术可再细分，所依据的是：(i)它们是否复制和扩增靶序列，例如TMA、NASBA和自动维持序列复制(3SR)(Guatelli等，Proc.Natl Acad.Sci.USA87：1874-1878、1990；Chadwick等，J.Virol.Methods 70：59-70，1998；综述参见Chan和Fox，Rev.Med.Microbiol.10：185-196，1999)；或(ii)它们是否产生可被进一步扩增的靶标依赖性信号，例如侵入检测(invader assay)(Lyamichev等，Nat.Biotechnol.17：292-296，1999；Ryan等，Mol.Diagn.4：135-144，1999)。有多种不易适合这些类别的其它扩增技术，例如Q β复制酶(Lizardi等，Biotechnology 6：1197-1202，1988)和分支DNA(Todd等，J.AIDS Hum.Retrovirol.10：S35-S44，1995；Pawlotsky等，J.Virol.Methods 79：227-235，1999)。然而，应该理解，本发明涵盖了本领域技术人员显而易见的任何RNA扩增方法。此外，应该理解，本发明还涵盖了逆转录酶或其功能等同物的应用，以将RNA转化为可随后扩增的DNA。

根据本发明，在上述方法步骤(iii)和/或(iv)中所述的扩增子被标记。可用任何方便的手段来标记本发明的扩增子。例示性的方法包括合成前和合成后的方法。合成前标记方法包括标记PCR引物，该引物随后用于经由PCR扩增扩增子并藉此掺入到扩增子中。在该方法中，标记物通常连接在适于扩增扩增子的引物的5’端，但也涵盖了在引物内的其它位置标记，例如3’标记或非末端标记。

在标记物和被标记的多核苷酸之间还可使用化学接头。适当的接头序列易于为本领域技术人员所确定，可能包括诸如C₆、C₇和C₁₂氨基修饰物的接头和包含巯基的接头。将易于确定的是，引物可包含接头和标记物，或只有接头而标记物可在以后步骤中连接。

扩增后标记方法包括缺口-标记系统，其中用Klenow聚合酶由扩增子或其功能等同物从随机引物合成被标记的多核苷酸。在合成期间可将被标记的核苷酸或包含接头基团的核苷酸掺入到Klenow聚合酶合成的多核苷酸中。

在任何情况下，其它标记方法对本领域技术人员将是显而易见的，应该理解，本发明决不限定或限制对标记方法的选择。

优选所用标记物为“荧光标记”或“荧光团”。很多不同的荧光标记为本领域技术人员所熟悉，荧光标记的选择决不限制本发明。在本发明其它优选实施方案中，本发明的荧光标记包含任何荧光标记，其可与多核苷酸连接并且可用选自以下的光源来激发：(i)氩离子激光器：包含蓝色的488nm谱线，其适用于激发多种染料及在绿到红的区域内发荧光的荧光染料。可调氩激光器还可用于发射一系列的波长(458nm、488nm、496nm、515nm和其它波长)。(ii)二极管激光器：其具有635nm的发射波长。目前可利用的其它二极管激光器运作波长为532nm。令人感兴趣的是，该波长最理想地激发碘化丙锭(PI)。PI染色广泛用于DNA分析、活/死细胞计数(live/dead counting)和倍数性测定。还可使用发射光波长大约为476nm的蓝光二极管激光器。(iii)氦氖激光器：发射红633nm谱线。(iv)氦镉激光器：发射波长325nm。(v)100W汞弧灯：用于激发UV染料例如Hoechst和DAPI的最有效的光源。

在本发明更优选实施方案中，荧光标记选自：羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、cascade蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白(PE)、PerCP、别蓝蛋白、Hoechst 33342、DAP1、SYTOX蓝、Hoechst 33258、色霉素A3、光神霉素(mithramycin)、YOYO-1、SYTOX绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-1、To-PRO-1、噻唑橙、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751；Alexa Fluor染料，包括Alexa Fluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700和-750；BoDipy染料，包括BoDipy 630/650和BoDipy 650/665；CY染料，特别是Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5和Cy7；6-FAM(荧光素)；PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT；六氯荧光素(Hex)；6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)；Oregon绿染料，包括488-X和514；罗丹明染料，包括X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX；TRITC、四甲基罗丹明(TMR)；羧基四甲基罗丹明(TAMRA)；四氯荧光素(TET)；红6B、FluorX、BODIPY-FL、SYBR绿I染料和德克萨斯红。在本发明特别优选实施方案中，标记为对实施本发明特别方便的Cy5。

然而，在本发明备选实施方案中，放射性或非放射性标记物可用于标记扩增子。方便的放射性标记物包括³²P和³H。可用任何方便的手段将这些标记物掺入到扩增子和/或引物中。还可使用多种非放射性标记方法。决不限制本发明的例示性的非放射性标记方法阐述于Speel(Histochem.Cell Biol.112：89-113、1999)中。

本文所用术语“反应物”应该理解包含固定到珠粒上的多核苷酸。更具体地说，各反应物包括以下多核苷酸：所述多核苷酸包含与按本文所述方法产生的扩增子互补的序列，它们与可从物理化学上区分的珠粒结合或缔合。反应物也可包括与前文所定义的对照序列互补的序列，所述对照序列即为由多细胞生物体基因组扩增所得的序列(Z)或在分析物毒株间保守的核苷酸序列的扩增子(Y)。

因此，反应物珠粒集合可包含：[B₁-cX₁、B₂-cX₂、B₃-cX₃...B_n-cX_n、B_y-cY、B_z-cZ]其中：B₁...B_n/B_y/B_z为各自可从物理化学上区分的珠粒；cX_n为固定到珠粒的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与特定核酸序列互补的核苷酸序列，所述特定核酸序列为分析物特异性或受检者分析物的特定毒株特异性，其中n为分析物数目或用珠粒集合检测的受检者分析物的特定毒株的数目；cY为任选珠粒集合的成员，其为固定到珠粒的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与分析物或受检者分析物毒株之间保守的序列互补的核苷酸序列；cZ为任选的珠粒集合成员，其为固定到珠粒的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与由多细胞受检者扩增得到的对照序列互补的核苷酸序列。

优选受检者分析物为HPV，而对照DNA序列为人基因组DNA序列。

“互补”应理解为被固定的反应物多核苷酸应该在低严格性条件下与按照本文所述方法产生的扩增子杂交。优选所述被固定的多核苷酸应该在中等严格性条件下与样品和标准品结合，最优选被固定的多核苷酸应该在高严格性条件下与样品和标准品结合。

本文提及低严格性包括并包含至少约0-至少约15％v/v甲酰胺(包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％和14％v/v甲酰胺)和至少约1M-至少约2M用于杂交的盐和至少约1M-至少约2M用于洗涤条件的盐。通常，低严格性为约25-30℃至约52℃，例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52℃。可改变温度，并且可使用较高的温度来代替甲酰胺和/或提供备选的严格性条件。需要时可施用备选的严格性条件，例如：中等严格性，该条件包括和包含至少约16％v/v-至少约30％v/v甲酰胺，包括16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、24％、26％、27％、28％、29％和30％v/v甲酰胺和至少约0.5M-至少约0.9M用于杂交的盐和至少约0.5M-至少约0.9M用于洗涤条件的盐；或高严格性，该条件包括和包含至少约31％v/v-至少约50％v/v甲酰胺和至少约0.01M-至少约0.15M用于杂交的盐和至少约0.01M-至少约0.15M用于洗涤条件的盐。一般而言，在T_m＝69.3+0.41(G+C)％下进行洗涤(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962)。然而，双螺旋DNA的T_m每降低1℃，错配碱基对的数目就增加1％(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.46：83，1974)。在这些杂交条件中甲酰胺是任选的。因此，特别优选的严格性水平如下来限定：低严格性为6xSSC缓冲液、0.1％w/v SDS、25-42℃；中等严格性为2xSSC缓冲液、0.1％w/v SDS、20℃到小于65℃的温度范围；高严格性为0.1xSSC缓冲液、0.1％w/v SDS、至少65℃的温度。

反应物珠粒集合的珠粒B₁...B_n、B_y、B_z为各自可从物理化学上区分的珠粒。术语“可从物理化学上区分”是指使得一种珠粒例如B₁可与另一种珠粒例如B₂有区别的任何物理或化学特性。因此，可从物理化学上区分的珠粒使得可区分特定反应物。

在某些优选实施方案中，珠粒包含“微粒”。本领域技术人员显而易见的是，几乎任何材料，均一的或不均一的，都可用于微粒。本文所涵盖的微粒也可包含不止一种物质，因此，可包含壳料(shells)、合金或有机和/或无机物质的混合物。可用于本发明并代表本发明优选实施方案的特别有用的材料包括选自如下名单的材料：二氧化硅(例如石英或玻璃)、乳胶、二氧化钛、二氧化锡、氧化钇、氧化铝和其它二元金属氧化物(例如ZnO)、钙钛矿和其它压电金属氧化物(例如BaTiO₃)、ZnS、蔗糖、琼脂糖和其它聚合物珠粒。在特别优选实施方案中，微粒包含二氧化硅。

在某些优选实施方案中，术语“可从物理化学上区分”指在珠粒尺寸、是否存在特定的光可检测标记物和/或光可检测标记物的强度中任一项的可测量的差异。

本发明所涵盖的珠粒可生产为任何方便的规则或不规则三维形状。然而，通常实践中合成的是为小的球状或类球状颗粒。这样的球状或类球状颗粒在本文中也称为“珠粒”。因此，在本发明优选实施方案中，本发明“微粒”基本上为球状或类球状，或包含“微球体”。

尽管本发明珠粒可称为“微球体”，但颗粒的实际尺寸视多种因素而定，颗粒实际上可或可不包含微米范围内的度量。在某些优选实施方案中，珠粒包含如下直径(或非球状颗粒的当量尺寸)：约300nm-约30μm，包括300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、5.0μm、5.1μm、5.2μm、5.3μm、5.4μm、5.5μm、5.6μm、5.7μm、5.8μm、5.9μm、6.0μm、6.1μm、6.2μm、6.3μm、6.4μm、6.5μm、6.6μm、6.7μm、6.8μm、6.9μm、7.0μm、7.1μm、7.2μm、7.3μm、7.4μm、7.5μm、7.6μm、7.7μm、7.8μm、7.9μm、8.0μm、8.1μm、8.2μm、8.3μm、8.4μm、8.5μm、8.6μm、8.7μm、8.8μm、8.9μm、9.0μm、9.1μm、9.2μm、9.3μm、9.4μm、9.5μm、9.6μm、9.7μm、9.8μm、9.9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm。更优选珠粒包括1μm-10μm之间的直径(或非球状颗粒的当量尺寸)。

在一个特别优选实施方案中，珠粒为由Genera Biosystems生产的AmpaSand(商标：Genera Biosystems)珠粒。这些珠粒为市售的，参见www.generabiosystems.com/generabiosystems/technology/AmpaSandBea ds/。然而，本发明不应该以任何方式具体受到这些珠粒的使用的限制。

可基于是否存在一种或多种“可光学检测的标记物”来区分珠粒。通常，特定珠粒可包含0、1、2、3、4、5种可光学检测的标记物。本文所用术语“可光学检测的标记物”是指发射荧光、磷光和/或白炽光的任何分子、原子或离子。方便的可光学检测的标记物包括发射紫外光(波长范围为约350nm-约3nm)、可见光(波长范围为约350nm-约800nm)、近红外光(NIR)(波长范围为约800nm-约1500nm)和/或红外光(IR)(波长范围为约1500nm-约10μm)的标记物。然而，由于可见光易于检测，因而在一个特别优选实施方案中，可光学检测的标记物可在可见光波长的范围内检测。

在本发明的另外优选实施方案中，可光学检测的标记物包含选自以下名单的一种或多种标记物：荧光团、半导体粒子、磷颗粒、掺杂颗粒或纳米晶体或量子点。

在本发明某些特别优选实施方案中，可光学检测的标记物为荧光团。本文所用术语“荧光团”指表现荧光性质的任何分子。为本文目的，术语“荧光”可定义为吸收特定波长光并再发射较长波长光的分子的性质。波长的改变涉及在该过程中发生的能量损失。术语“荧光团”可包含一系列可光学检测的标记物，例如化学荧光团和染料以及量子点。

可用于本发明的特别方便的可光学检测标记物为包埋的半导体荧光颗粒。这些可光学检测的标记物颗粒可以小到其性质和发射光为尺寸依赖性的。所述小的可光学检测的标记物颗粒在本领域中被称为半导体纳米粒、量子点、量子线、量子棒或纳米晶体或Q粒。然而，本文所用术语“量子点”或“QD”应该理解为包含所有这样的颗粒。此外，包含QD的可光学检测的标记物可包含近似球状或类球状颗粒或包覆的(coated)球状或类球状颗粒。然而，术语QD不应该认为以任何方式限于球状、类球状、环状、圆柱状或任何其它“点”形态。例如，本文所用QD还可包含其它形态，尤其包括棒状、椭圆状或涂覆的棒状或涂覆的椭圆状颗粒。

QD由半导体材料的纳米级晶体核组成；具有生物活性形式的QD通常由保护壳和外部涂覆物所包围。例如，QD可包含约2nm-约30nm直径的半导体晶体，并可在晶体内含有大约50-500,000个原子，其包括包含诸如ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、PbS、PbSe、PbTe、HgS、HgSe、HgTe、Si、ZnO等材料的发光的晶体。

QD荧光具有宽广的吸收谱和狭窄的发射谱。与具有明显吸收谱的某些其它荧光团不同的是，QD吸收宽谱范围的光，这使得量子点可被一系列的光源激发，这些光源例如激光器、弧灯或LED。此外，可将不同QD集合用于仅使用单一激发光源的多重应用。然而，每一点的发射谱通常非常窄，根据约30nm为次序，确切的颜色取决于粒子的直径和组成。此外，QD的狭窄发射谱使得可通过光谱分辨邻近的点。除上述益处之外，QD还是相对光稳定的，即使是在强烈激发期间，且其比荧光团更亮。

根据前述内容，还应该理解本发明包括使用不同尺寸的QD。

此外，本发明涵盖了用例如以下方法处理以使其能以高量子场发射并改进长时间的光稳定性的QD：热处理、表面改性、合金化、表面钝化或用表面涂层来覆盖(cap)。

还可从公司市购QD，例如Quantum Dot Corp.(QDC)，该公司生产QD，例如：Qdot[商标]605链霉亲和素缀合物，其含有在605nm处发射的硒化镉核。还可利用在525、565、585和655nm处发射的Qdot缀合物。然而，应该理解，本发明决不受QD(或任何其它可光学检测的标记物)的特定组成的限制，任何QD(市售或其它)均可适合本发明。

还有很多本领域可用的荧光染料，它们可用作本发明荧光团。决定荧光染料或其它荧光团的使用潜能的重要性质是荧光团的激发波长；它应该与光源的可用波长匹配。然而，很多不同的荧光染料和其它荧光团为本领域技术人员熟悉，荧光标记的选择决不限制本发明。可用于标记基材的特别方便的荧光染料包括上述关于标记PCR扩增子中讨论的荧光染料。然而，当选择荧光标记物时，用于一种或多种结合剂的荧光标记物的发射光谱应该与用于一种或多种扩增子的标记物的发射光谱不同。

有两种染色技术常用于荧光标记物珠粒和微球体-内部染色和外部染色(表面标记)。这两种技术产生具有独特性质的珠粒，每种都有利地用于不同应用。内部染色产生通常荧光发射狭窄的极度稳定的颗粒。这些珠粒往往对光致褪色表现出较大的抗性。因为荧光团处于珠粒内部，表面基团可用于将配体(蛋白质、抗体、核酸等)结合到珠粒表面。为此原因，内部标记的珠粒通常用于分析物检测和免疫测定应用。表面标记涉及荧光团与珠粒表面的缀合。因为荧光团是在珠粒表面，所以它们能够与其周围环境相互作用，这就如位于染色细胞上的荧光团一样。结果是使珠粒标准品在各种不同条件(例如存在污染物或pH改变)下表现出与染色细胞样品一样的激发和发射性质。表面标记的珠粒的“环境反应”性质使得其可理想地适用于模拟生物学样品。外部标记的珠粒通常在多种利用荧光检测的应用中用作对照和标准品。然而，本发明涵盖了珠粒与荧光标记物经由任何手段的缔合。

术语“磷光珠粒”、“磷珠粒”和“磷光体”在本文中可互换使用。构成可光学检测的磷光标记物的物质易于为本领域技术人员理解。然而，举例而言，决不限制本发明的合适的磷光体包括小颗粒的ZnS、ZnS:Cu、氧化铕和在展示装置中使用的其它磷光体。

包含“掺杂珠粒”的可光学检测的标记物可包括包含一种或多种稀土离子例如Eu、Y、Yb、Sm等的封闭量(occluded amount)的颗粒。

本文所用术语“可光学检测的标记物”应该理解为也包含多种可光学检测的标记物、可光学检测的标记物的混合物、涂覆的纳米晶体、合金和技术人员显而易见的其它复合混合物。所有这些可光学检测的标记物的应用可认为属于本文所述方法和试剂的范围内。

此外，反应物的可光学检测的标记物可包含掺入到固定的多核苷酸序列(其与珠粒结合或与珠粒缔合)的可光学检测的标记物，而不是标记物本身直接与珠粒缔合。

珠粒通常由固定的“标志”或探针寡核苷酸来标记。这种标志携带内部胺基(NH₂)，然后该胺基通过与琥珀酰亚胺酯染料缀合来修饰。在目前的设置中，所用染料为BODIPY-TMR。通过将已标记的标志与未标记的标志混合，然后将该混合物与珠粒缀合，可产生各类具不同荧光标记水平的珠粒。方便使用的比例为1∶5^x系列；也就是说，通过用未标记的标志：已标记的标志之比可产生不同的类别。这大体上在以下表4中例示。表4-未标记的标志与已标记的标志之比

类别	未标记标志的相对量	已标记标志的相对量
			所有	0	所有
无	所有	0
			1/5	5	1
1/25	25	1
			1/125	125	1

可以将可光学检测的标记物以一系列的浓度或强度施用于珠粒，从而提供特定珠粒“可从物理化学上区分”的另一基础。例如，若认为特定的可光学检测的信号的最大可检测强度为100％，则可将标记物施用于一系列的珠粒以提供如下强度：0％、2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。

在一个实施方案中，反应物的珠粒集合包含3.0μm、3.5μm、4.1μm、5.0μm、5.6μm和6.8μm的珠粒，其中3.0μm、3.5μm和4.1μm直径的珠粒以0％和100％进行标记，5.0μm直径的珠粒以0％、100％和20％进行标记，5.6μm和6.8μm直径的珠粒以0％、100％、20％和4％进行标记。

在另一实施方案中，反应物珠粒集合包含3.0μm、3.5μm、3.77μm、5.0μm、5.6μm和6.8μm的珠粒。所有珠粒尺寸(除3.0μm分为零TMR水平和高TMR水平外)都按照其各自的零TMR水平、中等TMR水平和高TMR水平来划分。

在其它实施方案中，设置TMR水平，以使在珠粒与寡核苷酸缀合过程中，具有确定的总寡核苷酸/荧光标记比的寡核苷酸可用于确定离散的TMR分组。例如，零TMR水平具有包含在缀合中的不标记的寡核苷酸；高TMR水平具有以3∶1的总寡核苷酸/荧光标记比包含在缀合中的寡核苷酸；而中等TMR水平具有以150∶1-80∶1的总寡核苷酸/荧光标记比包含在缀合中的寡核苷酸，其视珠粒尺寸而定。

可用任何方便的手段将反应物的固定的多核苷酸组分例如cX_n、cY和/或cZ与珠粒结合。

可在珠粒制备期间将固定的多核苷酸包封在珠粒中，或可在珠粒制备后将其连接到珠粒表面。用于缔合多核苷酸与珠粒的方法的选择将视所用材料而定，其易于为技术人员所确定。另外，为了增加所述多核苷酸与珠粒的结合，可在连接多核苷酸之前对珠粒实施进一步处理，包括硅烷化(用硅烷涂覆基材)。

通常，可用共价连接或吸附到珠粒表面的任何化合物涂覆珠粒，另外，反应物也应该具有用于连接多核苷酸的化学部分，例如巯基、胺基或羧基。具有这些特点的化合物的非限制性实例包括氨基末端硅烷(例如氨基-丙基三甲氧基甲硅烷和氨基-丙基三乙氧基甲硅烷)以及巯基末端硅烷(例如巯基-丙基三甲氧基甲硅烷和巯基-丙基三乙氧基甲硅烷)。除硅烷之外，诸如非共价连接到玻璃表面并静电吸附多核苷酸磷酸基的聚-L-赖氨酸等化合物也可在本发明范围内。因此，包括适用于将多核苷酸连接到表面的其它硅烷在内的其它化合物将易于为技术人员认识，但本发明不受化合物的选择所限。

用任何方便的手段可将多核苷酸连接到珠粒；通常这通过物理吸附或化学连接来进行。另外，可进一步用促进或增加多核苷酸吸附或结合到珠粒表面的试剂来涂覆珠粒，例如用氨基-硅烷。然而，实现该功能的其它试剂将易于为本领域技术人员所认识。在某些其它实施方案中，多核苷酸通过与珠粒巯基反应的寡聚的acrydite基团共价缀合珠粒。

在另一实施方案中，核酸分子经由通用锚定系统(UniversalAnchoring System，UAS)(商标：Genera Biosystems)结合珠粒。简而言之，该系统涉及使用“桥”核酸分子来将核酸“标志”序列连接到具有靶序列的基材上。所述“桥”序列与该标志序列部分互补并与该靶标序列部分互补，由此该桥序列可同时结合标志和靶标序列两者并使它们成一直线(in alignment)，以便可用连接酶来连接所述标志和靶标序列。UAS也可市购，其详述于www.generabiosystems.com/generabiosystems/technology/UAS/。然而，不应该认为本发明以任何方式受到核酸分子与基材的这种特定连接方法的限制。

可用任何方法测定扩增子与反应物之间是否发生结合，这些方法使得可定位与特定可从物理化学上区分的反应物结合的扩增子标记物。在特别优选实施方案中，使用流式细胞术。可将流式细胞术定义为当颗粒或细胞在液态悬浮液中移动或流动时测定其性质的技术。可用更熟悉的实验室设备显微镜来作类比，以进一步阐述该技术。大部分显微镜具有以下组件：光源

典型的显微镜采用灯泡来照亮物体。在流式细胞仪中，光源通常为激光器。因为激光器提供非常强而集中的单色光束，所以使用激光器。在进行荧光测量中光的单色性特别重要。镜台

在显微镜中，镜台可以移动，以使物体进入物镜视野中。在流式细胞仪中，细胞或颗粒存在于液态悬浮液中。液体响应气压而流动，经过物镜，由此携带细胞或颗粒通过视野。镜头

在显微镜和流式细胞仪中，镜头都收集来自物体的光。滤光器

某些显微镜具有滤光器以选择对观察者最重要的光特征。这对于荧光显微镜尤其如此。在荧光中，染料分子由特征波长的光激发，然后产生较长波长的发射光。滤光器滤去激发光以使发射光可被观察或测量。检测器

在显微镜中，光检测器是观察者。流式细胞仪则采用称作光电倍增管(PMT)的高灵敏度光检测器。检测器必须能够测量由细胞或颗粒发射的短暂闪光，所述细胞或颗粒以高达每秒数千个的速率逐一通过物镜视野。

大部分流式细胞仪可测量光散射和荧光两者。

在某些优选实施方案中，按照本发明方法用流式细胞术检测或分选珠粒。然而，本发明决不受上文所述的特定流式细胞术方法或仪器的限制。提供该实例仅为了说明目的，本发明不限于该实例所提供的仪器或方法。

用流式细胞术，可通过物体的光散射来测定既定珠粒的尺寸。

光散射是光和物质的相互作用。包括珠粒在内的所有物质都散射光。其主要由反射光或折射光组成。所观察的物体的位置往往决定了可以观察到什么。在流式细胞仪中，光散射检测器通常位于激光器的对面(相对于细胞或颗粒)、在激光器的一边，与流体流动/激光束交叉点成一直线。由这些检测器测得的量度分别称为前向光散射和侧向光散射。

前向光散射提供关于单个细胞或颗粒的相对尺寸的某些信息，而侧向光散射提供关于单个珠粒的相对粒度的某些信息。通常将它们联合使用以区分未分离的哺乳动物血液中白细胞的不同主要类别，但也用于大量其它测定，例如测定微粒的尺寸。

本发明人业已确定流式细胞术能够区分直径约3.0μm、约3.5μm、约4.1μm、约5.0μm、约5.6μm和约6.8μm的珠粒。本发明人还确定流式细胞术能够区分直径约3.0μm、约3.5μm、约3.77μm、约5.0μm、约5.6μm和约6.8μm的珠粒。又可区分其它珠粒类别，例如5.0与5.6及5.6与6.8。因此，本发明人业已确定流式细胞术可区分高达至少6种不同尺寸的珠粒。

除检测尺寸之外，流式细胞仪通常还具有用于检测样品中荧光的一种或多种激光器和检测器。荧光是分子吸收特定波长并再发射更长波长的性质。波长变化涉及在该过程中发生的能量损失。正是这一特征使得荧光极为有用：滤光器可用于为检测器或观察者滤除激发光。因此，测量或观察到的唯一光就是来源于荧光团的光。本底或杂散光的干扰对检测器的影响极低。

有很多种用于流式细胞术的荧光染料。它们结合多种细胞化学组分，例如核酸；蛋白质；特定细胞膜、核和细胞质受体；胞内离子分子；和很多其它组分。决定荧光染料用于流式细胞检测的可能性的关键性质是激发波长，即它应该与光源的可用波长相匹配。

在其它方面，本发明提供了用于在受检者中诊断病原体分析物感染的方法，所述方法包括：(i)从被推定包含所述病原体分析物的受检者获得生物学样品；(ii)从所述样品分离出核酸；(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸，所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株而言是独特的；(iv)任选地扩增来自受检者的对照核酸序列；(v)任选对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多种扩增子进行标记；(vi)使被标记的一种或多种扩增子与反应物珠粒集合杂交，其中珠粒集合的各成员包含与分析物或分析物的特定毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子，该核酸分子已与可从物理化学上区分的珠粒结合或缔合；和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合；其中扩增子与特定反应物的缔合表明受检者受到分析物感染。

在其它方面，在至少一种信号寡核苷酸序列存在下发生杂交。

在其它方面，在至少一种阻断寡核苷酸序列存在下发生杂交。

本文所用术语“受检者(subject)”指对另一分析物易感的任何生物体。因此，“受检者”包括但不限于动物、植物、真菌和细菌(其可被噬菌体感染)。本文所用术语“动物”优选包括哺乳动物，更优选灵长类，包括低级灵长类，甚至更优选人。然而，术语“动物”还特别包括家畜，例如牛、马、绵羊、猪、山羊和驴，以及实验室动物。实验室试验动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿动物例如大鼠和小鼠提供方便的试验系统或动物模型，灵长类和低级灵长类也是如此。还涵盖了非哺乳动物，例如禽类、斑马鱼、两栖动物(包括蔗蟾蜍)和果蝇(Drosophila)属，例如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)。

“受检者”也可为非动物，例如植物。术语“植物”特别包括具有农业价值的植物，例如谷类植物(例如小麦、大麦、燕麦、黑麦、小黑麦(triticale)和玉米)、水稻、果树(例如苹果树、香蕉树、芒果树和柑橘树)、甘蔗、园艺作物植物(例如马铃薯、胡萝卜和洋葱)等。

然而，在某些优选实施方案中，本发明提供了在人受检者中诊断HPV感染的方法，所述方法包括：(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品；(ii)从所述样品分离出核酸；(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸，所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株而言是独特的；(iv)任选地扩增来自人受检者基因组DNA的对照核酸序列；(v)任选对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多种扩增子进行标记；(vi)使被标记的一种或多种扩增子与反应物珠粒集合杂交，其中珠粒集合各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子，该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合；和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合；其中扩增子与特定反应物的缔合表明人受检者受到HPV感染。

本发明在某些方面还涵盖了用于测定人受检者发展与一种或多种HPV毒株有关的疾病的方法，所述方法包括：(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品；(ii)从所述样品分离出核酸；(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸，所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株而言是独特的；(iv)任选地扩增来自人受检者基因组DNA的对照核酸序列；(v)任选对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多种扩增子进行标记；(vi)使被标记的一种或多种扩增子与反应物珠粒集合杂交，其中珠粒集合各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子，该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合；和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合；其中扩增子与包含多核苷酸的特定反应物的缔合表明受检者中所述疾病的风险增加，所述多核苷酸和与特定疾病有关的HPV毒株互补。

当对步骤(v)中所述的扩增子标记时，扩增子和珠粒二者都被标记。

与一种或多种特定HPV毒株有关的例示性的疾病包括表3中所提出的疾病。因此，本发明在某些方面提供了用于诊断受检者增加发展特定疾病风险的方法，所述方法通过特异性鉴定感染受检者的HPV毒株来进行。在某些特别优选实施方案中，所述方法适用于测定人受检者发展子宫颈癌的风险。

本发明进一步涵盖了用于本文所述方法的诊断试剂盒，包括诊断人受检者HPV感染和/或评估人受检者发展HPV相关疾病(包括子宫颈癌)的风险。试剂盒包含反应物珠粒集合，每一个珠粒都包含特定HPV毒株核苷酸序列的互补多核苷酸，该多核苷酸已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合。任选试剂盒还可包含以下引物：所述引物结合不同HPV毒株间保守序列，但产生包含对各HPV毒株独特的核苷酸序列的扩增子，其中所产生的扩增子被推定与结合或缔合试剂盒的一种或多种可从物理化学上区分的珠粒的多核苷酸互补。

在某些实施方案中，反应物的珠粒集合包含至少珠粒组，每组包含约3.0μm、约3.5μm、约4.1μm、约5.0μm、约5.6μm和约6.8μm中的任一种直径。在另外的优选实施方案中，各种尺寸的珠粒组包含一种或多种微球体亚组，每个亚组具有一系列不同强度的荧光标记物。荧光标记物为TMR，可以约0％、约4％、约20％和约100％的强度施用。

在其它实施方案中，反应物的珠粒集合包含至少珠粒组，各组包含约3.0μm、约3.5μm、约3.77μm、约5.0μm、约5.6μm和约6.8μm的直径中的任一种。设置TMR水平，以使在珠粒与寡核苷酸缀合过程中，具有确定的总寡核苷酸/荧光标记比的寡核苷酸可用于确定离散的TMR分组。例如，零TMR水平具有包含在缀合中的不标记的寡核苷酸；高TMR水平具有以3∶1的总寡核苷酸/荧光标记比包含在缀合中的寡核苷酸；而中等TMR水平具有以150∶1-80∶1的总寡核苷酸/荧光标记比包含在缀合中的寡核苷酸，其视珠粒尺寸而定。

在另外的实施方案中，试剂盒包含引物GP5+与GP6+和任选的引物MLC1_F与MLC1_R。

在另外的实施方案中，试剂盒包含引物GP5d2+与T7aGP6d+和任选的引物mlc1_95f与T7amlc1_275r。

在其它实施方案中，试剂盒包含引物GP5d3+与T7aGP6d+*和任选的引物mlc1_95f与T7amlc1_275r。

本发明包括另外的引物对实施方案，其中本文所述的单独的正向引物(例如GP5+、GP5d2+等)和反向引物(例如GP6+、T7aGP6d+)彼此组合。

试剂盒也可呈固相芯片或固相支持体的形式，一般称为生物芯片。可将用于本测定的所有或部分试剂加入到生物芯片中，或小型化为纳米测定中。尽管流式细胞术在测量本测定的输出中尤其有用，但可将生物芯片用于测量或自动测量其它信号，例如与回音壁模测定(whispering gallery mode assay)有关的信号。

尽管荧光强度是多重分析法的优选方面，但本发明包含其它识别形式。一个这样的备选方法包括回音壁模(WGM)检测。在该实施方案中，将荧光标记掺入到珠粒子集，或掺入或结合到珠粒表面的DNA。这种荧光标记可通过激光器或未聚焦白光源或用已滤未聚焦的白光源激发WGM。

WGM使得仅有某些波长的光能由所述颗粒发射出来。这一现象的结果是来自例如荧光团的常见宽发射带(10-100nm宽)变得受约束，并且出现一系列的有效对应于颗粒内光的标准模式图(standingmode pattern)的尖峰。根据本发明，业已确定WGM谱(WGM profile)对微球颗粒表面变化极为敏感，并且当微球颗粒与其环境内的分析物或分子相互作用时，WGM谱会改变。

因此，本发明其它方面涵盖了检测分析物(例如来自HPV毒株的包含毒株特异性序列的扩增子)的方法，所述方法包括使至少一个微球颗粒集合与被推定包含所述分析物的样品接触，其中微球颗粒集合内的每个颗粒包含可光学检测的标记物和固定的被推定的所述分析物的结合配偶体(例如能够结合、捕获或固定来自HPV毒株的扩增子的引物或探针)，其中每一颗粒集合具有确定的WGM谱，其中所述分析物与所述固定的结合配偶体的结合导致所述至少一个微球颗粒集合的所述WGM谱改变，这表明存在所述分析物。

本发明方法可施用于检测微球颗粒的WGM谱的调整(modulation)，其中所述调整起因于对样品中的分子与固定到微球颗粒表面的潜在结合颗粒的结合或缔合的检测。对分析物与其结合配偶体之间的结合反应的检测基于WGM谱的改变，这使得能鉴定并分离出分析物。

本发明的特征在于可用大范围的光源激发微球颗粒，这促进了对很多不同WGM谱的测量。

“可光学检测的标记物”可为发射荧光、磷光和/或白炽光的任何分子、原子或离子。在本发明某些其它优选实施方案中，可光学检测的标记物为荧光团，所述荧光团可包含多种可光学检测的标记物，例如化学荧光团和染料以及量子点。

在某些实施方案中，本发明提供至少一种包含直径为1μm-100μm的乳胶或二氧化硅颗粒的微球颗粒，其用可光学检测的标记物例如荧光团或量子点标记，所述颗粒进一步包含待检测的分析物的被推定的结合配偶体。实例为能够结合HPV扩增子的捕获核酸分子，所述扩增子通过用两个引物扩增来产生，所述引物针对位于毒株特异性区域侧翼的HPV基因组的保守区。可光学检测的标记物能够在可见波长下检测，所述微球颗粒表现出一种或多种WGM谱。当分析物与固定在颗粒上的结合配偶体起作用时，微球颗粒的一种或多种可检测WGM谱调整。WGM谱的任何这样的变化表明存在业已结合其结合配偶体的分析物。

在单链扩增子与珠粒杂交期间，珠粒可包含阻断寡核苷酸。阻断寡核苷酸具有与对应的单链扩增子的珠粒-探针结合区有差异的预留点(deliberate point)。混合物中每一种珠粒-探针可有阻断寡核苷酸。阻断寡核苷酸意欲适当地起定位过滤器(pitched filter)的作用。在热变性接着温度缓慢下降的情况下，首先出现大部分有效的杂交事件。在初期，类型特异性扩增子根据类型来结合匹配的珠粒-探针。阻断寡核苷酸可结合并饱和珠粒-探针，其降低热概况(thermal profile)。这可防止发生类型交叉的杂交事件(其中与阻断寡核苷酸相比，各个类型之间在探针结合区内有更多的差异点)或防止发生其它非特异性杂交(例如其它扩增子，包括引物二聚体产物的非特异性杂交)。可存在用于人对照以及各种HPV类型的阻断寡核苷酸。阻断寡核苷酸的实例如上表2所示。阻断寡核苷酸和与类型特异性的珠粒探针区(阻断设计所针对的区)互补的序列之间的相似性水平可介于40％-95％之间。另一相似性水平实例为75％-85％之间。

对于为了产生信号直接使用荧光标记的PCR引物，可使用信号寡核苷酸作为选择。信号寡核苷酸是结合扩增子产物的荧光标记的探针，两者的结合位点不同于扩增子与珠粒-探针区的结合位点，以便在杂交时产生珠粒-探针/扩增子/信号寡核苷酸复合体。其使用优点是：排除了在生产期间对荧光标记(并繁琐地处理)PCR引物的需要；对于相同的灵敏度(和成本益处)，使用少得多的荧光标记的寡核苷酸；降低荧光本底，使得不经洗涤步骤就能达到更高的灵敏度(处理和风险益处)；由于杂交复合体中额外水平的“套嵌(nesting)”而在缺乏阻断寡核苷酸下提高灵敏度；和在“检测”步骤中可能使用更多的PCR产物。所有这些益处将促成“单管(single tube)”方法。信号寡核苷酸的实例阐述于以上表2中。

或者，双链DNA特异性染料(例如SYBR绿I染料)可与信号寡核苷酸一起或代替信号寡核苷酸作为一种方式用于将信号与珠粒上的扩增子连接。

本发明通过以下非限制性实施例进一步阐述。实施例1HPV诊断-DNA分离和扩增

用于HPV诊断方法中的用于分离DNA的DNA提取方案的概述于图1中出示。

如图2所示，用PCR扩增DNA样品。将引物GP5d2+和T7aGP6d+用于产生对应于DNA样品中存在的任何HPV毒株的扩增子。引物T7aGP6d+包含荧光标记物(特别是A647)，使得随后使与结合剂结合的扩增子可视化。产生的病毒扩增子包含在检查的所有HPV毒株间保守的保守区(Y)和在HPV毒株间可变(即毒株特异性)的区域X_n，其中n代表与各HPV毒株有关的可变区。固定在珠粒上的结合配偶体与HPV毒株特异性基因组特异性结合。

同样地，还使用了mlc1_95f和T7amlc1_275r引物作为对照产生人受检者基因组DNA扩增子。在该情况下，引物T7amlc1_275r也携带A647标记物。实施例2HPV诊断-多重检测

让实施例1产生的扩增子与结合剂阵列杂交，每种结合剂都携带与待决的病毒扩增子的可变区互补的多核苷酸，所述病毒扩增子由HPV毒株6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、67和68(X₁到X₁₆)中的每一种产生。参见表2固定在珠粒上的捕获核酸的核苷酸序列。此外，阵列可任选地包含含有与HPV病毒扩增子保守区(Y)互补的多核苷酸的结合剂。最后，包含与人对照扩增子序列互补的多核苷酸的结合剂也包括在阵列内。捕获核酸可为DNA或RNA。若使用RNA，则可需要逆转录酶来由DNA扩增子产生RNA。

阵列中的每一种结合剂都包含具有不同尺寸和不同强度的荧光(TMR)标记物的微球体或珠粒。包含3.0μm、3.5μm、3.77μm、5.0μm、5.6μm和6.8μm直径的珠粒可用流式细胞术来将彼此区分，如图4所示。

对于各种既定尺寸的微球体，以0％、大约150-80∶1(中等)和大约3∶1(高)的相对强度掺入荧光标记物(TMR)。用流式细胞术可清楚地区分这些标记物强度。实施例3多重检测法与传统HPV诊断的比较

以下表5提供了本发明多重HPV检测法与目前用于HPV诊断的组织学方法之间的比较的概述。表5HPV诊断方法的比较

HPV诊断方法	通量	报告	对照
				本发明	每台仪器每天1600例	所有13种“高危”毒株单独鉴定	内部对照、阳性对照、人gDNA对照
基于组织学的方法	每天350例	一般鉴定“高危”类别	无内部对照、有“低危”阳性对照、“高危”阳性对照

实施例4用于探针方法的灵敏度测试用各种引物组合从含有HPV类型特异性插入物的质粒扩增后进行的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

将5微升各种产物在含有5微升HyperladderIV DNA分子量标准旁边的各个泳道上逐一点样。用40000个拷贝的类型特异性质粒(泳道号表明类型)作模板进行反应，用44℃的退火温度进行40个扩增循环。泳道中标‘x’表示由于在PCR期间的蒸发损失而未对反应物进行分析。泳道中标‘-’表示无模板的对照。将200个或100个拷贝的类型特异性质粒连同10ng的Jurkat人基因组DNA用作PCR的模板，其采用与MLC1_95f和T7aMLC1_275r多重化的GBHPVf3+和GBHPVr1。用44℃的退火温度进行58个扩增循环。在λ核酸外切酶消化并与PapType探针珠粒杂交后，通过流式细胞术进行分析。无模板的对照在所有类型中产生阴性结果。使用200个拷贝的类型特异性质粒，所有测试类型：6、11、16、18、31、45、51、52、56、58、59、66和68均产生阳性结果。除了类型51和59外，通过使用100个拷贝的类型特异性质粒，以上所有类型均产生阳性结果，表明该方法为非常灵敏并相对无偏差的系统。

当本文所用的范围用于物理性质时，例如温度或序列中核苷酸的数目时，范围的所有组合及亚组合及其中的特定实施方案意欲包括在内。

本领域技术人员应该明白，本文所述发明除明确阐述的内容外，还容允变体和修改。应该理解，本发明包括所有这样的变体和修改。本发明还包括本说明书个别或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何或更多种所述步骤或特征的任何组合和所有组合。参考文献Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.46：83，1974Chadwick等，J.Virol.Methods 70：59-70，1998Chan和Fox，Rev.Med.Microbiol.10：185-196，1999Compton，Nature 350：91-92，1991Demidov和Broude(编辑)，“DNA Amplification：Current Technologiesand Applications”，Horizon Bioscience，2004Gearhart等，www.emedicine.com/MED/topic 1037.htm，2004Guatelli等，Pr℃.Natl Acad.Sci.USA 87：1874-1878，1990Hill，J.Clin.Ligand Assay 19：43-51，1996Kievits等，J.Virol.Methods 35：273-286，1991Kuske等，Appl.Environ.Microbiol.64(7)：2463-2472，1998Lizardi等，Biotechnology 6：1197-1202，1988Lyamichev等，Nat.Biotechnol.17：292-296，1999Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962Nelson和Krawetz，Anal.Biochem.207(1)：97-201，1992Pawlotsky等，J.Virol.Methods 79：227-235，1999Ryan等，Mol.Diagn.4：135-144，1999Speel，Histochem.Cell Biol.112：89-113，1999Todd等，J.AIDS Hum.Retrovirol.10：S35-S44，1995

Claims

1.用于检测HPV毒株和/或用于区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合，其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集，所述珠粒集合含有：

(a)至少两个珠粒子集，其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开；或

(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集，其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一，并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族；或

(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合；并且

其中：

所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联，或任选与至少一种对照核酸序列偶联，前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与珠粒子集中其它被标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记，并且在任何单个珠粒子集内，其各珠粒家族具有不同荧光强度，其中所述核酸捕获探针选自SEQ ID NO:46-63；和

其中HPV基因组的HPV毒株特异性区域为通过扩增获自推定具有HPV人受检者的生物样品的核酸而产生的扩增子，其中所述扩增子对所述HPV或所述HPV的特定毒株是独特的，并且其中所述扩增子使用正向引物和反向引物的寡核苷酸扩增引物对产生，其中所述引物对的正向引物选自SEQ ID NO: 1-8，并且所述引物对的反向引物选自SEQ ID NO:9-12，并且其中正向引物和反向引物中至少之一在引物5’端与后跟缀合；并且

每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的，其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族；其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定出一种或多种特异性HPV毒株。

2.权利要求1的珠粒集合，其中所述正向引物后跟选自：

CAATCAGC、ACAAT、GGAACAAT、GGAAC、CAGCTT、ATTACC、CTGTT、/5Phos/CAATCAGC、/5Phos/ACAAT、/5Phos/GGAACAAT、/5Phos/GGAAC、/5Phos/CAGCTT、5Phos/ATTACC和/5Phos/CTGTT。

3.权利要求1的珠粒集合，其中所述珠粒尺寸选自：3.0μm、3.5μm、3.77μm、5.0μm、5.6μm和6.8μm。

4.权利要求1-3中任一项的珠粒集合，其中所述被标记的珠粒用选自以下的荧光染料标记：羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、cascade蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白、PerCP、别蓝蛋白、Hoechst 33342、DAP1、SYTOX蓝、Hoechst 33258、色霉素A3、光神霉素、YOYO-1、SYTOX绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-1、To-PRO-1、噻唑橙、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、Alexa Fluro-350、Alexa Fluro-430、Alexa Fluro-488、Alexa Fluro-532、Alexa Fluro-546、Alexa Fluro-555、Alexa Fluro-556、Alexa Fluro-594、Alexa Fluro-633、Alexa Fluro-647、Alexa Fluro-660、Alexa Fluro-680、Alexa Fluro-700和Alexa Fluro-750、BoDipy 630/650和BoDipy 650/665、CY染料Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5和Cy7、6-FAM、PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT、六氯荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、Oregon绿染料488-X和514、罗丹明染料X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX、TRITC、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明、四氯荧光素、Red 6B、FluorX、BODIPY-FL、SYBR绿I染料和德克萨斯红。

5.权利要求4的珠粒集合，其中所述被标记的珠粒用TMR标记。

6.权利要求1的珠粒集合，其包含2-17个珠粒家族。

7.权利要求1-3中任一项的珠粒集合，其中所述珠粒集合包含17个珠粒家族。

8.权利要求1的珠粒集合，其中所述两种或更多种HPV毒株选自毒株6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。

9.用于制备用于检测HPV毒株和/或区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合的方法，所述方法包括基于尺寸、荧光强度或这二者选出多个珠粒家族或珠粒子集，所述方法包括：

提供

(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合；并且

其中：

所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联，或任选与至少一种对照核酸序列偶联，前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记，并且在任何单个珠粒子集内，其各珠粒家族具有不同荧光强度，其中所述核酸捕获探针选自SEQ ID NO:46-63；并且

其中HPV基因组的HPV毒株特异性区域为通过扩增获自推定具有HPV人受检者的生物样品的核酸而产生的扩增子，其中所述扩增子对所述HPV或所述HPV的特定毒株是独特的，并且其中所述扩增子使用正向引物和反向引物的寡核苷酸扩增引物对产生，其中所述引物对的正向引物选自SEQ ID NO: 1-8，并且所述引物对的反向引物选自SEQ ID NO:9-12，并且其中正向引物和反向引物中至少之一在引物的5’端与后跟缀合；并且

每一珠粒家族对检测HPV毒株都是特异性的，其不同于珠粒集合内的任何其它珠粒家族；和

混合至少两个珠粒家族或至少两个珠粒子集以产生珠粒集合，所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定出特异性HPV毒株。

10.权利要求9的方法，其中所述正向引物后跟选自：

11.权利要求1-8中任一项的珠粒集合以及引物对在制备用于诊断人受检者HPV感染的试剂盒中的用途，其中

所述引物产生对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的扩增子，其中所述引物对的正向引物选自SEQ ID NO: 1-8，并且所述引物对的反向引物选自SEQ ID NO:9-12，并且其中正向引物和反向引物中至少之一在引物的5’端与后跟缀合；并且

所述珠粒集合包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子，该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合。

12.权利要求11的用途，其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集，所述珠粒集合含有：

(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合；并且

其中：

所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联，或任选与至少一种对照核酸序列偶联，前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记，并且在任何单个珠粒子集内，其各珠粒家族具有不同荧光强度；和

每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的，其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族；其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。

13.权利要求1-8中任一项的珠粒集合和引物对在制备用于测定人受检者发展与一种或多种HPV毒株有关的疾病风险的试剂盒中的用途，其中

所述引物产生对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的的扩增子，其中所述引物对的正向引物选自SEQ ID NO: 1-8，并且所述引物对的反向引物选自SEQ ID NO:9-12，并且其中正向引物和反向引物中至少之一在引物的5’端与后跟缀合；并且

14.权利要求13的用途，其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集，所述珠粒集合含有：

(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合；并且

其中：

15.用于靶向致癌HPV的寡核苷酸扩增引物对，其中所述引物对的正向引物选自SEQ ID NO :1-8；

而所述引物对的反向引物选自SEQ ID NO: 9-12；并且

其中所述正向引物和反向引物中至少之一在所述引物5’端与后跟缀合。

16.权利要求15的引物对，其中所述正向引物后跟选自：

17.权利要求15的引物对，其中所述反向引物后跟选自SEQ ID NO: 87-93和/5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTATAGG。

18.权利要求15的引物对，其含有任选的后跟核酸序列，其中所述引物对的正向引物选自：

CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA ，其任选地具有与所述引物的5’端缀合的/5Phos/ACAAT 或/5Phos/GGAACAAT ；和

GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA ，其任选地具有与所述引物的5’端缀合的/5Phos/CTGTT 。

19.权利要求15的引物对，其含有任选的后跟核酸序列，其中所述引物对的反向引物选自：

TGA AAA ATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCA TG ，其任选地具有与所述引物的5’端缀合的/5AmMC6/ACTCACTATAGG ；

TR CAY ARY TGA AAA ATA AAY TG ，其任选地具有与所述引物的5’端缀合的/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG。