CN108220458A - 一种检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针及其应用 - Google Patents

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曲龙
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Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针及其应用。本发明提供的用于检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针的结构如下：ACTCTTCCTAGCFRQGGTTCGATCAAGACACGGATCCTGACAAGGGCCAAGTTAGAATTCTAGCGTAGGGAGAGTCTCCGCCTGCAGCTCCGTCCG，其中，F是由荧光基团修饰的T碱基；Q是由淬灭基团修饰的T碱基；R代表单个插入的RNA碱基A。通过实验证明：本发明的探针可快速、准确、高灵敏的检测金黄色葡萄球菌。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种主要细菌(由金黄色葡萄球菌引起的感染占第2位，仅次于大肠杆菌)，同时也是医院内外感染最常见的病原菌之一，会引起肺炎和脑膜炎，其所致感染病死亡率高、耐药性严重，给治疗带来极大困难。由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒也极为普遍，每年都有病例报告，造成极大的经济损失。
目前，世界各国均将金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。早期诊断和治疗是提高金黄色葡萄球菌感染者治愈率的关键，建立新颖的高通量SA检测技术，开发快速、灵敏、准确的试剂盒是亟待解决的重大课题之一。
脱氧核酶为DNA片段，非蛋白质，仅能由人工合成，非生物体组成成分，分子量小，易于合成，稳定性高，不仅与RNA底物配对的精确性高，RNA分解酶活性强，而且不需要胞内酶类的参与。此外脱氧核酶具有与一般药物相似的动力学特点，对靶RNA水平的抑制程度及时间容易控制，这就决定了脱氧核酶在医药和生物学上的不可取代性和开发的必要性。近年来，可选择性催化剪切DNA中嵌入的RNA碱基的荧光标记DNA酶(RNA-cleavingFluorescent DNAaymes，RFD)模型，可快速、准确、高灵敏的检测与其特异性结合的配体。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针。
本发明提供的用于检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针的结构如下：ACTCTTCCTAGCFRQGGTTCGATCAAGACACGGATCCTGACAAGGGCCAAGTTAGAATTCTAGCGTAGGGAGAGTCTCCGCCTGCAGCTCCGTCCG，其中，F是由荧光基团修饰的T碱基；Q是由淬灭基团修饰的T碱基；R代表单个插入的RNA碱基A。
上述探针中，
所述荧光基团为Fluorescein、Pyrene、Acridine、DEA(Diethylaminocoumarin)、Bodipy 493/503、ATTO 488、Alexa fluor 488、Alexa fluor 532、Alexa fluor 546、Alexafluor 647、Alexa fluor 750、AMCA(7-Amino-4-methylcoumarin)、Biotin、AminolinkerC12、Aminolinker C7、CY-3、CY-5、CY5.5、CY-7、digoxigenin、FAM、6-FAM、FITC、HEX、JOE、Phosphate、Rhodamine Green、Rhodamine Red、Rhodamine B、ROX(X-rhodamine)、TAMRA(Tetramethylrhodamine)、NBD、TET、Texas Red、Texas Red-X、Thiol、Thiol-C6S-S、Thiol-C3、Thiol-C3S-S、Biotin TEG、NAP(Naphthofluorescein)、DyLight 680、DyLight 752或DyLight 770；所述荧光基团具体为Fluorescein；
所述淬灭基团为DABCYL、TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2或BHQ3；所述淬灭基团具体为DABCYL。
上述探针中，淬灭基团应根据荧光基团的发射波长范围来选择，淬灭基团的淬灭范围应包括荧光基团的发射波长。本发明中的荧光基团为Fluorescein，其发射波长为517nm，则应选择淬灭基团DABCYL(淬灭范围为400-530nm)。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针溶液。
本发明提供的用于检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针溶液是将上述探针与缓冲液混匀得到的溶液。
上述脱氧核酶探针溶液中，
所述脱氧核酶探针溶液是将上述探针的水溶液与缓冲液混匀后得到的溶液；
所述探针在所述脱氧核酶探针溶液中的浓度为0.01-5uM。
上述脱氧核酶探针溶液中，
所述探针在所述脱氧核酶探针溶液中的浓度为0.048uM或0.182uM。
上述脱氧核酶探针溶液中，
所述缓冲液是将NaCl、MgCl2、吐温20与100mM HEPES(pH 9.0)(生工生物工程(上海)股份有限公司，产品目录号A100511)混匀得到的缓冲液；各溶质在缓冲液中的浓度为：400mM NaCl、10mM MgCl2、质量分数为0.02％吐温20。
本发明的第三个目的是一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒。
本发明提供的用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒包括上述1或2所述的脱氧核酶探针或上述脱氧核酶探针溶液。
本发明的第四个目的是提供上述脱氧核酶探针或上述脱氧核酶探针溶液或上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述脱氧核酶探针或上述脱氧核酶探针溶液或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌中的应用。
本发明还提供了上述脱氧核酶探针或上述脱氧核酶探针溶液或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的产品中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的方法。
本发明提供的检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的方法包括如下步骤：将待测样品与上述脱氧核酶探针溶液混合，反应，得到反应产物；将所述反应产物中的寡核苷酸沉淀，得到寡核苷酸沉淀，检测所述寡核苷酸沉淀；根据所述寡核苷酸沉淀判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌；
若所述寡核苷酸沉淀中含有大小为96bp和81bp的条带，则所述待测样品中含有或候选含有金黄色葡萄球菌；
若所述寡核苷酸沉淀中不含有大小为96bp和81bp的条带，则所述待测样品中不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌。
上述方法中，所述检测所述寡核苷酸沉淀的方法为用dPAGE胶进行跑胶检测。
本发明的第六个目的是提供一种检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的方法。
本发明提供的检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的方法包括如下步骤：分别将待测样品和阴性对照与权利要求3或4所述的脱氧核酶探针溶液混合，反应，分别得到反应产物；根据所述反应产物的荧光强度判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌，
若所述反应产物的荧光强度高于阴性对照的荧光强度，则所述待测样品中含有或候选含有金黄色葡萄球菌；
若所述反应产物的荧光强度等于或小于阴性对照的荧光强度，则所述待测样品中不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌。
上述方法中，所述阴性对照为不含有金黄色葡萄球菌的物质，具体可以为水、LB培养基或牛奶液。
上述方法中，检测所述反应产物的荧光强度的方法为在酶标仪上检测所述反应产物的荧光强度。所述检测的条件：激发波长为488nm，发射波长为517nm。
本发明提供了一种可与金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针(RFD-SA)，通过实验证明：本发明的探针可快速、准确、高灵敏的检测金黄色葡萄球菌。
附图说明
图1为RFD-SA探针的特异性验证。
图2为RFD-SA探针对不同浓度金黄色葡萄球菌细胞培养上清液检测灵敏度的验证。图2A为在LB中的检测灵敏度验证；图2B为在牛奶中的检测灵敏度验证。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌、艰难梭菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、副溶血弧菌均购自ATCC，其中单增李斯特菌(Listeria monocytohenes)ATCC编号为：bio-52964；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC编号为：bio-72780；阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的ATCC编号为：bio-62217；大肠杆菌(Escherichia coli)的ATCC编号为：bio-74119；沙门氏杆菌(Salmonella enterica)的ATCC编号为：bio-72790；艰难梭菌(Clostridium difficile)的ATCC编号为：bio-61427；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的ATCC编号为：bio-67776；志贺氏菌(Shigella sp.)的ATCC编号为：bio-74105；副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的ATCC编号为：bio-69678。
实施例1、脱氧核酶探针(RFD-SA)的合成
1、脱氧核酶探针(RFD-SA)的合成
将ACTCTTCCTAGCFRQGGTTCGATCAAGA(大连宝生物公司)和CACGGATCCTGACAAGGGCCAAGTTAGAATTCTAGCGTAGGGAGAGTCTCCGCCTGCAGCTCCGTCCG利用DNA连接酶进行连接反应，在37℃下反应30分钟，得到具有如下结构的脱氧核酶探针(RFD-SA)：ACTCTTCCTAGCFRQGGTTCGATCAAGACACGGATCCTGACAAGGGCCAAGTTAGAATTCTAGCGTAGGGAGAGTCTCCGCCTGCAGCTCCGTCCG，其中，FRQ的结构如式Ⅰ所示：F是由荧光基团Fluorescein修饰的T碱基；Q是由淬灭基团DABCYL修饰的T碱基；R代表单个插入的RNA碱基A。本发明的探针与金黄色葡萄球菌中的特异性蛋白结合，结合后会改变探针的二级结构，从而激活探针的催化活性，对脱氧核酶探针中的单个RNA分子进行自剪切，探针被自剪切后，可以得到大小为81bp的片段。
2、将步骤1得到的5mL浓度为80umol/L的脱氧核酶探针(RFD-SA)与195ml的双蒸去离子水混匀，得到脱氧核酶探针(RFD-SA)水溶液(2uM)。
实施例2、利用dPAGE胶检测脱氧核酶探针(RFD-SA)的特异性
1、检测溶液的配制
向200uL反应管中加入20uL的2x反应缓冲溶液和2uL的脱氧核酶探针(RFD-SA)水溶液，得到检测溶液。脱氧核酶探针(RFD-SA)在检测溶液中的浓度为0.182uM。
2x反应缓冲液溶液是将NaCl、MgCl2、吐温20与100mM HEPES(pH 9.0)(生工生物工程(上海)股份有限公司，产品目录号A100511)混匀得到的缓冲液；其中，各溶质在缓冲液中的浓度为：400mM NaCl、10mM MgCl2、质量分数为0.02％吐温20。
2、待检测溶液的配制
分别将单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌、艰难梭菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、副溶血弧菌在LB培养液培养，在37℃培养箱中孵育至光密度(OD)值0.9，在8000rpm下离心10分钟，弃沉淀，分别取上清液，分别得到李斯特菌的待检测溶液、金黄色葡萄球菌的待检测溶液、阪崎杆菌的待检测溶液、大肠杆菌的待检测溶液、沙门氏杆菌的待检测溶液、艰难杆菌的待检测溶液、铜绿假单胞菌的待检测溶液、志贺氏菌的待检测溶液、副溶血弧菌的待检测溶液。
3、特异性反应
分别将18uL的待检测溶液加入到2ul的检测溶液中，分别得到反应液，反应30分钟以后，采用乙醇沉淀的方法(乙醇浓度为70％)分别将反应液中的寡核苷酸沉淀出来，得到寡核苷酸沉淀；再将寡核苷酸沉淀溶于上样缓冲液，最后用dPAGE胶进行跑胶分析。并以LB培养液为阴性对照。
结果如图1所示：第一泳道为剪切Marker，长度为81个碱基(GGTTCGATCAAGACACGGATCCTGACAAGGGCCAAGTTAGAATTCTAGCGTAGGGAGAGTCTCCGCCTGCAGCTCCGTCCG)；第二泳道为对照Marker，长度为96个碱基(ACTCTTCCTAGCFRQGGTTCGATCAAGACACGGATCCTGACAAGGGCCAAGTTAGAATTCTAGCGTAGGGAGAGTCTCCGCCTGCAGCTCCGTCCG)。经过本发明的探针剪切后，只有金黄色葡萄球菌的泳道含有大小为96bp和81bp的两条带，有与剪切Marker对应长度的碱基出现，说明检测溶液(RFD-SA)只对金黄色葡萄球菌特异性反应，对其他对照细菌及阴性对照均无任何剪切反应。
因此可以通过如下方法检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌：
将待测样品与脱氧核酶探针溶液混合，反应，得到反应产物；将反应产物中的寡核苷酸沉淀，得到寡核苷酸沉淀，检测寡核苷酸沉淀；根据寡核苷酸沉淀判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌；
若寡核苷酸沉淀中含有大小为96bp和81bp的条带，则所述待测样品中含有或候选含有金黄色葡萄球菌；
若寡核苷酸沉淀中不含有大小为96bp和81bp的条带，则所述待测样品中不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌。
实施例3、在酶标仪上检测脱氧核酶探针(RFD-SA)的灵敏度
1、在96孔板的每个孔中滴加2uL浓度为2uM的脱氧核酶探针(RFD-SA)水溶液和40uL的2x反应缓冲液，脱氧核酶探针(RFD-SA)在检测溶液中的浓度为0.048uM。设置平行、对照实验。
2、在孔中分别加入40uL含有不同体积的(0.008uL，0.02uL，0.04uL，0.08uL，0.2uL，0.4uL，0.8uL，2uL，4uL，8uL)光密度值为0.9的金黄色葡萄球菌细胞培养上清液的LB培养液，得到含有不同浓度的金黄色葡萄球菌培养上清液的LB培养液；并以LB培养液作为阴性对照。
在孔中分别加入40uL含有不同体积的(0.008uL，0.02uL，0.04uL，0.08uL，0.2uL，0.4uL，0.8uL，2uL，4uL，8uL)光密度值为0.9的金黄色葡萄球菌细胞培养上清液的牛奶液，得到含有不同浓度的金黄色葡萄球菌培养上清液的牛奶液。并以牛奶液作为阴性对照。
3、在振荡器上震荡2分钟，放置室温反应30分钟。
4、在酶标仪上分别检测各孔的荧光强度。检测条件：激发波长为488nm，发射波长为517nm。由于探针上连有荧光标记基团，靶RNA被剪切后，荧光基团会发光，可以通过在酶标仪上检测是否有荧光来判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌，并可以反应本发明的脱氧核酶探针的灵敏度。
按照实施例2中的方法电泳检测不同浓度的金黄色葡萄球菌培养上清液的LB培养液和不同浓度的金黄色葡萄球菌培养上清液的牛奶液中的金黄色葡萄球菌。
荧光检测结果和电泳检测结果如图2所示，图2A为不同浓度的金黄色葡萄球菌培养上清液的LB培养液的荧光检测和电泳检测结果；图2B为不同浓度的金黄色葡萄球菌培养上清液的牛奶液的的荧光检测和电泳检测结果。其中，第一泳道为剪切Marker，长度为81个碱基；第二泳道NC为对照Marker，长度为96个碱基。从图中可以看出：无论在图2A所示的LB培养液中，还是图2B所示的牛奶液体中，脱氧核酶探针(RFD‐SA)都能够对金黄色葡萄球菌特异性响应，并且检测的灵敏度可达到2uL金黄色葡萄球菌培养上清液/40uL被检测液。且含有不同浓度的金黄色葡萄球菌培养上清液的LB培养液及含有不同浓度的金黄色葡萄球菌培养上清液的牛奶液的荧光强度均高于阴性对照。
因此可以通过如下方法检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：分别将待测样品和阴性对照与脱氧核酶探针溶液混合，反应，分别得到反应产物；根据反应产物的荧光强度判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌，
若反应产物的荧光强度高于阴性对照的荧光强度，则待测样品中含有或候选含有金黄色葡萄球菌；
若反应产物的荧光强度等于或小于阴性对照的荧光强度，则待测样品中不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌。

Claims (10)

1.一种用于检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针，其结构如下：ACTCTTCCTAGCFRQGGTTCGATCAAGACACGGATCCTGACAAGGGCCAAGTTAGAATTCTAGCGTAGGGAGAGTCTCCGCCTGCAGCTCCGTCCG，其中，F是由荧光基团修饰的T碱基；Q是由淬灭基团修饰的T碱基；R代表单个插入的RNA碱基A。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于；
所述荧光基团为Fluorescein，Pyrene，Acridine，Diethylaminocoumarin，Bodipy493/503，ATTO 488，Alexa fluor 488，Alexa fluor 532，Alexa fluor 546，Alexa fluor647，Alexa fluor 750，7-Amino-4-methylcoumarin，Biotin，Aminolinker C12，Aminolinker C7，CY-3，CY-5，CY5.5，CY-7，digoxigenin，FAM，6-FAM，FITC，HEX，JOE，Phosphate，Rhodamine Green，Rhodamine Red，Rhodamine B，X-rhodamine，Tetramethylrhodamine，NBD，TET，Texas Red，Texas Red-X，Thiol，Thiol-C6 S-S，Thiol-C3，Thiol-C3 S-S，Biotin TEG，Naphthofluorescein，DyLight 680，DyLight 752或DyLight 770；所述荧光基团具体为Fluorescein；
和/或，所述淬灭基团为DABCYL，TAMRA，Eclipse，BHQ1，BHQ2或BHQ3；所述淬灭基团具体为DABCYL。
3.一种用于检测金黄色葡萄球菌的脱氧核酶探针溶液，是将权利要求1所述的探针与缓冲液混匀得到的溶液。
4.根据权利要求3所述的脱氧核酶探针溶液，其特征在于：所述探针在所述脱氧核酶探针溶液中的浓度为0.01-5uM。
5.一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括权利要求1或2所述的脱氧核酶探针或权利要求3或4所述的脱氧核酶探针溶液。
6.权利要求1或2所述的脱氧核酶探针或权利要求3或4所述的脱氧核酶探针溶液或权利要求5所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌中的应用。
7.权利要求1或2所述的脱氧核酶探针或权利要求3或4所述的脱氧核酶探针溶液或权利要求5所述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的产品中的应用。
8.一种检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：将待测样品与权利要求3或4所述的脱氧核酶探针溶液混合，反应，得到反应产物；将所述反应产物中的寡核苷酸沉淀，得到寡核苷酸沉淀，检测所述寡核苷酸沉淀，根据所述寡核苷酸沉淀判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌；
若所述寡核苷酸沉淀中含有大小为96bp和81bp的条带，则所述待测样品中含有或候选含有金黄色葡萄球菌；
若所述寡核苷酸沉淀中不含有大小为96bp和81bp的条带，则所述待测样品中不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌。
9.一种检测待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：分别将待测样品和阴性对照与权利要求3或4所述的脱氧核酶探针溶液混合，反应，分别得到反应产物；根据所述反应产物的荧光强度判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌，
若所述反应产物的荧光强度高于阴性对照的荧光强度，则所述待测样品中含有或候选含有金黄色葡萄球菌；
若所述反应产物的荧光强度等于或小于阴性对照的荧光强度，则所述待测样品中不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：检测所述反应产物的荧光强度的方法为在酶标仪上检测所述反应产物的荧光强度。
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