CN108642165A - 一种用于实时荧光pcr的探针及其使用方法 - Google Patents

一种用于实时荧光pcr的探针及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于实时荧光PCR的探针及其使用方法,其探针包括正链前探针和正链后探针，所述正链前探针包括与寡聚核苷酸负链序列互补的寡聚核苷酸正链序列及3’端连接有荧光基团，所述正链后探针包括与寡聚核苷酸负链序列互补的寡聚核苷酸正链序列及5’端连接有猝灭基团，其使用方法包括以下步骤，提取样品的基因组DNA，将探针、特异性上游引物和下游引物按一定比例混合为混合引物，配制PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增，根据实时检测的扩展曲线及荧光信号强度进行结果分析。本发明能够减少非特异性扩增，提高检测灵敏度，与TaqMan等荧光探针相比，降低了成本，且检测稳定性好，检测结果易于分析。

Description

一种用于实时荧光PCR的探针及其使用方法
技术领域
本发明涉及PCR探针技术领域，尤其涉及一种用于实时荧光PCR的探针及其使用方法。
背景技术
在现有技术中，荧光探针主要为水解探针和分子信标，其荧光信号的检测主要通过实时荧光PCR仪进行。
其中，Taqman探针：如图1，5’端标记了一个荧光基团、3’端标记了一个猝灭基团，在探针完整时，系统激发供体而产生的荧光信号被临近的猝灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号。而当PCR过程中Taq DNA聚合酶延伸到探针结合模版的位点时，其5’—3’核酸外切酶的活性切割掉探针5’端的荧光基团，使得游离荧光基团远离猝灭基团，打破能量的传递，荧光基团激发产生荧光信号，此时即可被荧光系统检测到，检测的信号是积累的荧光信号。
分子信标，如图2，是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，荧光基团与标记在另一端的猝灭基团紧紧靠近，在复性温度下，模板不存在时，形成茎环结构，当加热变性会使互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列，分子信标将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与猝灭基团分开猝灭作用被解除产生荧光。
然而在传统的水解探针和分子信标技术中，由于探针的种类和数量较多，常常出现非特异性扩增，影响检测结果。本发明在传统的探针结构上进行改进，将双标荧光探针转变为两条单标荧光或猝灭基团探针，可减少非特异性扩增，提高检测灵敏度。。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种用于实时荧光PCR的探针及其使用方法，可有效减少非特异性扩增，避免假阳性。
本发明提出的一种用于实时荧光PCR的探针，包括正链前探针和正链后探针，所述正链前探针包括与寡聚核苷酸负链序列互补的寡聚核苷酸正链序列及3’端连接有荧光基团，所述正链后探针包括与寡聚核苷酸负链序列互补的寡聚核苷酸正链序列及5’端连接有猝灭基团。
优选地，所述正链前后两条探针的Tm值大于或等于扩增引物的Tm值。
优选地，所述正链前探针3’端与正链后探针5’端相隔0-5个核苷酸序列。
优选地，所述正链前前探针和正链后探针序列根据B族链球菌基因组序列或其他基因组序列设计构成。
优选地，所述正链前探针序列采用如SEQ ID NO:1-6中任一项所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:1-6序列具体信息如下：
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAA-R(SEQ ID NO:1)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAA-R(SEQ ID NO:2)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGA-R(SEQ ID NO:3)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAAC-R(SEQ ID NO:4)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAACA-R(SEQ ID NO:5)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAACAG-R(SEQ ID NO:6)，其中R为荧光基团，且正链后探针序列采用如SEQ ID NO:7-12中任一项所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:7-12序列具体信息如下：
Q-CAGATACGACGTGGACAGCACGTACTG(SEQ ID NO:7)
Q-AGATACGACGTGGACAGCACGTACTG(SEQ ID NO:8)
Q-GATACGACGTGGACAGCACGTACTGT(SEQ ID NO:9)
Q-ATACGACGTGGACAGCACGTACTGT(SEQ ID NO:10)
Q-TACGACGTGGACAGCACGTACTGT(SEQ ID NO:11)
Q-ACGACGTGGACAGCACGTACTGT(SEQ ID NO:12)，其中Q为猝灭基团。
优选地，所述荧光基团包括但不限于FAM、TEL Texas Red、VIC或Cy5，所述猝灭基团包括但不限于BHQ1或BHQ2。
本发明还提出的一种用于实时荧光PCR探针的使用方法，包括以下步骤：
S1：提取样品的基因组DNA；
S2：将探针、特异性上游引物和下游引物按一定比例混合为混合引物；
S3：配制PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；
S4：根据实时检测的扩展曲线及荧光信号强度进行结果分析。
进一步地，所述特异性上下游引物为目标基因的靶点序列相互补的特异引物序列，且实时检测的扩展曲线中阴性样本为直线，阳性样本为倒“S”型曲线。
进一步地，所述上游引物、下游引物和相应的混合探针用于检测单个目标基因或设置多组混合引物探针设置以检测多个目标基因。
本发明中的有益效果为：
1、减少非特异性扩增，提高检测灵敏度；
2、与TaqMan等荧光探针相比，降低成本；
3、稳定性好；
4、结果易于分析。
附图说明
图1为现有技术Taqman探针工作原理图；
图2为现有技术分子信标工作原理图；
图3本发明提出的一种用于实时荧光PCR的探针及其使用方法的工作原理图；
图4本发明提出的一种用于实时荧光PCR的探针及其使用方法的实施例实时荧光PCR检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明较佳实施例提供一种用于实时荧光PCR的探针设计方法，如图3所示，包括正链前后两条探针，前探针包括与寡聚核苷酸负链序列互补的寡聚核苷酸正链序列及3’端连接有荧光基团；后探针包括与寡聚核苷酸负链序列互补的寡聚核苷酸正链序列及5’端连接有猝灭基团。
本发明提供一种用于实时荧光PCR的探针应用，包括以下步骤：
a、提取样品的基因组DNA；
b、将探针、特异性上游引物和下游引物按一定比例混合为混合引物；
c、配制PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；
d、根据实时检测的扩展曲线及荧光信号强度进行结果分析。
其中，所述特异性上下游引物为目标基因的靶点序列相互补的特异引物序列；所述实时检测的扩展曲线：阴性样本为直线，阳性样本为倒“S”型曲线。
本发明正链前后两条探针序列根据B族链球菌基因组序列设计而成，具体上下游特异性引物及探针的序列信息如下表所示：
名称 序列 序列号
GBS-P1 CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAA-R SEQ ID NO:1
GBS-P2 Q-AGATACGACGTGGACAGCACGTACTG SEQ ID NO:7
GBS-F 5’-ATGGCAGCTTCGCTATTATCAGT-3’ SEQ ID NO:13
GBS-R 5’-AAATCAGCCTTTACCTCTGAAACAG-3’ SEQ ID NO:14
表中，R代表荧光基团，可选用FAM,TET,Texas Red、VIC和Cy5,Q代表猝灭基团，可选BHQ1、BHQ2。
正链前后两条探针的Tm值大于或等于扩增引物的Tm值为实行实时荧光检测的必要条件，其中正链前探针的Tm值高扩增引物的Tm值3℃，后探针Tm值比扩增引物的Tm值高7℃。且正链前探针3’端与正链后探针5’端相隔1个核苷酸序列。
以检测B族链球菌基因组为例，具体实验流程如下：
(1)设计探针、特异性上游引物和下游引物；
(2)将探针(P1、P2)、上游引物(F)和下游引物(R)按一定比例配置反应体系，以扩增产物进行实时荧光PCR检测。
(3)反应体系为25μL，包括TaKaRa 10XPCR buffer(含Mg2+)2.5μL，dNTPs 1.6μL，r-Taq酶0.2μL、引物探针混合引物0.3μL、纯化水18.4μL、DNA 10ng。
(4)采用Getier 96E荧光PCR仪进行检测，其扩增流程如：95℃预变性3min；95℃变性15s，退火30s(10个循环)(不采集荧光)；95℃变性15s，退火30s(10个循环)(采集荧光)。
(5)结果分析：
如图4中所示，X轴代表扩增循环数，Y轴代表荧光信号强度。从结果可知，阴性样本为直线，阳性样本为倒“S”型曲线，结果符合预期。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于实时荧光PCR的探针，包括正链前探针和正链后探针，其特征在于，所述正链前探针包括与寡聚核苷酸负链序列互补的寡聚核苷酸正链序列及3’端连接有荧光基团，所述正链后探针包括与寡聚核苷酸负链序列互补的寡聚核苷酸正链序列及5’端连接有猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种用于实时荧光PCR的探针，其特征在于，所述正链前后两条探针的Tm值大于或等于扩增引物的Tm值。
3.根据权利要求1所述的一种用于实时荧光PCR的探针，其特征在于，所述正链前探针3’端与正链后探针5’端相隔0-5个核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种用于实时荧光PCR的探针，其特征在于，所述正链前前探针和正链后探针序列根据B族链球菌基因组序列或其他基因组序列设计构成。
5.根据权利要求1所述的一种用于实时荧光PCR的探针，其特征在于，所述正链前探针序列采用如SEQ ID NO:1-6中任一项所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:1-6序列具体信息如下：
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAA-R(SEQ ID NO:1)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAA-R(SEQ ID NO:2)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGA-R(SEQ ID NO:3)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAAC-R(SEQ ID NO:4)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAACA-R(SEQ ID NO:5)
CGCAAGTGTTCAAGCACAAGAAACAG-R(SEQ ID NO:6)，其中R为荧光基团，且正链后探针序列采用如SEQ ID NO:7-12中任一项所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:7-12序列具体信息如下：
Q-CAGATACGACGTGGACAGCACGTACTG(SEQ ID NO:7)
Q-AGATACGACGTGGACAGCACGTACTG(SEQ ID NO:8)
Q-GATACGACGTGGACAGCACGTACTGT(SEQ ID NO:9)
Q-ATACGACGTGGACAGCACGTACTGT(SEQ ID NO:10)
Q-TACGACGTGGACAGCACGTACTGT(SEQ ID NO:11)
Q-ACGACGTGGACAGCACGTACTGT(SEQ ID NO:12)，其中Q为猝灭基团。
6.根据权利要求1所述的一种用于实时荧光PCR的探针，其特征在于，所述荧光基团包括但不限于FAM、TEL Texas Red、VIC或Cy5，所述猝灭基团包括但不限于BHQ1或BHQ2。
7.一种用于实时荧光PCR探针的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取样品的基因组DNA；
S2：将探针、特异性上游引物和下游引物按一定比例混合为混合引物；
S3：配制PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；
S4：根据实时检测的扩展曲线及荧光信号强度进行结果分析。
8.根据权利要求7所述的一种用于实时荧光PCR探针的使用方法，其特征在于，所述特异性上下游引物为目标基因的靶点序列相互补的特异引物序列，且实时检测的扩展曲线中阴性样本为直线，阳性样本为倒“S”型曲线。
9.根据权利要求7所述的一种用于实时荧光PCR探针的使用方法，其特征在于，所述上游引物、下游引物和相应的混合探针用于检测单个目标基因或设置多组混合引物探针设置以检测多个目标基因。
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