CN114058678A - 一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用 - Google Patents

一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用，属于分析检测领域。所述脱氧核酶探针包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，以SEQ ID NO.2为底物链，SEQ ID NO.2含有一个RNA碱基A，且在该碱基两侧的T碱基上分别连接荧光基团F和荧光猝灭基团Q。在识别特异性目标蛋白后，SEQ ID NO.1将SEQ ID NO.2链切割至短链，进而产生荧光。该检测原理与具有高通量检测能力的液滴微流控系统相结合，可实现大肠杆菌的快速、高通量检测，并可有效区分耐药型和非耐药型大肠杆菌，进行细菌耐药表型分析，实现准确测定，可广泛应用于实际样本中大肠杆菌的耐药类型诊断，对实现污染控制、进一步防止抗生素滥用、阻止多药耐药菌的形成等方面具有重大意义。

Description

一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
耐药菌已成为人类健康和生态系统安全的重大威胁，针对细菌耐药表型的快速、高通量检测是实现耐药菌有效控制的关键。目前，耐药菌和抗性基因已在我国的土壤、河流、垃圾处理厂、医疗制药厂与养殖厂及附近的纳污体系、甚至饮用水、大气中被广泛检出，人类健康和生态系统的安全受到严重威胁。因此，发展对于耐药菌的快速、高通量检测技术，以便迅速诊断细菌的耐药类型，对实现污染控制、进一步防止抗生素滥用、阻止多药耐药菌的形成等方面具有重大意义。
当前细菌耐药性检测方法主要包括培养法和基因检测法。其中，培养法是耐药菌检测的标准方法，但受灵敏度限制，该方法需对采集样本长时间培养，获得相对大量存活的细菌来满足定性和定量分析的准确性，具有周期长(1～2天)、样品前处理步骤繁琐等固有缺陷，已经难以满足当前环境监测的需求。近年来，发展了多种基于基因检测的新兴分子生物学技术，例如定量PCR(FilmArray BCID)、合成生物学(CRISPR)、测序法(OxfordNanopore MinION)以及一些新兴的生物传感法。许多细菌鉴定和耐药基因检测方法可将检测时间缩短至数小时且检测通量较高，但对于低浓度细菌(1～100CFU/mL)仍需长时间培养富集、检测通量有限。此外，这些方法通常需要昂贵的设备和复杂的样品前处理(如细胞裂解、核酸提取)来纯化和富集目标，而且纯化时还可能导致目标物丢失，进一步降低检测灵敏度；更重要的是，这些方法仅能基因检测，均无法实现耐药菌表型分析。对细菌进行快速表型分析依旧是当前研究的热点和技术痛点。因此，建立具有高灵敏、高通量、快速的细菌耐药表型分析方法是解决耐药菌快速识别及环境监测的关键。
目前，针对耐药菌的高通量、快速检测方法多为基因分析法，只能完成基因型分析，并不能实现表型分析。但抗药基因并不能直接表明样本中存在耐药细菌，且细菌抗性表型具有多样性与可变性，为获得更详细的耐药信息，开发新型、高通量的耐药菌表型分析方法具有重要意义。
发明内容
脱氧核酶的生物学识别功能与抗体极为相似，且具有靶标范围广、稳定性高、便于化学修饰和合成等诸多优点。因此，其为识别分子广泛应用于核酸、蛋白质、生物活性分子、疾病标志物的识别与检测，并表现出良好的应用前景。本课题组研究发现，已筛选的脱氧核酶探针(RFD-EC)能有效识别大肠杆菌，通过本发明的研究发现了RFD-EC在有效区分耐药型大肠杆菌中的新应用。利用具有特定结构的脱氧核酶探针为传感分子，RFD-EC的分子包括两条碱基互补配对的脱氧核苷酸链：5’short和FS28，其结构见图1，在FS28上同时键合荧光基团和猝灭基团，当不存在大肠杆菌特异性分泌蛋白时，RFD-EC处于荧光猝灭状态，在激光照射下，形成较低的荧光检测背景；当检测到大肠杆菌特异性分泌蛋白时，FS28的脱氧核苷酸链被切割至短链，分子内的荧光基团(F)与猝灭基团(Q)距离加大，在激发光照射下可以恢复荧光，产生强烈的荧光信号。在大肠杆菌检测中，我们已初步实现高效识别和药物敏感性分析，验证了方法的可行性。但受到酶标仪灵敏度限制，仍需长时间培养细菌，用时较长(约2～4h)。
针对现有技术的不足，本发明提供了一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用。本发明拟在前期研究基础上，结合具有高通量、高灵敏的液滴微流控荧光检测平台，加快分析速度(约0.5～1h完成)。
本发明的技术方案为：
一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用，所述脱氧核酶探针包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，以SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链为底物链，所述SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链含有一个RNA碱基A，且在该碱基两侧的T碱基上分别连接荧光基团F和猝灭基团Q。
进一步地，上述技术方案中，SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链可部分进行碱基互补配对。
进一步地，上述技术方案中，所述大肠杆菌耐药表型包括耐抗生素型大肠杆菌。
进一步地，上述技术方案中，所述耐抗生素型大肠杆菌包括：耐四环素型大肠杆菌、耐卡那霉素型大肠杆菌、耐粘菌素型大肠杆菌、耐氯霉素型大肠杆菌。
进一步地，上述技术方案中，所述SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸链(5’short)具有识别、催化、切割功能，可以在识别特异性目标蛋白后，将SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链(FS28)链切割至短链，进而产生荧光。
进一步地，上述技术方案中，所述SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸链具有识别、催化、切割功能，在检测到具有耐药表型的大肠杆菌所分泌的目标蛋白质时，SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸链(5’short)催化底物SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链切割(FS28)切割至两条短链，将SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链(FS28)中的荧光基团F与荧光猝灭基团Q分离，产生荧光信号，完成大肠杆菌耐药表型的高通量传感。
进一步地，上述技术方案中，包括以下步骤：
a)培养大肠杆菌，稀释菌浓度至104～106CFU/mL；
b)大肠杆菌离心后，用反应溶液重悬，反复吸打均匀；
c)将用荧光基团F和荧光淬灭基团Q标记的SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链与SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸链混合，形成RFD-EC识别分子；
d)将抗生素(视检测大肠杆菌耐药型的种类相应的加入抗生素)、大肠杆菌、RFD-EC识别分子及参比溶液，采用Naica crystal digital PCR系统测定，采用油包水式液滴微流控芯片将细菌包裹至微液滴中，优化细菌浓度，使得每个微液滴内包裹的细菌数目≤1，设置激发和发射波长与所用荧光标记的分子和参比溶液的激发和发射波长相匹配，设定每个检测通道的曝光值，测定荧光强度，完成大肠杆菌耐药表型高通量传感。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤a)中大肠杆菌的培养条件为：摇床的温度为37℃，摇速为150～200rpm。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤b)中反应溶液成分为20～60mmol/L HEPES，120～160mmol/L NaCl，5～20mmol/L BaCl2。.
进一步地，上述技术方案中，所述步骤b)中离心的条件为8000rpm下离心10min(4℃)。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤c)荧光基团F包括FAM、FITC、Cy3、Cy5，荧光淬灭基团Q包括Dabcyl。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤c)的SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸链的浓度为80～120μmol/L，体积为2.5μL，SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链的浓度为8～12μmol/L，体积为0.5μL。
进一步地，上述技术方案中，所述参比溶液包括AF647。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤d)抗生素与大肠杆菌的体积比为1:1，加入系统中的液体的总体积为25μL，其中包括3μL的RFD-EC识别分子，1μL的参比溶液(AF647)，蓝色通道的激发波长为Ex：415-480nm，发射波长为Em：495-520nm；绿色通道的激发波长为Ex：530-550nm，发射波长为Em：560-610nm；红色通道的激发波长为Ex：615-645nm，发射波长为Em：655-720nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明方法具有快速响应的优势(检测可在30分钟内完成)。
2、本发明方法的特异性好，可有效区分大肠杆菌与多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，具有显著的识别特异性，对大肠杆菌的传感结果更准确。
3、本发明方法可在实际样本中特异性检测出大肠杆菌，可实现大肠杆菌的快速、高通量检测，并可有效区耐药型和非耐药型大肠杆菌，迅速诊断细菌的耐药类型，对实现污染控制、进一步防止抗生素滥用、阻止多药耐药菌的形成等方面具有重大意义。
4、本发明方法具有较高的检测灵敏度(检测下限低至100个大肠杆菌)和较高的检测通量(三个检测通道，12个检测通路)。
附图说明
图1为5’short和FS28的结构。
图2为本发明中RFD-EC识别大肠杆菌的原理图。
图3为本发明实施例1中利用RFD-EC识别耐四环素型大肠杆菌的荧光液滴计数统计图，其中图3(a)、3(b)、3(c)分别代表100个、1000个和10000个细菌。
图4为本发明实施例2中单层液滴成像图，其中，图4(a)、4(b)、4(c)分别代表芯片的照片、芯片中液滴的局部放大图、在荧光显微镜下液滴照片(液滴中的亮点代表大肠杆菌)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，通过实施例对本发明进行说明。本发明所列的这些具体实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
表1：本发明中使用的核酸序列
Figure BDA0003331813700000061
实施例1利用RFD-EC识别分子快速测定耐四环素型大肠杆菌
利用RFD-EC识别分子快速测定耐四环素型大肠杆菌，原理如图2所示，具体操作如下：
a)培养耐四环素型大肠杆菌的工程菌，在5mL的SOB培养基中加入10μL的耐四环素菌，进行过夜培养，摇床的温度为37℃，摇速为150rpm；
b)过夜培养后，采用酶标仪测定大肠杆菌的菌浓度，当OD600＝0.5时，将细菌从摇床中取出，此时细菌的浓度约为108CFU/mL；
c)采用无菌水对耐四环素型大肠杆菌进行稀释，使菌浓度在105CFU/mL；通过计算在10.5μL的细菌样本中，细菌的数目分别为100、1000、10000个细菌；
d)将细菌在8000rpm下离心10min(4℃)，采用RB溶液进行重悬，RB溶液成分为50mmol/L HEPES，150mmol/L NaCl，15mmol/L BaCl2，并采用移液枪反复吸打均匀；
e)采用FAM和Dabcyl分子对SEQ ID NO.2分子进行荧光标记，形成SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸；
f)将SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2混合，形成RFD-EC识别分子；
g)在试管中加入10.5μL抗生素(浓度是32μg/mL)、10.5μL大肠杆菌、3μL RFD-EC识别分子(包括2.5μL 100μM的SEQ ID NO.1和0.5μL 10μM的SEQ ID NO.2)及1μL的AF647参比溶液，采用Naica crystal digital PCR系统测定，其中，芯片购于Sapphire Chips(型号：C14012)，采用油包水式液滴微流控芯片将细菌包裹至微液滴中，优化细菌浓度，使得每个微液滴内包裹的细菌数目≤1，设置激发和发射波长与所用荧光标记的分子和参比溶液的激发和发射波长相匹配，其中，使用蓝色通道作为检测通道，红色通道作为参比通道，蓝色通道的激发波长为Ex：415-480nm，发射波长为Em：495-520nm；红色通道的激发波长为Ex：615-645nm，发射波长为Em：655-720nm，设定每个检测通道的曝光值，其中，蓝光通道的曝光时间为280ms，红光通道的曝光时间为150ms，测定荧光强度。
图3为本实施例中利用RFD-EC识别耐四环素型大肠杆菌的荧光液滴计数统计图，其中图3(a)、3(b)、3(c)分别代表100个、1000个和10000个细菌。由实验结果可以看出，该方法的细菌计数结果与实际细菌数量成正相关。
实施例2利用RFD-EC识别分子快速测定耐卡那霉素型大肠杆菌，并进行细菌计数
利用RFD-EC识别分子快速测定耐卡那霉素型大肠杆菌，具体操作如下：
a)培养耐卡那霉素型大肠杆菌的工程菌，在5mL的SOB培养基中加入10μL的耐卡那霉素菌，进行过夜培养，摇床的温度为37℃，摇速为150rpm；
b)过夜培养后，采用酶标仪测定大肠杆菌的菌浓度，当OD600＝0.5时，将细菌从摇床中取出，此时细菌的浓度约为108CFU/mL；
c)采用无菌水对耐卡那霉素型大肠杆菌进行稀释，使菌浓度在104～106CFU/mL，通过计算在10.5μL的细菌样本中，细菌的数目分别为100、1000、10000个细菌；
d)将细菌在8000rpm下离心10min(4℃)，采用RB溶液进行重悬，RB溶液成分为60mmol/L HEPES，130mmol/L NaCl，25mmol/L BaCl2，并采用移液枪反复吸打均匀；
e)采用FAM和Dabcyl分子对SEQ ID NO.2分子进行荧光标记，形成SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸；
f)将SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2混合，形成RFD-EC识别分子；
g)在试管中加入10.5μL抗生素(浓度是32μg/mL)、10.5μL大肠杆菌、3μL RFD-EC识别分子(包括2.5μL 100μM的SEQ ID NO.1和0.5μL 10μM的SEQ ID NO.2)及1μL的AF647参比溶液，采用Naica crystal digital PCR系统测定，采用油包水式液滴微流控芯片将细菌包裹至微液滴中，优化细菌浓度，使得每个微液滴内包裹的细菌数目≤1，设置激发和发射波长与所用荧光标记的分子和参比溶液的激发和发射波长相匹配，其中，使用蓝色通道作为检测通道，红色通道作为参比通道，蓝色通道的激发波长为Ex：415-480nm，发射波长为Em：495-520nm；红色通道的激发波长为Ex：615-645nm，发射波长为Em：655-720nm，设定每个检测通道的曝光值，其中，蓝光通道的曝光时间为280ms，红光通道的曝光时间为180ms，测定荧光强度。
图4为本实施例中单层液滴成像图，图4(a)、4(b)、4(c)分别代表芯片的照片、芯片中液滴的局部放大图、在荧光显微镜下液滴照片(液滴中的亮点代表大肠杆菌)。由图4可以看到，在显微镜下可清晰的观察到细菌被液滴包裹，呈现明显的荧光亮点。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连理工大学
<120> 一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用
<130> 2021
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
gatgtgcgtc ttgatcgaga cctgcg 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
agaactagct tggtatcgat ccttctca 28

Claims (10)

1.一种脱氧核酶探针在大肠杆菌耐药表型高通量传感中的应用，其特征在于：所述脱氧核酶探针包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，以SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链为底物链，所述SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链含有一个RNA碱基A，且在该碱基两侧的T碱基上分别连接荧光基团F和荧光猝灭基团Q。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链可部分进行碱基互补配对。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述大肠杆菌耐药表型包括耐抗生素型大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述耐抗生素型大肠杆菌包括：耐四环素型大肠杆菌、耐卡那霉素型大肠杆菌、耐粘菌素型大肠杆菌、耐氯霉素型大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸链具有识别、催化、切割功能，在检测到具有耐药表型的大肠杆菌所分泌的目标蛋白质时，SEQID NO.1所示的脱氧核苷酸链催化底物SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链切割至两条短链，将SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链中的荧光基团F与荧光猝灭基团Q分离，产生荧光信号，完成大肠杆菌耐药表型的高通量传感。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
a)培养大肠杆菌，稀释菌浓度至104～106CFU/mL；
b)大肠杆菌离心后，用反应溶液重悬，反复吸打均匀；
c)将用荧光基团F和荧光淬灭基团Q标记的SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链与SEQ IDNO.1所示的脱氧核苷酸链混合，形成RFD-EC识别分子；
d)将抗生素、大肠杆菌、RFD-EC识别分子及参比溶液，采用Naica crystal digitalPCR系统测定，采用油包水式液滴微流控芯片将细菌包裹至微液滴中，优化细菌浓度，使得每个微液滴内包裹的细菌数目≤1，设置激发和发射波长与所用荧光标记的分子和参比溶液的激发和发射波长相匹配，设定每个检测通道的曝光值，测定荧光强度，完成大肠杆菌耐药表型高通量传感。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤b)中反应溶液成分为20～60mmol/L HEPES，120～160mmol/L NaCl，5～20mmol/L BaCl2。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤c)荧光基团F包括FAM、FITC、Cy3、Cy5，荧光淬灭基团Q包括Dabcyl；所述步骤c)的SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸链的浓度为80～120μmol/L，体积为2.5μL，SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链的浓度为8～12μmol/L，体积为0.5μL。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述参比溶液包括AF647。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤d)抗生素与大肠杆菌的体积比为1:1，加入系统中的液体的总体积为25μL，其中包括3μL的RFD-EC识别分子，1μL的参比溶液，蓝色通道的激发波长为Ex：415-480nm，发射波长为Em：495-520nm；绿色通道的激发波长为Ex：530-550nm，发射波长为Em：560-610nm；红色通道的激发波长为Ex：615-645nm，发射波长为Em：655-720nm。
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CN115094061A (zh) * 2022-06-30 2022-09-23 大连理工大学 一种酸性条件下识别大肠杆菌的链状脱氧核酶探针与应用
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