CN117568500B - 一种水产品中病原菌的双重pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒，包括检测副溶血性弧菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、2×PCR PreMix和RNase‑free Water，检测副溶血性弧菌的引物对为特异性针对副溶血性弧菌的Tlh基因，检测无乳链球菌的引物对为特异性针对无乳链球菌的Sip基因。本发明的检测试剂盒利用特异性针对副溶血性弧菌Tlh基因和特异性针对无乳链球菌的Sip基因的引物，通过单管同步检测，实现可同时鉴别副溶血性弧菌和无乳链球菌两种病原菌，具有灵敏度高，特异性强、操作简便的特点，解决了单次快速有效检测两种病原菌的问题，为水产养殖业的发展起到了促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及水产品病原菌检测技术领域，更具体地，涉及一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒。
背景技术
水产品消费需求的不断增加促使水产养殖业迅猛发展，然而在集约化和高密度养殖的过程中，由致病菌感染引起的水产养殖动物死亡给整个行业带来巨大的经济损失。副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是水产品中最为常见的两类食源性致病菌，人误食副溶血性弧菌和无乳链球菌引起的食物中毒已经成为世界范围内食源性公共卫生问题之一。建立对这两种病原菌的检测方法显得尤为重要，通过科学的检测手段，水产养殖业可以更有效地适应市场需求，确保可持续发展。
目前，对水产品致病菌的诊断手段主要包括生物学方法、免疫诊断法、分子杂交法及PCR法。目前已建立的常规PCR技术是一次只能检测一种病原，而水产养殖动物经常存在致病菌混合感染的现象，给养殖中疾病的防控加大了难度，因此快速有效地单次检测多种病原尤为关键，且尽早检出多种致病菌具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒。
根据本发明的一个方面，提供了一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒，包括检测副溶血性弧菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、2×PCR PreMix和RNase-freeWater，检测副溶血性弧菌的引物对为特异性针对副溶血性弧菌的Tlh基因，检测无乳链球菌的引物对为特异性针对无乳链球菌的Sip基因。
在一些实施方式中，检测副溶血性弧菌的引物对包括检测副溶血性弧菌的上游引物和检测副溶血性弧菌的下游引物，检测副溶血性弧菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，检测副溶血性弧菌的下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
在一些实施方式中，检测无乳链球菌的引物对包括检测无乳链球菌的上游引物和无乳链球菌的下游引物，检测无乳链球菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，检测无乳链球菌的下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施方式中，试剂盒的反应体系为：模板2μL，2×PCR PreMix 10μL，检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物各0.8μL，检测无乳链球菌的上游引物和下游引物各0.4μL，RNase-free Water补足20μL。
在一些实施方式中，检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L，检测无乳链球菌的上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L。
根据本发明的另一个方面，提供了检测试剂盒在制备检测水产品中病原菌的试剂中的应用，病原菌为副溶血性弧菌和无乳链球菌。
根据本发明的再一个方面，提供了检测试剂盒的使用方法，方法为非疾病诊断目的的方法，包括以下步骤：
S1. DNA模板制备：提取待测水产样品的总DNA，以其为模板进行后续双重PCR扩增反应；
S2. 配制双城PCR扩增反应体系：取待测样本DNA模板2μL，加入2×PCR PreMix 10μL，10μM检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物各0.8μL，10μM检测无乳链球菌的上游引物和下游引物各0.4μL，最后加入RNase-free Water补足20μL；
S3. 进行双重PCR扩增反应：将上述S2中的混合液离心，进行PCR反应，反应参数为：94℃预变性30s，98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，运行35个循环，72℃充分延伸2min，最后扩增产物4℃保存；
S4. 双重PCR扩增产物检测：PCR反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的预期大小，若发现产物中DNA片段出现109bp的特异片段，说明水产样品中含有副溶血性弧菌，若出现269bp的特异片段，说明水产样品中含有无乳链球菌。
在一些实施方式中，水产样品为鱼类样品、蟹类样品、贝类样品或虾类样品中的一种或几种。
本发明的有益效果：本发明的检测试剂盒利用特异性针对副溶血性弧菌Tlh基因和特异性针对无乳链球菌的Sip基因的引物，通过单管同步检测，实现可同时鉴别副溶血性弧菌和无乳链球菌两种病原菌，具有灵敏度高，特异性强、操作简便的特点，解决了单次快速有效检测两种病原菌的问题，为水产养殖业的发展起到了促进作用。
附图说明
图1为本发明中检测副溶血性弧菌的引物对与检测无乳链球菌的引物对的体积比优化的结果图，其中M为DL500 DNA Marker，1-3分别对应为处理1-3。
图2为本发明的退火温度优化的结果图，其中M为DL500 DNA Marker，1-5分别对应为处理1-5。
图3为本发明的循环次数优化的结果图，其中M为DL500 DNA Marker，1-6分别对应为处理1-6。
图4为本发明的检测试剂盒对副溶血性弧菌和无乳链球菌的特异性检测结果图，其中M为DL500 DNA Marker，1-4分别对应为处理1-4，5为阳性对照。
图5为本发明的检测试剂盒的灵敏度测定结果图，其中M为DL500 DNA Marker，1-5分别对应为处理1-5。
图6为本发明的检测试剂盒对人工染菌样品的检测结果图，其中M为DL500 DNAMarker，1为阴性对照样品，2为阳性样品。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
实施例1 引物设计
本实施例中分别以副溶血性弧菌Tlh基因和无乳链球菌Sip基因为靶基因序列，设计两对特异性引物，即Tlh引物对和Sip引物对，包括检测副溶血性弧菌的上游引物（Thf-F）、检测副溶血性弧菌的下游引物（Thf-R）、检测无乳链球菌的上游引物（Sip-F）和检测无乳链球菌的下游引物（Sip-R），其序列见表1，PCR扩增产物的大小分别为109bp（Tlh）、269bp（Sip）。
表1 双重PCR特异性引物表
实施例2 PCR扩增反应中引物配比、退火温度和程序循环参数的优化
为了本发明的检测试剂盒能同时扩增出2条清晰的特异性条带，实现对副溶血性弧菌和无乳链球菌的准确检测，对两组引物对的配比及PCR扩增参数进行以下优化。
2.1两组引物对的配比优化
在PCR反应体系总体积20μL不变的条件下，设置三个处理，处理1：Tlh引物对与Sip引物对的体积比为1:2，处理2：Tlh引物对与Sip引物对的体积比为1:1，处理3：Tlh引物对与Sip引物对的体积比为2:1，然后对副溶血性弧菌的Tlh基因和无乳链球菌的Sip基因进行扩增，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶电泳条带的亮度筛选最适合的体积比，结果见图1。
由图1可知，处理3（Tlh引物对和Sip引物对的体积比为2:1）凝胶电泳的两条条带效果最好，即在20μL的反应体系中加入2×PCR PreMix 10μL、模板DNA 2μL、Tlh-F/R各0.8μL、Sip-F/R各0.4μL，最后用RNase-free Water补足20μL，得到的双重PCR两个特异性条带亮度最佳且清晰。因此，将Tlh引物对和Sip引物对的体积比为2:1的最佳配比用于后续实验。
2.2 退火温度优化
为确定双重PCR检测体系的最佳退火温度，在53-61℃之间设定五个退火温度梯度为五个处理，即处理1：53℃，处理2:55℃，处理3:57℃，处理4：59℃，处理5：61℃，根据凝胶电泳条带的亮度筛选出适合本反应体系的最佳退火温度，结果见图2。
由图2可知，处理3即退火温度为57℃时，在109bp处及269bp处均出现亮度较高的特异性目的条带，因此，本发明的双重PCR检测体系最终选择57℃作为退火温度。
2.3 循环次数优化
将扩增程序中的循环次数分别设置为六个处理，即处理1：27次，处理2：29次，处理3：31次，处理4：33次，处理5：35次，处理6：37次，通过凝胶电泳条带亮度筛选出双重PCR检测程序的最佳循环次数，结果见图3。
有图3可知，当循环次数为35次时（处理5），扩增后在109bp处和269bp处出现的条带均最亮，因此，本发明中双重PCR检测体系最终选定的循环次数为35次。
实施例3 一种水产品病原菌的双重PCR检测试剂盒，其反应体系为：检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物，检测无乳链球菌的上游引物和下游引物，2×PCR PreMix和RNase-free Water。
实施例4 对水产品中病原菌的检测方法
使用实施例3中的一种水产品病原菌的双重PCR检测试剂盒，对待测水产品样品进行检测，具体方法包括以下步骤：
S1. DNA模板制备：提取待测水产样品的总DNA，以其为模板进行后续双重PCR扩增反应；
S2. 配制双重PCR扩增反应体系：取待测样本DNA模板2μL，加入2×PCR PreMix 10μL，10μM检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物各0.8μL，10μM检测无乳链球菌的上游引物和下游引物各0.4μL，最后加入RNase-free Water补足20μL；
S3. 进行双重PCR扩增反应：将上述S2中的混合液离心，进行PCR反应，反应参数为：94℃预变性30s，98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，运行35个循环，72℃充分延伸2min，最后扩增产物4℃保存；
S4. 双重PCR扩增产物检测：PCR反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的预期大小，若发现产物中DNA片段出现109bp的特异片段，说明水产样品中含有副溶血性弧菌，若出现269bp的特异片段，说明水产样品中含有无乳链球菌。
实施例5 本发明的检测方法的特异性、灵敏度评价试验
5.1 特异性评价
以副溶血性弧菌、无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为特异性检测对象，分别提取副溶血性弧菌、无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA，设定四个处理，即处理1：副溶血性弧菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的DNA混合液；处理2：大肠杆菌的DNA提取液；处理3：金黄色葡萄球菌的DNA提取液；处理4：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的DNA混合液，并以副溶血性弧菌和无乳链球菌的DNA混合液作为阳性对照，参照实施例4的方法对上述处理1-4和阳性对照进行双重PCR扩增检测，并将扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图4。本实施例中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来自南京农业大学动物机能生物化学实验室保存的菌株，副溶血性弧菌来自南京农业大学张炜教授惠赠，无乳链球菌来自南京农业大学刘广锦教授惠赠。
由图4可知，处理1含有副溶血性弧菌和无乳链球菌的DNA扩增出了两条清晰的阳性目的条带，而其他处理中的大肠杆菌的DNA和金黄色葡萄球菌的DNA均未扩增出特异性条带，说明本发明的检测方法对检测水产品中的副溶血性弧菌和无乳链球菌特异性良好。
5.2 灵敏度评价
对副溶血性弧菌和无乳链球菌的混合菌液基因组DNA（其中副溶血性弧菌的DNA和无乳链球菌的DNA浓度相同，均为1ng/μL）以10倍稀释梯度依次设置处理1-处理5共五个处理浓度，即10-1、10-2、10-3、10-4和10-5ng/μL，使用实施例3的检测试剂盒，参照实施例4的方法对五个处理同时进行PCR扩增，评估该检测试剂盒及检测方法的灵敏度，结果见图5。
由图5可知，在副溶血性弧菌的DNA浓度为1×10-5ng/μL时，本申请的检测试剂盒和检测方法仍能检测到副溶血性弧菌的目的条带，在无乳链球菌的DNA浓度为1×10-5ng/μL时，本发明的检测试剂盒和检测方法仍能检测到无乳链球菌的目的条带，所以，本发明的检测试剂盒和检测方法对副溶血性弧菌和无乳链球菌的灵敏度可达1×10-5ng/μL，灵敏度良好。
实施例6 以不含副溶血性弧菌、无乳链球菌的生鱼肉样品作为阴性对照样品，以含有副溶血性弧菌、无乳链球菌的生鱼肉样品作为阳性样品，使用实施例3的检测试剂盒，参照实施例4的方法，对阴性对照样品和阳性样品进行检测，结果见图6。
由图6可知，该阳性样品的DNA检测出阳性条带，而阴性对照样品没有检测出阳性条带。说明本发明的检测试剂盒与检测方法对水产品中的副溶血性弧菌和无乳链球菌进行准确检测。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括检测副溶血性弧菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、2×PCR PreMix和RNase-free Water，所述检测副溶血性弧菌的引物对为特异性针对副溶血性弧菌的Tlh基因，所述检测无乳链球菌的引物对为特异性针对无乳链球菌的Sip基因，所述检测副溶血性弧菌的引物对包括检测副溶血性弧菌的上游引物和检测副溶血性弧菌的下游引物，所述检测副溶血性弧菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述检测副溶血性弧菌的下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述检测无乳链球菌的引物对包括检测无乳链球菌的上游引物和无乳链球菌的下游引物，所述检测无乳链球菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述检测无乳链球菌的下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物各0.8μL，所述检测无乳链球菌的上游引物和下游引物各0.4μL。
2.根据权利要求1所述的一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系中其余组分的体积为：模板2μL，2×PCR PreMix 10μL，RNase-freeWater补足20μL。
3.根据权利要求2所述的一种水产品中病原菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L，所述检测无乳链球菌的上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L。
4.权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒在制备检测水产品中病原菌的试剂中的应用，所述病原菌为副溶血性弧菌和无乳链球菌。
5.权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断目的的方法，包括以下步骤：
S1. DNA模板制备：提取待测水产样品的总DNA，以其为模板进行后续双重PCR扩增反应；
S2.配制双重PCR扩增反应体系：取待测样本DNA模板2μL，加入2×PCR PreMix 10μL，10μM检测副溶血性弧菌的上游引物和下游引物各0.8μL，10μM检测无乳链球菌的上游引物和下游引物各0.4μL，最后加入RNase-free Water补足20μL；
S3. 进行双重PCR扩增反应：将上述S2中的混合液离心，进行PCR反应，反应参数为：94℃预变性30s，98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，运行35个循环，72℃充分延伸2min，最后扩增产物4℃保存；
S4. 双重PCR扩增产物检测：PCR反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小，若发现产物中DNA片段出现109bp的特异片段，说明水产样品中含有副溶血性弧菌，若出现269bp的特异片段，说明水产样品中含有无乳链球菌。
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