CN105671191A - 一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂 - Google Patents

一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种核酸检测技术，具体而言是一种依赖核酸内切酶活性的核酸检测技术和试剂。本发明所使用的分子探针在没有和目的核酸片段结合时，保持一种二级结构，此时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点。而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够和目的片段结合改变其二级结构，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。内切酶切开探针后可被检测。该方法具有识别序列较短，对引物位置要求较低，检测体系简单，检测效率较高，DNA和RNA均能直接检测等特点。

Description

一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂
技术领域
本发明涉及一种核酸检测技术，具体而言是一种依赖核酸内切酶活性的核酸检测技术和试剂。
背景知识
核酸等温检测技术是核酸体外检测技术的一种，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加等温扩增DNA聚合酶和各自特异性引物以及其他辅助酶类或报告基团来达到快速核酸扩增的目的。由于等温扩增的产物结构复杂，一般不适合用于分子克隆，主要用于核酸体外诊断。核酸等温扩增技术由于不需要使用PCR仪等专用设备，因此适合在基层医院和简易实验室中推广使用，因此近几年发展迅速。常见的等温扩增技术主要包括：环介导核酸等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)、滚环扩增技术(RollingCircleAmplification，RCA)、单引物等温扩增技术(SinglePrimerIsothermalAmplification，SPIA)、依赖解旋酶恒温扩增技术(Helicase-dependentIsothermalDNAAmplification，HDA)、依赖核酸序列的扩增(NucleicAcidSequenceBasedAmplification，NASBA)、链替代扩增(StrandDisplacementAmplification，SDA)、快速等温检测放大技术(RapidIsothermalDetectionandAmplification，RIDA)、交叉引物等温扩增(Crossprimingamplification，CPA)等。
上述方法可以分为三大类，第一类以RCA为代表的多步反应等温扩增检测方法，包括RCA、SPIA等。该类方法的特点是在反应过程中先通过一步反应合成检测中间体，而后对其进行等温扩增，实现核酸检测。以RCA为例，该技术是于1998年模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，发展起来的一种放大信号和靶核酸相结合的检测方法。先根据引物特异性，合成DNA环，作为等温扩增中间体，而后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条引物与环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温线性扩增。依据扩增过程中加入的引物不同可分为线性扩增、指数扩增、多引物扩增和信号扩增等。该类检测方法的缺点在于，需要多步反应才能得到检测结果，检测方法繁琐，费用较高，也较为费时，检测灵敏度也较低。
第二类，以LAMP为代表的多引物依赖于链置换酶活性的等温扩增检测技术，该类技术主要包括LAMP、CPA等。上述技术的核心是通过巧妙的引物设计，不需要使用连接酶等辅助酶直接通过扩增产生等温扩增中间体。进而依靠引物组扩增中间体上的特定片段，通过检测扩增产物实现核酸检测。以LAMP为例，该方法针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用BstDNA聚合酶在等温条件下扩增出双发卡状中间体，进而进入循环实现链增长，最终的产物为不同级数的扩增产物的混合物。反应产物可通过电泳或者根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断。此类方法具有快速、高灵敏度的特点但是由于气溶胶污染的原因，该类方法的假阳性结果较多，另外在进行引物设计时，要求目的片段在300bp之内具有150bp左右的保守序列，引物设计繁琐，而且在高突变率的RNA病毒基因组中，这样的序列是很难找到的，粗放的引物设计容易导致假阴性，这极大地限制了该方法的应用。
第三类，以RIDA为代表的不进行扩增的核酸检测技术。该类方法不依靠核酸扩增产生检测信号，而通过分子灯标的方法进行检测。以RIDA为例，该方法通过核酸切刻酶的活性，将和检测目的序列结合的分子灯标切开，产生荧光信号进行检测。该类方法由于核酸切刻酶种类有限，因此对目的序列限制较大。而且只能切刻DNA双链，不能直接检测RNA，因而并没有得到广泛的应用。
总之，核酸等温扩增技术在检验医学中体现出的最大的优势在于操作简单，检测时间较短，不需要依赖大型设备等几个方面。而目前的等温检测方法依然存在着一些缺欠，第一类技术方法由于需要在体系中加入连接酶、解旋酶等物质，需要多步反应完成，无法体现出操作简便的优势。第二类方法则对目的片段的保守性要求过高，引物设计复杂，容易引起气溶胶污染，其应用也受到了一定的限制。第三类方法还处于发展初期，RIDA方法需要切刻酶参与对检测目的序列提出了更高的要求，也没有得到广泛的应用。
综上所述，建立一种具有识别序列较短(类似于PCR反应识别2段特异性序列)，对引物位置要求较低，检测体系简单(一步完成)，检测效率较高，检测目的核酸通用性强(DNA和RNA均能直接检测)等特点的核酸等温检测技术，不仅对有效的丰富核酸等温扩增技术具有推动作用，更具有重要的应用价值和临床意义。
发明内容
本发明的目的：
本发明旨在建立一种依赖于内切酶活性的核酸检测技术，该技术具有识别序列较短(类似于PCR反应识别2段特异性序列)，对引物位置要求较低，检测体系简单(一步完成)，检测效率较高，检测目的核酸通用性强(DNA和RNA均能直接检测)等特点。
本发明的技术原理：
DNA单链分子在水溶液中会根据其一级结构，折叠成特定的二级结构。决定二级结构形态的因素在于DNA分子内、DNA分子间或者DNA和RNA分子间能够形成碱基互补配对。因此当一种特定的DNA分子在溶液中时，它会保持一种二级结构；而当另一种能够和该DNA分子形成碱基互补配对双键的核酸分子加入到该溶液中时，能够改变第一种DNA分子的二级结构。
本发明即是通过DNA分子的该特点设计的。本研究进行核酸检测使用的是DNA分子探针，该探针DNA分子在没有和目的核酸片段结合时，保持一种二级结构(如图1所示)，此时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点。而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够和目的片段结合改变其二级结构，此时形成了具有三段双链结构的“丫”字型的核酸分子(如图2所示)，其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的。在这条分子内折叠形成的双链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
当溶液中存在该内切酶时，探针DNA分子能够被内切酶切开。由于热力学的作用，新的未被切开的探针DNA分子将替代被切开的分子和目的片段结合。该循环周而往复，溶液中的探针DNA分子不断被切开，切开的探针分子和未被切开的探针分子能够通过琼脂糖凝胶电泳进行区别分析，实现目的核酸片段的等温检测。当在探针DNA分子上进行荧光标记后，还能够通过荧光检测装置检测出被切开的DNA分子，实现目的核酸片段的荧光等温检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
1.探针DNA分子的设计
本研究使用的探针DNA分子，需要至少具备以下功能，探针DNA分子在没有和目的核酸片段结合时，保持一种二级结构，此时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点。而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够和目的片段结合改变其二级结构，此时形成了具有三段双链结构的“丫”字型的核酸分子，其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的，这条探针DNA分子自己折叠形成的双链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
而实现上述功能则可以通过以下设计实现，如将探针分为4个区域，从5’-3’端分别为区域I至区域IV。
区域I为和检测目的片段中某些序列的反义互补片段，能够和检测目的片段形成双链。
区域II中包含能够与区域III反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开的酶切位点，同时区域II中还含有能够和区域IV的部分序列反义互补形成双链的片段。
区域III中包含有能够与区域II反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开的酶切位点。
区域IV为和检测目的片段中某些序列的反义互补片段(不和区域I所针对的检测目的片段中某些序列的反义互补片段重合)，也能够和检测目的片段形成双链。另外该区域中还包含有部分能够和区域II中的部分序列形成反义互补形成双链的片段。
本发明中某一符合上述要求的探针DNA分子的序列和其中的不同区域如图1和图3所示。
还可以使用其他探针，并不需要完全仿照区域I-区域IV的功能设计，只需要能够在目的片段不存在时维持一种二级结构，而当目的片段存在时和目的片段结合的DNA分子能够产生由区域II和区域III所形成的能够被核酸内切酶识别并切开的分子内DNA双链即可实现等温检测。
2.运用探针DNA分子检测目的核酸
具体步骤如下：
(1)合成探针DNA分子，使用双蒸水将其稀释至1μmol/L备用。
(2)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分子双链的核酸内切酶以及该酶的配套缓冲液备用。
(3)向一个PCR管中加入检测试剂包括该酶的配套缓冲液，1μL酶液，以及1μL探针DNA溶液。
(4)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液1μL。
(5)根据缓冲液说明书补足双蒸水，形成检测混合物。
(6)根据所使用的核酸内切酶的最适反应温度(一般选用最适反应温度在50℃至60℃的内切酶)，在该温度下使用恒温装置(PCR仪、水浴锅、金属浴等)孵育该检测混合物1小时。
(7)孵育结束后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
(8)将含有检测产物的琼脂糖凝胶放到紫外线下观察，分辨探针被切开的情况，如果出现探针被切开时所显示的特征性条带则证明待检测核酸样品中存在着检测目的片段，反之则证明待检测核酸样品中不存在检测目的片段。(某一探针和检测样品的检测结果如图3所示)
3.运用荧光探针DNA分子检测目的核酸
(1)合成探针DNA分子，分别在该探针DNA分子的两端标记荧光基团和该荧光基团对应的淬灭基团。使用双蒸水将其稀释至1μmol/L备用。
(2)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分子双链的核酸内切酶以及该酶的配套缓冲液备用。
(3)向一个PCR管中加入检测试剂包括该酶的配套缓冲液，1μL酶液，以及1μL荧光探针DNA溶液。
(4)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液1μL和荧光底物。
(5)根据缓冲液说明书补足双蒸水，形成检测混合物。
(6)使用一管仅含1μL内切酶液，内切酶配套缓冲液，1μL探针DNA溶液，荧光底物和双蒸水的PCR管作为阴性对照，同时进行检测。
(7)根据所使用的核酸内切酶的最适反应温度(一般选用最适反应温度在50℃至60℃的内切酶)，在该温度下使用荧光PCR仪孵育该检测混合物20分钟。每30秒检测一次荧光强度。
(8)记录从第5分钟和20分钟结束时的荧光值，根据以下公式计算荧光增量：
ΔFr＝(Fn20-Fn5)/(F020-F05)
公式中ΔFr表示荧光增量比值，用以判断检测结果。
Fn20表示待测物在20分钟时的荧光值；
Fn5表示待测物在5分钟时的荧光值
F020表示阴性对照在20分钟时的荧光值
F05表示阴性对照在5分钟时的荧光值
当ΔFr值大于1.6时确认样本为阳性，即待测样本中含有能够和探针结合的目的片段，当ΔFr值小于1.5时确认样本为阴性，即待测样本中不含有能够和探针结合的目的片段，当ΔFr值介于1.5至1.6之间时，检测结果不确定，即不能确定待测样本中是否含有能够和探针结合的目的片段。
附图说明
图1本发明所使用的探针DNA分子未与目的片段结合时的模式图
图中所示此时探针DNA分子折叠成某一特殊二级结构，该结构上没有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。蓝色框中的碱基为某一核酸内切酶切点。
图2本发明所使用的探针DNA分子与目的片段结合时的模式图
图中所示此时探针DNA分子与目的片段结合，改变其二级结构，此时形成了具有三段双链结构的“丫”字型的核酸分子，其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的，在这条探针DNA分子自己折叠形成的分子双链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点，该位点在蓝色框图内显示。
图3本发明所使用的检测方法使用琼脂糖凝胶电泳检测探针酶切后的电泳图谱
M泳道为分子量标准，1号泳道为未结合目的核酸片段的探针DNA分子形成的条带，2号泳道为竞争性片段，3号泳道为结合了模板后的探针DNA分子形成的条带，4号泳道为酶切后探针与目的片段DNA分子结合的条带此时模板为DNA分子，5号泳道为酶切后探针与目的片段DNA分子结合的条带此时模板为RNA分子，6号泳道为酶切后探针与目的片段DNA分子结合的条带此时模板为RNA分子，7号泳道为体系中仅含内切酶而无检测目的片段的探针在该内切酶存在时酶切1小时后的条带，8号泳道为体系中仅含内切酶而无检测目的片段的探针在该内切酶存在时酶切1小时后的条带，9号泳道为体系中仅含内切酶而无检测目的片段的探针在该内切酶存在时酶切1小时后的条带。
图4本发明所使用的另一种探针DNA分子未与目的片段结合时的模式图
图中所示此时探针DNA分子折叠成多个小茎环的二级结构，该结构上没有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
具体实施方式
实施例1
设计探针DNA分子1(以后简称为P1)
P1的核苷酸序列为5’-GAGCTTGGTGGCTGGCGCATCCGGATCTTTTTTTCCGGATCCGAGTGCGAATAGTCCG-3’。其不同的二级结构如图1和图2所示。
该探针DNA分子的区域I的序列为5’-GAGCTTGGTGGCTGG，该区域为和检测目的片段中某些序列的反义互补片段，能够和检测目的片段形成双链。
该探针分子的区域II序列为CGCATCCGGATCTTT，该区域的序列中包含能够与区域III反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开的酶切位点，同时区域II中还含有能够和区域IV的部分序列反义互补形成双链的片段。
该探针分子的区域III序列为TTTTCCGGATCCG，该区域的序列中包含有能够与区域II反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开的酶切位点。
该探针分子的区域IV序列为AGTGCGAATAGTCCG，该区域的序列中包含和检测目的片段中某些序列的反义互补片段(不和区域所针对的检测目的片段中某些序列的反义互补片段重合)，也能够和检测目的片段形成双链。另外该区域中还包含有部分能够和区域II中的部分序列形成反义互补形成双链的片段。
检验此探针的待测序列DNA中包含以下序列5’-CGGACTATTCGCACTCCAGCCACCAAGCTC-3’能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链。检验此探针的待测序列RNA分子序列为5’-GAUCGCGGACUAUUCGCACUCCAGCCACCAAGCUCAUCGU-3’能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链。
2.运用探针DNA分子检测目的核酸
具体步骤如下：
(1)合成探针DNA分子P1，使用双蒸水将其稀释至1μmol/L备用。
(2)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分子双链的核酸内切酶AccIII以及该酶的配套缓冲液备用。
(3)向一个PCR管中加入2倍AccIII酶切缓冲液10μL，加入AccIII酶液1μL，1μLP1探针溶液。
(4)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液1μL，根据缓冲液说明书补足双蒸水至20μL，形成检测混合物。
(5)制备阴性参照管，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而直接补足双蒸水至20μL，作为阴性参照管。
(6)制备阳性参照管I，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的DNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管I。
(7)制备阳性参照管II，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的RNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管II。
(8)在AccIII最适反应温度60℃下使用PCR仪孵育该检测混合物1小时。
(9)孵育结束后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
(10)将含有检测产物的琼脂糖凝胶放到紫外线下观察，分辨探针被切开的情况，发现含有待检测核酸样品的PCR管、阳性参照管I和阳性参照管II中出现探针被切开时所显示的特征性条带，得到阳性结果。而阴性对照管中未出现探针被切开时所显示的特征性条带，得到阴性结果。
3.运用荧光探针DNA分子检测目的核酸
(1)合成探针P1，分别在该P1两端标记荧光基团FAM和FAM荧光基团对应的淬灭基团。使用双蒸水将其稀释至1μmol/L备用。
(2)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分子双链的核酸内切酶AccIII以及该酶的配套缓冲液备用。
(3)向一个PCR管中加入2倍AccIII酶切缓冲液10μL，加入AccIII酶液1μL，1μLP1探针溶液和荧光PCR检测荧光底物ROX溶液1μL。
(4)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液1μL，根据缓冲液说明书补足双蒸水至20μL，形成检测混合物。
(5)制备阴性参照管，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而直接补足双蒸水至20μL，作为阴性参照管。
(6)制备阳性参照管I，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的DNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管I。
(7)制备阳性参照管II，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的RNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管II。
(8)在AccIII最适反应温度60℃下使用荧光PCR仪孵育该检测混合物20分钟。每30秒检测一次荧光强度。
(8)记录从第5分钟和20分钟结束时的荧光值，根据以下公式计算荧光增量：
ΔFr＝(Fn20-Fn5)/(F020-F05)；
公式中ΔFr表示荧光增量比值，用以判断检测结果；
Fn20表示待测物在20分钟时的荧光值；
Fn5表示待测物在5分钟时的荧光值；
F020表示阴性对照在20分钟时的荧光值；
F05表示阴性对照在5分钟时的荧光值。
阳性参照管I的ΔFr值＝1.75，阳性参照管II的ΔFr值＝1.77，阴性参照管的ΔFr值＝1.21，均符合本发明得到的规律。待测样本的ΔFr值＝1.72，确认样本为阳性，即待测样本中含有能够和探针结合的目的片段。
实施例2
设计探针DNA分子2(以后简称为P2)
P2的核苷酸序列为5’-GTCGTAACAAGGTACGATCCGGAGGGTTTTCCCTCCGGACCTGCCGTATCGGAAGGT-3’。
该探针DNA分子能够与目标序列形成反义互补的片段为区域I5’-GTCGTAACAAGGTA-3’和区域IV5’-GCCGTATCGGAAGGT-3’。与探针1不同的是该探针在没有目的片段存在的情况下和P1的折叠情况不同，而是形成了多个小茎环结构见图4所示。
在有核酸目的片段存在时，依然能够形成“丫”字型结构，提供Aor13HI的酶切位点。
检验此探针的待测序列DNA中包含以下序列5’-CAGCATTGTTCCATCGGCATAGCCTTCCA-3’能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链。检验此探针的待测序列RNA分子序列为5’-GAUCGCAGCAUUGUUCCAUCGGCAUAGCCUUCCAAUCGU-3’能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链。
2.运用探针DNA分子检测目的核酸
具体步骤如下：
(1)合成探针DNA分子P2，使用双蒸水将其稀释至1μmol/L备用。
(2)取核酸内切酶Aor13HI以及该酶的配套缓冲液备用。
(3)向一个PCR管中加入2倍Aor13HI酶切缓冲液10μL，加入Aor13HI酶液1μL，1μLP1探针溶液。
(4)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液1μL，根据缓冲液说明书补足双蒸水至20μL，形成检测混合物。
(5)制备阴性参照管，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而直接补足双蒸水至20μL，作为阴性参照管。
(6)制备阳性参照管I，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的DNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管I。
(7)制备阳性参照管II，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的RNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管II。
(8)在Aor13HI低于最适反应温度的50℃下使用PCR仪孵育该检测混合物1小时。
(9)孵育结束后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
(10)将含有检测产物的琼脂糖凝胶放到紫外线下观察，分辨探针被切开的情况，发现含有待检测核酸样品的PCR管、阳性参照管I和阳性参照管II中出现探针被切开时所显示的特征性条带，得到阳性结果。而阴性对照管中未出现探针被切开时所显示的特征性条带，得到阴性结果。
3.运用荧光探针DNA分子检测目的核酸
(1)合成探针P2，分别在该P2两端标记荧光基团HEX和HEX荧光基团对应的淬灭基团。使用双蒸水将其稀释至1μmol/L备用。
(2)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分子双链的核酸内切酶Aor13HI以及该酶的配套缓冲液备用。
(3)向一个PCR管中加入2倍Aor13HI酶切缓冲液10μL，加入Aor13HI酶液1μL，1μLP1探针溶液和荧光PCR检测荧光底物ROX溶液1μL。
(4)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液1μL，根据缓冲液说明书补足双蒸水至20μL，形成检测混合物。
(5)制备阴性参照管，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而直接补足双蒸水至20μL，作为阴性参照管。
(6)制备阳性参照管I，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的DNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管I。
(7)制备阳性参照管II，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的RNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管II。
(8)55℃下使用荧光PCR仪孵育该检测混合物20分钟。每30秒检测一次荧光强度。
(8)记录从第5分钟和20分钟结束时的荧光值，根据以下公式计算荧光增量：
ΔFr＝(Fn20-Fn5)/(F020-F05)；
公式中ΔFr表示荧光增量比值，用以判断检测结果；
Fn20表示待测物在20分钟时的荧光值；
Fn5表示待测物在5分钟时的荧光值；
F020表示阴性对照在20分钟时的荧光值；
F05表示阴性对照在5分钟时的荧光值。
阳性参照管I的ΔFr值＝1.77，阳性参照管II的ΔFr值＝1.70，阴性参照管的ΔFr值＝1.20，均符合本发明得到的规律。待测样本的ΔFr值＝1.68，确认样本为阳性，即待测样本中含有能够和探针结合的目的片段。
实施例3
使用P2作为探针
检验此探针的待测序列DNA中包含以下序列5’-CAGCATTGTTCCATTTCGACTGCATCCGGCATAGCCTTCCA-3’能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链，而且在能够和DNA分子区域I互补形成双链的序列CAGCATTGTTCCAT和能够和DNA分子区域IV互补形成双链的序列CGGCATAGCCTTCCA之间插入了一个无意义的序列TTCGACTGCATC，如果该待测序列能够和探针结合形成杂交分子则中间体结构不再是“丫”型，而接近于“古”型，这样做的目的是确定这种检测方法是否能够检测探针识别序列的反义互补序列在目标序列的一级结构上不连续的目标序列。检验此探针的待测序列RNA分子序列为5’-GAUCAGCAUUGUUCCAUUUCGACUGCAUCCGGCAUAGCCUUCCAGUGGCA-3’能够和探针DNA分子区域I和区域IV互补形成双链结构类似于上面提及的待测序列DNA分子所形成的结构。
2.运用探针DNA分子检测目的核酸
具体步骤如下：
(1)合成探针DNA分子P2，使用双蒸水将其稀释至1μmol/L备用。
(2)取核酸内切酶Aor13HI以及该酶的配套缓冲液备用。
(3)向一个PCR管中加入2倍Aor13HI酶切缓冲液10μL，加入Aor13HI酶液1μL，1μLP1探针溶液。
(4)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液1μL，根据缓冲液说明书补足双蒸水至20μL，形成检测混合物。
(5)制备阴性参照管，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而直接补足双蒸水至20μL，作为阴性参照管。
(6)制备阳性参照管I，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的DNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管I。
(7)制备阳性参照管II，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的RNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管II。
(8)在Aor13HI低于最适反应温度的50℃下使用PCR仪孵育该检测混合物1小时。
(9)孵育结束后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
(10)将含有检测产物的琼脂糖凝胶放到紫外线下观察，分辨探针被切开的情况，发现含有待检测核酸样品的PCR管、阳性参照管I和阳性参照管II中出现探针被切开时所显示的特征性条带，得到阳性结果。而阴性对照管中未出现探针被切开时所显示的特征性条带，得到阴性结果。
3.运用荧光探针DNA分子检测目的核酸
(1)合成探针P2，分别在该P2两端标记荧光基团HEX和HEX荧光基团对应的淬灭基团。使用双蒸水将其稀释至1μmol/L备用。
(2)取能够识别且切开探针DNA分子区域II和探针DNA分子区域III所形成的DNA分子双链的核酸内切酶Aor13HI以及该酶的配套缓冲液备用。
(3)向一个PCR管中加入2倍Aor13HI酶切缓冲液10μL，加入Aor13HI酶液1μL，1μLP1探针溶液和荧光PCR检测荧光底物ROX溶液1μL。
(4)向该PCR管中加入待检测的核酸溶液1μL，根据缓冲液说明书补足双蒸水至20μL，形成检测混合物。
(5)制备阴性参照管，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而直接补足双蒸水至20μL，作为阴性参照管。
(6)制备阳性参照管I，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的DNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管I。
(7)制备阳性参照管II，取步骤(3)的混合液不加入待检测的核酸溶液，而加入确知含有待测目的片段的RNA分子，而后补足双蒸水至20μL，作为阳性参照管II。
(8)55℃下使用荧光PCR仪孵育该检测混合物20分钟。每30秒检测一次荧光强度。
(8)记录从第5分钟和20分钟结束时的荧光值，根据以下公式计算荧光增量：
ΔFr＝(Fn20-Fn5)/(F020-F05)；
公式中ΔFr表示荧光增量比值，用以判断检测结果；
Fn20表示待测物在20分钟时的荧光值；
Fn5表示待测物在5分钟时的荧光值；
F020表示阴性对照在20分钟时的荧光值；
F05表示阴性对照在5分钟时的荧光值。
阳性参照管I的ΔFr值＝1.76，阳性参照管II的ΔFr值＝1.72，阴性参照管的ΔFr值＝1.18，均符合本发明得到的规律。待测样本的ΔFr值＝1.70，确认样本为阳性，即待测样本中含有能够和探针结合的目的片段。

Claims (10)

1.一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂，其特征在于，这种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术使用一种特殊的探针DNA分子，该探针DNA分子在没有和目的核酸片段结合时，在溶液中保持一种二级结构，此时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点；而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够识别目的片段上的特异性序列并和其互补配对形成双链结构，从而改变探针DNA分子的二级结构，此时形成了至少具有三段双链结构的的核酸分子；且其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的，这条探针DNA分子自己折叠形成的双链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点，形成检测中间体。
2.根据权利要求1所述的一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂，其特征在于，使用能够识别检测中间体上由探针DNA分子自己折叠形成的双链上的识别位点的内切酶，在该双链上的酶切位点位置切开探针DNA分子。
3.根据权利要求1所述的一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂，其特征在于，被核酸内切酶切开的探针DNA分子能够在适合的温度下，即50℃至60℃之间，从待测的核酸片段上解离下来，而待测片段重新和另一个探针DNA分子结合，开始一个新的结合-重构-酶切-解离的过程；解离下来的探针DNA分子能够通过其他方法检测，作为目的核酸存在的依据。
4.根据权利要求1所述的一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂，其特征在于，该技术即可以用于检测DNA分子也可以用于检测RNA分子，即和探针DNA分子结合的目的核酸片段即可以是DNA分子也可以是RNA分子。
5.一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测试剂，其特征在于，检测试剂的组成中至少包括以下成分：探针DNA分子，反应终浓度为0.05μmol/L，该分子形成的检测中间体上有能够被某一核酸内切酶识别的识别位点和能够被该酶切开DNA分子的酶切位点；核酸内切酶，含量为2U至10U，该核酸内切酶能够识别同一反应物中的探针DNA分子形成DNA双链，且能够切开该DNA双链；能够保证该核酸内切酶活性的缓冲液成分；待检测核酸样本，待检测核酸样本即可以是DNA也可以是RNA。
6.根据权利要求5所述的一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测试剂，其特征在于，检测的方法为将检测混合物在50℃至60℃下使用恒温装置孵育该检测混合物1小时，反应温度需要参考该检测混合物中核酸内切酶的最适反应温度；孵育结束后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物；将含有检测产物的琼脂糖凝胶放到紫外线下观察，分辨探针被切开的情况，如果出现探针被切开时所显示的特征性条带则证明待检测核酸样品中存在着检测目的片段，反之则证明待检测核酸样品中不存在检测目的片段。
7.一种依赖核酸内切酶活性的核酸荧光等温检测试剂，其特征在于，该试剂使用荧光探针，该荧光探针分子在没有和目的核酸片段结合时，在溶液中保持一种二级结构，此时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点；而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够识别目的片段上的特异性序列和其互补配对形成双链结构从而改变探针DNA分子的二级结构，此时形成了至少具有三段双链结构的的核酸分子，且其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的，这条探针DNA分子自己折叠形成的双链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点，形成检测中间体；而且在该荧光探针的两端分别标记有荧光基团和能够淬灭该荧光基团所发荧光的淬灭基团。
8.一种依赖核酸内切酶活性的核酸荧光等温检测试剂，其特征在于，检测试剂的组成中至少包括以下成分：荧光探针DNA分子，反应终浓度为0.05μmol/L，该分子形成的检测中间体上有能够被某一核酸内切酶识别的识别位点和能够被该酶切开DNA分子的酶切位点；核酸内切酶，含量为2U至10U，该核酸内切酶能够识别同一反应物中的探针DNA分子形成DNA双链，且能够切开该DNA双链；能够保证该核酸内切酶活性的缓冲液成分；待检测核酸样本，待检测核酸样本即可以是DNA也可以是RNA。
9.一种依赖核酸内切酶活性的核酸荧光等温检测试剂，其特征在于，使用一管除不含待测核酸样本外其余成分完全相同的检测试剂作为阴性对照同时进行检测，检测方法为将检测混合物在50℃至60℃下使用荧光PCR仪孵育20分钟，反应温度需要参考该检测混合物中核酸内切酶的最适反应温度，每30秒检测一次荧光强度。
10.一种依赖核酸内切酶活性的核酸荧光等温检测试剂，其特征在于，荧光检测结果需进行以下分析，分别记录各检测管和阴性对照管第5分钟和第20分钟结束时的荧光值，根据以下公式计算荧光增量：
ΔFr＝(Fn20-Fn5)/(F020-F05)；
公式中ΔFr表示荧光增量比值，用以判断检测结果；
Fn20表示待测物在20分钟时的荧光值；
Fn5表示待测物在5分钟时的荧光值；
F020表示阴性对照在20分钟时的荧光值；
F05表示阴性对照在5分钟时的荧光值；
当ΔFr值大于1.6时确认样本为阳性，即待测样本中含有能够和探针结合的目的片段，当ΔFr值小于1.5时确认样本为阴性，即待测样本中不含有能够和探针结合的目的片段，当ΔFr值介于1.5至1.6之间时，检测结果不确定，即不能确定待测样本中是否含有能够和探针结合的目的片段。
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